Sung-Tzu Liang, Jung-Ren Chen, Jhih-Jie Tsai 等

台湾中原大学等

International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(15): 3613　doi:10.3390/ijms20153613
原题：Overexpression of Notch Signaling Induces Hyperosteogeny in Zebrafish
通讯作者：Yu-Heng Lai, Chung-Der Hsiao　|　收稿 2019-05-11，接受 2019-07-18，发表 2019-07-24

导读

Notch 通路在成骨中的作用一直吵得不可开交：细胞实验说它抑制分化，小鼠模型说它促进骨量。这项研究用斑马鱼把话说清楚了——关键不在于 Notch 做什么，而在于它是在间充质干细胞里、还是在成骨细胞里开。

一句话看懂这篇论文

1 作者用 Tol2 转座子构建了 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因斑马鱼，在成骨细胞里特异性过表达 Notch1a 胞内结构域。

2 结果是典型的高骨化（hyperosteogeny）：骨密度升高、椎骨增厚、神经管与血管管显著变窄，成鱼头骨变形、体长变短。

3 最关键的机制结论：高骨化源于成骨细胞"活性"（ALP 活性）升高，而不是成骨细胞数量增加，也不是破骨细胞受抑制。

这项工作最聪明的地方

把变量控制住了：它用 sp7 启动子把 N1aICD 精确限制在成骨细胞里，从而回答了此前被混在一起的两个问题——"Notch 通路本身做什么"与"Notch 在哪种细胞里做"。

一、研究背景：一个吵了几十年的通路

Notch 信号是骨骼发育过程中最保守的信号级联之一。它的激活方式是：当跨膜配体（Serrate/Jagged1 与 2、Delta Like 1/3/4、contactin/F3/NB-3）与相邻细胞上的 Notch 1–4 受体相遇时，通过细胞间接触启动一连串蛋白水解切割——先是 ADAM 金属蛋白酶水解释放胞外结构域，随后 γ-分泌酶切割，使Notch 胞内结构域（NICD）从膜上释放并转位入核。

入核的 NICD 与 CSL 家族 DNA 结合蛋白（人类为 CBF1、果蝇为 Su(H)、线虫为 LAG1、小鼠中又称 RBP-Jκ）及多个共激活因子（Mastermind/Lag-3、MAML）形成复合物，激活下游靶基因。

成骨的两个过程

骨形成涉及两个过程：成骨细胞的分化与破骨细胞的抑制。

• 成骨过程中：间充质干细胞（MSCs）被诱导分化为成骨细胞，后者合成胶原、骨钙素、骨桥蛋白等有机基质，并分泌羟基磷灰石沉积到基质中，形成矿化基质。

• 破骨过程中：Notch 信号对破骨细胞生成既有促进作用也有抑制作用。

过去十年的体内研究给出了矛盾的结果。活跃的 Notch 信号通过持续激活 TNF 通路，把 MSCs 维持在活跃增殖状态，不断促使 NICD 转位到 Hes1 启动子上，从而在类风湿关节炎小鼠模型中抑制成骨细胞分化与骨形成。而在 NICD 过表达转基因小鼠中，也观察到未成熟且功能失常的成骨细胞，伴随骨量诱导延迟与生长迟缓。

另有研究提示，NICD 在不同发育阶段的激活可能通过两种机制阻止成骨细胞分化：要么是成骨细胞形成了却无法成熟，要么是成骨细胞发育在早期即被阻断，导致成熟成骨细胞数量减少。

破骨方面同样复杂：Notch 1 与 Notch 3 的缺失会降低骨保护素/RANKL 表达比值并诱导破骨细胞增殖，说明 Notch 抑制破骨细胞生成、进而抑制骨重塑；但 Notch 2 却被报道为破骨细胞生成的促进者，通过调控破骨细胞分化期核因子 NFAT-c1 的启动子起效。

结论是：Notch 通路在骨骼发育中不可或缺，但不同实验条件下得出的结果彼此冲突。斑马鱼是研究脊椎动物发育与疾病的经典模型，于是这项研究决定用斑马鱼来厘清 Notch 在骨发育中的角色。

二、研究策略：在成骨细胞里"拧大" Notch

研究者构建了两条转基因品系，用 Tol2 gateway 转座子系统：

表 1　转基因品系的构建与筛选

sp7 编码一个含锌指结构的转录因子，在成骨细胞中表达，因此可以作为成骨细胞的标志物；麦达鱼的 sp7 启动子也已被广泛用于构建转基因模型。

分子验证方面，PCR 与 Sanger 测序确认了转基因的稳定整合（P3 分别与 P1、P2 配对，预期片段 3.4 kb 与 2.1 kb）。功能验证上，3 dpf 胚胎的 RT-qPCR 显示，Notch 下游靶基因 hey2 与 heyl 显著上调（p < 0.001 与 p < 0.05），而 hey1 无差异——提示 hey1 在斑马鱼中可能不响应 N1aICD 过表达。

图 1 ｜ 转基因品系 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的建立。（A）载体（pDestTol2CG2-Ola.Sp7-N1aICD-pA）的示意图，其中 notch1a 胞内结构域（N1aICD）由麦达鱼成骨细胞特异性启动子 Sp7 驱动，并与由 cmlc2（心脏特异性启动子）驱动的 EGFP 相连。（B）基因分型确认不同创始鱼的转基因率。创始鱼 7（P7）生殖系传递率最高，用于产生 F1 后代（以红色标示）。（C）琼脂糖凝胶电泳验证 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因品系中 N1aICD 的构建。以尾鳍基因组 DNA 为模板，PCR 产物预期大小为 3.4 kb 或 2.1 kb（引物 P3 分别与 P1 或 P2 配对）。（D）实时 RT-PCR 显示 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼中 hey2 与 heyl 表达显著上调。（平均值 ± SD；* p < 0.05；** p < 0.001；*** p < 0.005；n = 10）。

三、结果一：胚胎期的脊柱提前钙化

研究者先用钙黄绿素（calcein）染色评估 6–7 dpf 胚胎的钙化水平，发现 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)^cy31 中已钙化的椎柱数量显著多于野生型。定量分析（测量环椎（ring centrum）形成面积）同样确认了这一差异。

随后在 21 dpf 用双转基因鱼（Tg(Ola.Sp7:EGFP)^cy25 与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)^cy31）做双标：EGFP 阳性的成骨细胞呈绿色，茜素红-考马斯亮蓝（ALC）标记的脊索钙化区呈红色。合并图像显示双转基因鱼的脊索钙化程度远高于对照，鳃盖（opercula）的钙化程度也显著升高。

结论很直接：N1aICD 过表达导致胚胎早期骨钙化增加。

图 2 ｜ N1aICD 过表达转基因斑马鱼的钙化水平评估。（A–D）7 dpf 野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 胚胎的钙黄绿素染色；* 标示形成的椎柱。（E）通过计算脊索中环椎形成面积对钙化程度进行定量；N 表示用于分析的鱼数。（F, G, H）21 dpf Tg(Ola.Sp7:EGFP)cy25 转基因鱼脊索中 EGFP 表达的成骨细胞（绿色）、ALC 染色区与合并图像。（I, J, K）21 dpf Tg(Ola.Sp7:EGFP)cy25 与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 双转基因鱼脊索中 N1aICD 表达的成骨细胞（绿色）、ALC 染色区与合并图像；虚线圈出的区域经图像定量后求和比较。（L, M, N）13 dpf Tg(Ola.Sp7:EGFP)cy25 鳃盖中 EGFP 表达的成骨细胞（绿色）、ALC 染色区与合并图像。（O, P, Q）13 dpf Tg(Ola.Sp7:EGFP)cy25 与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 双转基因鱼鳃盖中 N1aICD 表达的成骨细胞（绿色）、ALC 染色区与合并图像。（平均值 ± SD；* p < 0.05；*** p < 0.005；n = 鱼数）。

四、结果二：成鱼的头骨被压塌了

由于 N1aICD 在成骨细胞中的过表达对斑马鱼胚胎并不致死，研究者得以评估发育后期乃至成年期的骨发育。

• 体长：Tg(Ola.Sp7:N1aICD)^cy31 的体长在雌雄两性中都明显短于野生型。

• 体重：仅雌鱼体重减轻。

• 头骨：形态测量分析发现显著的头骨变形，PCA 主成分分析显示野生型与转基因鱼的头骨形态学数据差异显著，转基因鱼的头骨外观呈"塌陷"状。

Alcian blue/Alizarin red 双染的结果与形态测量一致：转基因鱼的头骨更窄更小；胸鳍与腹鳍末端发生弯曲而非平滑；韦伯氏装置的骨更粗；脊柱中的神经弓与血弓长出异常的突起，且弓的末端呈分叉状。

图 3A ｜ 野生型与转基因成鱼的形态学比较。野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 成年鱼之间的形态学比较。（A）6 月龄野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31（cy31）转基因鱼雌雄两性的外观。（B, C）雄／雌体长（B）与体重（C）的统计分析与比较。（D–G）野生型与 cy31 转基因鱼头部的形态测量分析。（H）野生型与 cy31 转基因鱼雌雄两性的主成分分析（PCA）。显著性用 Student t 检验检测，数据以平均值 ± SD 表示（* p < 0.05；** p < 0.01；n = 鱼数）。

图 3B ｜ 头部形态测量与 PCA。（D–G）野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的头部形态测量轮廓，蓝线代表转基因鱼、黑线代表野生型；（H）PCA 散点图显示两组在主成分上显著分离。

图 3C ｜ 主成分分析。（H）野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼的头骨形态测量数据主成分分析（PCA）结果，显示两组之间存在显著差异。

图 4 ｜ 骨骼双染：头骨、鳍、韦伯氏装置与椎骨。野生型鱼（A–I）与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼（J–R）不同骨骼区域的 Alcian blue/Alizarin red 双染。上颌骨形态取自侧位（A, J）与背位（B, K）；胸鳍（C, L）；腹鳍（D, M）；韦伯氏装置（E, N）；椎骨（F, O）；以及取自侧位（H, Q）与前位（I, R）的放大神经弓与血弓。蓝色箭头标示异常长出的突起（ct—椎体，na—神经弓，ha—血弓，nc—神经管，hc—血管管）。

图 4 续 ｜ 神经弓与血弓的放大对照。（H, I）野生型与（Q, R）Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的神经弓与血弓（侧位与前位放大）。转基因鱼的神经弓与血弓更粗、末端呈分叉状，并可见异常长出的突起（蓝色箭头）；神经管与血管管腔明显变窄。

五、结果三：椎管变窄，而不是骨头变多

为了量化神经管与血管管的尺寸变化，研究者把脊柱从尾到头切成 16 个断面，分别测量每一断面的神经管与血管管面积，并与野生型平行比较。

结果显示：由于骨畸形，每一个断面中神经管与血管管的内腔都显著缩小；16 个断面面积的总和定量分析也得出同样结论。

本文最具特色的表型

不是骨头变多，而是骨头的"内腔"被挤掉了。神经弓与血弓增厚，直接导致容纳脊髓与血管的管道狭窄。换句话说，N1aICD 过表达造成的是一种"过度骨化"而非"骨骼增殖"——骨量增加了，但髓腔被压扁了。

从演化与医学角度看，这个表型与哺乳动物中骨硬化症（osteosclerosis）的病理特征——骨量异常增厚、骨髓腔被压缩——有直接的形态学对应关系。

图 5A ｜ 16 个脊柱断面的神经管／血管管形态。Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 中 Notch 过表达导致神经管／血管管变窄。（A）野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼脊柱骨 16 个断面的形态（从左到右代表从前到后的位置）。（B, D）野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼脊柱骨各断面神经管／血管管腔尺寸的计算。（C, E）16 个断面神经管／血管管尺寸的总和。显著性用 Student t 检验检测，数据以平均值 ± SD 表示（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.005；n = 鱼数）。

图 5B ｜ 神经管与血管管面积定量。（B, D）逐断面的神经管与血管管腔面积定量，转基因鱼各断面均显著减小；（C, E）16 个断面面积求和后的总定量，差异同样显著。

六、结果四：不是成骨细胞变多了

接下来是全文最关键的问题：高骨化到底是怎么来的？是成骨细胞变多了，还是成骨细胞更活跃了？

研究者利用鱼鳞作为监测模型——因为鱼鳞上同时存在成骨细胞与破骨细胞，便于在同一组织中同时观察两者的活性。

• 成骨细胞数量：把报告品系 Tg(Ola.Sp7:HA2FZmcherry)^cy40 与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)^cy31 杂交，计数鳞片上红色荧光标记的细胞核——两组的成骨细胞数量没有差异。磷酸化组蛋白 H3 免疫染色（测有丝分裂活性）与脊柱切片 H&E 染色的细胞核计数同样没有显著差异。

• 成骨细胞活性：碱性磷酸酶（ALP）染色显示，Tg(Ola.Sp7:N1aICD)^cy31 鳞片上的 ALP 活性显著高于野生型；鳞片裂解液在 405 nm 下的相对 ALP 活性定量也确认了这一点。

• 破骨细胞活性：用 ELISA 检测组织蛋白酶 K（cathepsin K）与抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）蛋白，在 5 dpf 与 35 dpf 两个阶段，转基因鱼与野生型表达水平都相似。

mRNA 层面同样印证：受检的多个成骨相关标志基因中，只有 alp 显著上调，而 runx2a、runx2b、sp7、col1a1a、col1a1b 均无差异；破骨标志基因 rank、acp5b、ctsk 也无显著差异。

此外还有两个与骨重塑相关的基因值得注意：opn（骨桥蛋白）与 phex（磷酸调节中性内肽酶）显著下调。

机制结论

N1aICD 过表达造成的高骨化，主要源于成骨细胞活性升高，而不是成骨细胞增殖增加，也不是破骨细胞活性受抑制。

ALP 是骨基质成熟与矿化阶段表达最高的骨特异性标志物，其活性升高提示成骨细胞被激活并向骨细胞方向分化、继而被矿化。而 opn（磷酸化后抑制成骨细胞矿化）与 phex（通过 ASARM 酸性丝氨酸-天冬氨酸富集基序结合 Opn）的下调，则从另一个方向支持了骨化进程的推进。

运动行为方面，研究者把 5–6 尾鱼放入水槽，用视频记录三维集群运动并分析运动轨迹。结果没有观察到焦虑样游泳模式（焦虑鱼表现为速度加快、贴底）；但角速度显著增加，提示增高的骨密度可能增强了身体转动能力；蜿蜒度（meandering）增加，说明高骨化并未给鱼带来不适。

图 6 ｜ μCT 骨密度与三维运动行为分析。野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 鱼雌雄两性的计算机断层扫描。（A, B）雌性 WT、雌性 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31、雄性 WT 与雄性 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的三维断层扫描图像，以及野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的脊柱骨三维断层扫描；蓝色 * 标示突起发生的区域（n = 鱼数）。（C）野生型与 N1aICD 过表达转基因鱼雌雄两性的骨密度。（D–I）野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 转基因鱼三维运动游泳模式的比较，基于平均速度（D）、静止时间比例（E）、快速运动时间比例（F）、顶层停留时间（G）、平均角速度（H）与蜿蜒度（I）等指标。显著性用 Student t 检验检测，数据以平均值 ± SD 表示（*** p < 0.005，**** p < 0.001）。黑圆点与红色方块分别代表野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 的数据。

图 7A ｜ 成骨细胞数量无变化，但 ALP 活性升高。Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 鱼中成骨细胞与破骨细胞活性的检测。借助 Tg(Ola.Sp7:HA2FZmcherry)cy40 核标记的红色荧光信号，定量野生型（A）与 N1aICD 过表达的 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31（B）鱼鳞片上的成骨细胞数量。成骨细胞数量的定量与统计比较汇总于（C）。用 Phospho-Histone H3（pH3）免疫染色测量有丝分裂活性，分别为野生型（D）与 N1aICD 过表达的 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31（E）鱼鳞片；pH3 阳性细胞数的定量与统计比较汇总于（F）。野生型（G）与 N1aICD 过表达的 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31（H）脊柱骨切片的 H&E 染色与细胞核定量；细胞核数的定量与统计比较汇总于（I）。所有数量由每片鳞或每张骨切片的三个区域取平均值得出。

图 7B ｜ ALP 活性升高，但破骨细胞标志物无差异。野生型（J）与 N1aICD 过表达的 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31（K）鱼鳞片的碱性磷酸酶（ALP）染色；鱼鳞 ALP 阳性染色面积的统计分析（L）。鱼鳞裂解液中 405 nm 下测定的相对 ALP 活性定量比较。组织蛋白酶 K（M, O）与 TRAP（N, P）蛋白表达水平的定量，分别为 5 dpf（M, N）或 35 dpf（O, P）的野生型与 N1aICD 过表达鱼。显著性用 Student t 检验检测，数据以平均值 ± SD 表示（*** p < 0.005；n = 鱼数）。

图 8 ｜ 骨相关下游基因的表达谱。野生型与 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 鱼中成骨细胞下游靶基因与破骨细胞相关基因的相对表达水平。从鱼鳍提取总 RNA，检测的标志基因包括与成骨细胞活性相关的 runx2a、runx2b、sp7、col1a1a、col1a1b、alp、opn 与 phex（A）；以及与破骨细胞活性相关的 rank、acp5b 与 ctsk（B）。显著性用 Student t 检验检测，数据以平均值 ± SD 表示（* p < 0.05；n = 10）。

图 9 ｜ 机制示意图：Notch 激活如何导致高骨化。Notch 激活对成骨细胞影响的示意图。Notch 表达增加导致成骨细胞被激活，这些细胞可能分化为嵌入矿化基质中的骨细胞，从而提高骨密度。相反，在 Tg(Ola.Sp7:N1aICD)cy31 中，骨细胞数量与破骨细胞活性并未出现显著改变。

七、讨论：把矛盾的数据拼成一块

Notch 信号是调控器官发生与发育的进化保守机制。人与小鼠的遗传学研究已发现，Notch 通路上的大量突变可导致骨骼缺陷。然而，无论细胞培养还是小鼠模型，关于 Notch 在骨稳态中作用的研究都给出了矛盾结果——既有促进也有抑制成骨的报道。

矛盾的来源在讨论中被梳理得很清楚。Notch 一般被认为通过 Runx2 与 Hey1 参与 BMP-Smad1 通路；在成骨细胞分化的早期阶段，Notch-Rbpj 信号的抑制作用可解释骨硬化表型——在成骨细胞中条件性 Cre 激活 NICD 会造成大规模骨硬化伴生长迟缓与椎骨异常，而选择性敲除 Notch 核效应因子 Rbpj 可完全抑制该表型。Notch RBP-Jκ 信号部分通过 Hey1 介导的对 NFATc1 的抑制来抑制成骨分化。

而本研究的结果是：在成骨细胞中过表达 N1aICD 反而通过促进成骨细胞分化并显著升高 ALP 活性而诱发高骨化。换言之，斑马鱼模型支持"Notch 在骨中过表达可以促进成骨程序"这一观点。

作者给出了一个关键的调和思路：Notch 在间充质干细胞与在成骨细胞中的作用方向本就不同。在 MSCs 层面，Notch 维持其未分化与增殖状态、抑制其向成骨细胞分化；而在已经定向的成骨细胞层面，Notch 的激活反而推动其成熟与矿化。此前"Notch 抑制成骨"的结论多来自未分化的间充质干细胞体系或整体敲除模型，而本文把变量精确锁定在成骨细胞内。

作者也诚实指出了一个本研究的局限：Notch 通路对骨发育的作用具有性别特异性——雌鱼体重减轻且骨密度升高，雄鱼则无此差异。他们推测不同性激素可能调控成骨细胞中 Notch 信号的活性，但识别这一性别差异的具体因子已超出本研究范围。

关于运动行为的差异，作者也做了对比：斑马鱼肌腱骨化模型中速度降低是因为骨化肌腱导致身体僵硬，而本文的 N1aICD 转基因鱼是骨密度升高强化了身体骨架，机制并不相同。

临床转化思路

从临床角度看，作者提出的转化思路值得注意：骨硬化症目前几乎没有有效药物，而这篇论文建立的斑马鱼高骨化模型，可以直接用于筛选治疗骨硬化症的候选药物。

八、结论与意义

Notch 在骨发育中的角色，取决于它在哪种细胞里被激活。这项研究首次用成骨细胞特异性过表达 N1aICD 的斑马鱼模型，把此前互相矛盾的结果整合进一个自洽的图景。

高骨化的本质是"活性升高"而非"数量增加"。成骨细胞数量不变、破骨细胞活性不变，但 ALP 活性显著升高、opn 与 phex 下调——成骨细胞被推向了骨细胞分化与矿化的方向。

形态学后果是"内腔消失"而非"骨骼增殖"。神经弓与血弓增厚把神经管与血管管挤窄，这与哺乳动物骨硬化症中骨髓腔被压缩的病理特征直接对应。这条品系也因此成为筛选骨硬化症治疗药物的现成平台。

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