Kazunori Ando, Eri Shibata, Stefan Hans, Michael Brand, Atsushi Kawakami

东京工业大学 ｜ 德累斯顿再生疗法中心

Developmental Cell, 2017, 43(6): 643–650　doi:10.1016/j.devcel.2017.10.015
原题：Osteoblast Production by Reserved Progenitor Cells in Zebrafish Bone Regeneration and Maintenance
通讯作者：Atsushi Kawakami　|　收稿 2017-06-12，接受 2017-10-06，发表 2017-11-02

导读

把斑马鱼的尾鳍切掉，它会长出一根完好的鳍条——但成骨细胞是从哪来的？主流说法是"已有成骨细胞去分化"。这项研究用细胞谱系追踪找到了另一批细胞：一群蛰伏在鳍条关节里的"成骨前体细胞"（OPCs），平时不动，一受伤就迁移出来干活。

一句话看懂这篇论文

1 作者用 BAC 转座子构建了 mmp9 驱动的 EGFP 与 CreERt2 转基因鱼系，发现鳍条关节里住着一群 mmp9+ 细胞——它们平时不动不分化，却在损伤后 22 小时就迁移到断面。

2 它们是成骨前体细胞（OPCs）：Cre 标记的关节细胞迁移到再生组织后，变成 Sp7+ 成骨细胞、Sp7− 骨衬里细胞，甚至补充回新的 OPCs。

3 OPC 消融实验给出了量化答案：再生组织中至少 40% 的成骨细胞来自关节 OPCs；而 OPCs 本身又由鳍条内的间充质前体细胞持续补充——一个自我更新的双层储备池。

这项研究最漂亮的地方

它把"去分化"和"新生成"这两个对立的假说拆开量化了：去分化的成骨细胞确实参与再生，但它们并非唯一来源；还有一整类被长期忽略的"储备前体细胞"在默默补位。

图形摘要 ｜ 储备的成骨前体细胞如何驱动骨再生。Ando 等鉴定出斑马鱼的成骨前体细胞（OPCs），发现它们来源于胚胎体节，并被保留在成骨组织的 niche 中，同时由间充质前体细胞不断补充。在成年斑马鱼中，OPCs 从 niche 迁出，在骨再生与维持过程中生成成骨细胞。

一、研究背景：一个吵了十年的问题

哺乳动物无法重新形成大段缺损的骨骼，而斑马鱼即使在附肢被切掉之后，仍能高效再生出尺寸与形状都合适的新软骨或新骨。这些新结构来自芽基（blastema）——一团增殖活跃的细胞。弄清楚再生骨骼元素的细胞来源，一直是理解附肢再生机制最重要的目标之一。

在斑马鱼鳍中，鳍条呈放射状排列、分节排列，其表面衬着一层成骨细胞。多项研究用遗传学谱系追踪考察再生成骨细胞的来源，都指向"已有成骨细胞去分化、增殖、迁移"这一条路。

但另一项工作提出了反例：Singh 等（2012）用遗传学消融方法清空了斑马鱼鳍中几乎所有的骨骼成骨细胞，结果这些鳍在 2 周内就恢复了成骨细胞并正常再生——这说明必然还发生了"从头新生"的成骨细胞产生。然而这类细胞的身份、性质、它们对再生的常规贡献，以及它们在非再生骨组织中的作用，都还没被揭示。

本研究给出的答案是：一群表达基质金属蛋白酶 9（mmp9）的细胞在斑马鱼钙化组织的再生与维持中充当成骨前体细胞（osteoblast progenitor cells, OPCs）。

二、研究策略：三把手术刀拆开"成骨细胞从哪来"

研究者用三套转基因品系与三类实验来回答这个问题：

表 1　三套转基因品系与两类实验工具

值得注意的是第一条线索的来源：mmp9 基因在斑马鱼鳍与鳍褶再生过程中高度上调（Yoshinari 等，2009）。研究者据此猜测 mmp9+ 细胞可能与再生有关，于是做了 BAC 转基因鱼系，结果再生前 mmp9+ 细胞就在鳍条关节处有独特分布。

活体延时成像显示：尾鳍被切掉后，EGFP+ 细胞从最近的关节出发，在切除后 22 小时（hpa）抵达断面平面，并在再生组织中成为 mmp9+ 细胞。类似的现象也出现在骨折愈合与鳞片再生过程中。

三、结果一：mmp9+ 细胞住在关节里，一受伤就出发

为确证关节细胞的迁移命运，研究者又构建了 Tg(mmp9:CreERt2) 品系。在不加 TAM 的条件下，胚胎、幼鱼乃至再生的幼鱼鳍褶中几乎看不到 EGFP+ 细胞；成年尾鳍中也只是随时间缓慢出现少量 EGFP+ 细胞，且在再生过程中未检测到新诱导的 EGFP+ 细胞——说明 TAM 非依赖的重组不会干扰谱系追踪结果。

施加 TAM 后，关节细胞在 3 天内变为 EGFP+，模式与 Tg(mmp9:egfp) 一致。洗脱 TAM 至少 2 天后再切鳍做命运分析，被标记的细胞从关节迁出，进入了再生组织的细胞群体——包括再生关节中的细胞。

那它们是什么身份？考虑到有文献提示 mmp9 也在破骨细胞中表达，研究者做了抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色：多数 TRAP+ 细胞与 EGFP+ 细胞并不重叠，说明多数 mmp9+ 细胞并非破骨细胞。

更关键的形态与分子证据：鳍条关节中的 mmp9+ 细胞有特征性的树突状突起，且表达 Zns5（一种有助于识别成骨细胞的、尚未阐明的细胞表面抗原）；但它们不表达 Sp7——Sp7 是一种锌指转录因子，其表达在成骨细胞分化的中期阶段才首次出现。

图 1 ｜ 鳍条关节中的 mmp9+ 细胞迁移到再生组织。（A）通过 Cre-loxP 重组标记 mmp9+ 关节细胞。用 TAM 处理 Tg(mmp9:CreERt2; Olactb:loxP-dsred2-loxP-egfp) 后，关节中的细胞表达 EGFP（箭头）。比例尺 500 μm。（B）再生过程中的 EGFP 标记细胞追踪。被标记的细胞向远端迁移，成为再生组织中的细胞，包括再生关节中的细胞（箭头head）。虚线为切断位置。比例尺 10 μm。（C）Cre 标记品系中穿过关节切片的 Zns5 与 Sp7 抗体染色。表达 mmp9 的关节细胞具有带树突状突起的特征性形态，Zns5 阳性（细胞表面标记）但 Sp7 阴性。在 Tg(sp7:mcherry) 中同样可见 mmp9+ 关节细胞不表达 sp7（Figure 3F）。细胞核用 TO-PRO-3 染色。箭头head 标示 EGFP 与 Zns5 双阳性、Sp7 阴性的代表性细胞。比例尺 10 μm。

还有一项细节很有启发：OPCs 通过一个短暂的"前成骨"状态自我更新。新生的关节细胞最初表达前成骨标志物 Runx2 但不表达 Sp7；随着再生推进，这批细胞先失去 Runx2、变成 Runx2−/Sp7− 的关节细胞，而随后新生的关节细胞又开始表达 Runx2。并且无论最终命运是成骨细胞还是新 OPC，超过 90% 的关节来源细胞在 24–48 hpa 之间掺入了 EdU。

四、结果二：它们确实是成骨前体细胞

与关节中的 mmp9+ 细胞不同，大量迁移到再生组织的 Cre 标记细胞同时变为 Sp7+ 与 Zns5+，说明 mmp9+ 关节细胞确实分化成了成骨细胞。

考虑到 Cre 重组效率不足 100%，研究者据此得出一个保守但有力的下界：再生组织中至少 40% 的成骨细胞来源于 mmp9+ 关节细胞。

OPCs 还产生了另一类细胞：那些位于再生组织中、不直接接触骨表面、形态不规则而扁平的 Sp7− 细胞。根据其定位与缺乏 Sp7 表达的特征，作者认为它们对应于骨衬里细胞（bone lining cells, BLCs）——在之前的小鼠模型研究中被认为仍保有转变为成骨细胞潜能的那类细胞。

图 2 ｜ mmp9+ 细胞是鳍再生中的成骨前体细胞。（A）切除后 2 天（dpa）的 Cre 标记品系鳍纵切片共聚焦图像，用 Sp7、Zns5 与 EGFP 抗体染色。Sp7 蛋白与 Zns5 抗原分别定位于细胞核与细胞表面。相应阳性细胞也经 TO-PRO-3 核染确认（未显示）。许多迁移来的 mmp9+ 关节细胞在再生组织中变为 Sp7+ 或 Zns5+ 细胞。虚线为切断位置。比例尺 20 μm。（B）（A）中方框区域的放大。mmp9+ 关节细胞的后代产生 Sp7+ 成骨细胞（白色箭头head）、Sp7− BLC（红色箭头head）或再生的 OPC（黄色箭头）。比例尺 20 μm。（C）Sp7+ 或 Zns5+ 细胞中关节来源（EGFP+）细胞的定量。细胞在切断平面远端的共聚焦光学切片上计数。n = 20 张光学切片（不同鳍条，共 5 尾鱼）。误差线表示均值 ± SEM。（D）关节来源细胞对再生组织中成骨细胞（OB）、BLC 或 OPC 贡献比例的定量。n = 15 根鳍条（共 5 尾鱼）。误差线表示均值 ± SEM。细胞计数在共聚焦 z 栈图像上进行，以确认单个细胞中相应的抗体染色。OPCs 与 BLCs 均为 Sp7−，二者通过细胞形态与组织定位区分：OPCs 沿近端-远端轴呈细长形、位于鳍条关节；BLCs 呈扁平不规则形、非关节分布。（E）4 dpa 的再生中 Cre 标记品系鳍共聚焦图像，该鱼同时携带 sp7:mcherry 转基因。虚线标示右侧所示光学切片的平面。箭头，生长中的骨基质；红色箭头head，BLC；白色箭头head，OB。比例尺 10 μm。

五、结果三：消掉它们，骨头就长不好

为了评估 OPCs 对骨再生的重要性，研究者用第三套品系做消融实验。nfsB 基因编码细菌硝基还原酶，只有加入甲硝唑（Mtz）时才会杀死表达 nfsB 的细胞。

结果很直接：加入 Mtz 后，包括骨髓系细胞在内的所有 mmp9+ 细胞在 48 小时内被清除；随后钙化鳍条组织的再生显著减少，再生组织中 Sp7+ 与 Zns5+ 细胞数量也显著下降。

但有一个重要对照：整体的组织再生与生长并未受影响，再生诱导基因（表皮中的纤连蛋白 fn1b、芽基中的 msxc）表达也未受影响。这说明 OPC 消融特异性地削弱了骨再生，而非简单地让整个再生程序停摆。

这个结果也解释了 Singh 等（2012）的观察：那些被清空了已有成骨细胞（那些能去分化的成骨细胞）的鳍，之所以仍能正常再生出新鳍条结构，正是因为还有 OPCs 这条"全新生成"的补充途径。

图 3 ｜ 由间充质前体补充的 OPCs 是骨再生的重要贡献者。（A）OPC 消融的代表性示例。以 5 mM Mtz 处理 2 天可实现 OPCs 的有效消融。比例尺，左图 500 μm，右图 50 μm。（B）经 Mtz 处理的野生型与表达 nfsB 的转基因品系鳍中再生组织的茜素红 S 染色。虚线标示鳍切断位置。比例尺 500 μm。（C）（B）中钙化面积的定量。OPC 消融时钙化组织显著减少。误差线表示均值 ± SEM。*p < 0.01，Student 双尾 t 检验；n = 5 根鳍条。N.S.，无显著差异。（D）野生型与 OPC 消融转基因品系再生组织中 Zns5 与 Sp7 的检测。虚线标示鳍切断位置。细胞核用 DAPI 复染。比例尺 10 μm。（E）（D）的定量。OPC 消融使 Zns5+ 与 Sp7+ 细胞数量分别显著下降。误差线表示均值 ± SEM。**p < 0.001，Student 双尾 t 检验；n = 6 张来自不同鳍条的共聚焦光学切片（共 5 尾鱼）。（F）OPC 从非成骨细胞前体补充。在双转基因品系 Tg(sp7:mcherry; mmp9:egfp-nfsB) 中，消融后重新形成的 OPCs（箭头head）并非 mCherry+（n = 15 个关节，共 5 尾鱼），说明重新形成的 OPCs 并非来源于 mCherry+ 成骨细胞。箭头指向邻近的成骨细胞。细胞核，DAPI。比例尺 10 μm。（G）间充质细胞移植与宿主 OPC 消融的流程。Olactb:dsRed2 指 Olactb:loxP-dsred2-loxP-egfp。供体芽基被移植到宿主芽基区域（Shibata 等，2016）。大多数移植细胞贡献为间充质细胞。移植 8 天后，用 5 mM Mtz 消融宿主 OPCs，以检验重新形成的关节细胞（EGFP+）是否来源于 DsRed2+ 间充质细胞。（H）OPCs 由间充质细胞产生。箭头head 标示来源于 DsRed2+ 间充质的重新形成的 OPCs。n = 24 个鳍条关节，共 5 尾鱼。比例尺 10 μm。

六、结果四：补充来源是间充质细胞，不是老成骨细胞

一个意外发现：撤除 Mtz 后 4 天内，关节处的 OPCs 就重新形成了。这提示 OPCs 由 mmp9− 前体细胞补充。

第一个假设是"由成骨细胞去分化而来"。研究者用双转基因品系 Tg(sp7:mcherry; mmp9:egfp-nfsB) 检验：若重新形成的 OPCs 来自 mCherry+ 成骨细胞，就该同时是 EGFP+ 与 mCherry+。结果只检测到 EGFP+/mCherry− 的 OPCs（15 个关节全部如此），说明成骨细胞并没有去分化形成 OPCs。

第二个假设是"由鳍条关节周围的 mmp9− 间充质细胞补充"。研究者做芽基移植：把普遍表达 DsRed2 的双转基因品系供体芽基移入宿主 Tg(mmp9:egfp-nfsB)。已知超过 95% 的移植芽基细胞会变成鳍条间充质细胞而非成骨细胞；若这些供体间充质细胞能变成 OPCs，它们就应是 DsRed2+/EGFP+。

在 Mtz 持续存在下消融宿主 OPCs 后，宿主关节中出现了来源于 DsRed2+ 间充质细胞的 OPCs。这直接证明：OPCs 可以由鳍条内存在的间充质前体细胞补充。

双层储备池模型

至此，一个双层储备池的模型就完整了：

第一层（快速动员）：关节里蛰伏的 OPCs。损伤时立刻迁移到断面、分化成成骨细胞。

第二层（持续补给）：鳍条间充质前体细胞。慢慢把 OPCs 重新填满，让这个储备池永远处于待命状态。

作者认为，这样层层设防的前体细胞池，正是强化并保证骨骼再生稳健性的重要调控机制。

七、结果五：OPCs 来自胚胎体节

接下来要回答的是"这些 OPCs 最初从哪来"。研究者在鳍生长早期做了谱系追踪：当 25 dpf 形成 2–3 排 OPCs 时用 Cre-loxP 标记它们，23 天后，早期形成的 OPCs 的后代既没有贡献给后来形成的关节，也没有贡献给远端鳍区的成骨细胞。这说明新 OPCs 不是由既有 OPCs 产生的，而是发育与生长过程中由其他 mmp9− 细胞产生的。

为追溯胚胎起源，研究者采用了体节移植——这是追踪体节来源细胞、且几乎无非体节细胞污染的经典方法。此前在 medaka 中的研究已显示，鳍成骨细胞与鳞片矿化细胞都来源于体节，于是作者假设 OPCs 也来自体节。

把普遍表达 DsRed2 的胚胎体节移植入野生型宿主后，体节来源细胞确实产生了鳍条与鳞片中的成骨细胞；更重要的是，它们同样可重复地分化成鳍条关节中的 EGFP+ OPCs 与鳞片中的 OPCs（5 次成功移植全部如此）。

这意味着：OPCs 与胚胎成骨细胞同源，都来自体节。

OPCs 也参与日常的骨维护

研究者还考察了 OPCs 在非再生组织中的作用。在 20–28 dpf 鳍快速生长期间做 OPC 消融，或在 3 月龄起的 40 天里反复消融，钙化骨形成与成骨细胞数量都没有显著变化。

但长期谱系追踪给出了答案：在 4 月龄时标记 OPCs 并追踪 114 天，被标记细胞的后代逐渐分布到整个鳍条上，由 Sp7+ 成骨细胞与 Sp7− BLC 组成。对照实验中，未施加 TAM 的双转基因品系鳍条里完全没有 EGFP+ 成骨细胞或 BLC。

结论是：OPCs 确实为成年斑马鱼鳍条骨提供成骨细胞与 BLC。至于消融实验为何没看出影响，作者的解释是：mmp9+ OPCs 与 mmp9− 前体细胞可能都向稳态下的新成骨细胞供给，而前体细胞在 OPCs 缺席时就足以维持正常稳态。

图 4 ｜ OPCs 的起源、发育及其在成骨细胞维持中的作用。（A）25 dpf 标记的早期 OPCs 追踪。Cre 标记 OPCs 的后代既未贡献给新增加的 OPCs，也未贡献给远端区域的成骨细胞（n = 9 尾鱼，共 9 尾全部如此），提示 OPCs 由非 OPC 前体细胞产生。数字标示鳍条关节。比例尺 100 μm。（B）体节移植示意图。普遍表达 DsRed2 的体节取自双转基因品系 Tg(mmp9:egfp; Olactb:loxP-dsred2-loxP-egfp)，移植入野生型。（C）体节来源细胞分化为鳍条关节中的 OPCs。上图：整鳍的整体视图；下图：穿过鳍条关节的切片。与此前 medaka 的研究一致（Shimada 等，2013），体节来源细胞（DsRed2+）贡献为鳍条中的间充质细胞与成骨细胞。关键在于，体节来源细胞还分化为鳍条关节中的 EGFP+ 关节 OPCs（5 次成功移植中 5 次全部如此），强烈提示 OPCs 来源于体节。箭头，OPCs；箭头head，移植体节来源的成骨细胞或 BLC。细胞核，DAPI。比例尺，上图 100 μm，下图 10 μm。（D）Cre-loxP 重组后 4 天与 114 天的 EGFP+ 细胞荧光体视显微镜图像。4 月龄时通过 Cre 重组标记关节 OPCs（箭头head）。被标记的 OPCs 逐渐分化为鳍条表面的细胞。比例尺 100 μm。（E）携带 sp7:mcherry 转基因的成年鱼中，Cre 标记关节 OPCs 后代的共聚焦 z 栈图像。未损伤成年鳍中 OPCs 的后代同时包含 mCherry+（sp7 表达）成骨细胞（白色箭头head）与 mCherry− BLC（红色箭头head），分布于非关节区。比例尺 10 μm。（F）非再生鳍条中 OPC 来源成骨细胞（OB）与 BLC 比例。在每尾鱼中央鳍区的一根鳍条节段中计数细胞。误差线表示均值 ± SEM（n = 5 尾鱼）。

八、讨论：一场关于"细胞储备"的范式转移

脊椎动物发育中成骨细胞来自体节生骨节与神经嵴细胞，这一点早已明确；但在哺乳动物出生后阶段，人们普遍假定骨骨髓中的间充质干细胞及其定向前体细胞（OPCs）是成骨细胞的来源。然而哺乳动物 OPC 的身份及其与胚胎起源的关联，至今并不清楚。

本研究的发现揭示了 OPCs 的身份，并厘清了成年阶段的成骨细胞同样来自体节——与胚胎成骨细胞同源。

作者也提出一个开放问题：Mmp9 是一种能降解软骨基质的分泌型金属蛋白酶，已知能促进基质重塑与骨基质沉积。那么"Mmp9 标记骨前体细胞"这一发现是否意味着Mmp9 在这些前体细胞中还有细胞外基质重塑之外的功能？或者反过来，细胞外基质重塑对 OPC 的功能本身是必需的？

最后一个转化方向的思考很直接：考虑到斑马鱼更强的骨再生潜力，OPCs 将是提升哺乳动物骨再生的潜在靶点。

放在大背景下的意义

它提供了一种新的思维范式：组织再生不一定要靠"已分化的功能细胞去分化"，也可以靠"预留一支随时可用的前体细胞队伍"。这种储备策略让组织在急性损伤后能立即响应，同时又留有源头活水持续补充。

九、结论与意义

OPCs 是一支被"预留"起来的成骨细胞来源。它们以 mmp9+ 为标志，蛰伏在鳍条关节的 niche 中，既不同于分化的成骨细胞（Sp7+），也不同于破骨细胞（TRAP−）。

它们是再生与维持的双重来源。再生时，关节 OPCs 迁移至断面并分化成成骨细胞（占再生组织成骨细胞的至少 40%）与骨衬里细胞；在无损伤的稳态下，它们同样持续向鳍条骨补充成骨细胞与 BLC。

它们自成体系：来源于胚胎体节，由间充质前体持续补充。

这一"储备 + 补给"的双层结构，为理解组织再生如何兼顾"快速响应"与"长期稳健"提供了一个新范例，也把斑马鱼骨再生与哺乳动物骨修复研究连了起来。

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