Avni V. Gandhi, Eric A. Mosser, Grigorios Oikonomou, David A. Prober

美国加州理工学院

Neuron, 2015, 85(6): 1193–1199　doi:10.1016/j.neuron.2015.02.016
原题：Melatonin Is Required for the Circadian Regulation of Sleep
收稿 2014-04-14，接受 2015-01-27，发表 2015-03-05

导读

褪黑素被卖了三十年"助眠药"，但它到底在身体里做什么，一直没人说清。这项研究第一次在昼行性动物中敲掉内源性褪黑素的合成酶，得到一个干脆的答案：没有褪黑素，夜里几乎睡不成；但褪黑素对生物钟本身反而可有可无。

一句话看懂这篇论文

1 作者用 TALEN 与 CRISPR/Cas9 敲除斑马鱼的 aanat2（褪黑素合成必需酶），造出了第一个昼行性脊椎动物的内源性褪黑素失功能模型。

2 表型极其剧烈：夜间睡眠时间减少近一半，活动量增至三倍，入睡潜伏期延长到两倍——而白天完全正常。

3 两个关键结论：褪黑素是生物钟调控睡眠所必需的，但它自己并不是生物钟的一部分；而且它可能通过促进腺苷信号来诱导睡眠，由此把"稳态"与"节律"两个过程连了起来。

这项工作排除了哪些替代解释

这项工作最漂亮的地方在于它排除了一系列"看起来很合理"的替代解释：褪黑素是不是通过推动生物钟相位来起作用？是不是因为提高了觉醒阈值所以睡得浅？是不是血清素升高的副作用？作者对每一个都做了针对性实验，答案都是否定的。

一、研究背景：睡眠的"双过程模型"缺了一半

睡眠是一个进化上高度保守的行为状态，但其调控机制仍不甚明了。一个经典模型（Borbély 的双过程模型）认为睡眠受两个过程共同调控：

• 稳态过程 S（Process S）：响应机体内部的"睡眠需求"信号，随清醒时间延长而累积睡眠压力。

• 节律过程 C（Process C）：响应外界的光暗等授时信号，决定在一天中的什么时段应当睡觉。

稳态机制的分子基础已有不少线索：细胞外腺苷在特定脑区的累积被证明起重要作用，但显然还需要其他因子配合。相比之下，生物钟本身的机制已被研究得相当透彻，但"把节律信息传递出去、从而调控睡眠"的分子却一直是个谜。

褪黑素本是理想的候选：生物钟调控它的产生，它在某些情境下能诱导睡眠。然而，几十年的研究之后，褪黑素在睡眠调控中的角色依然充满争议。

争议的来源很实际：外源性褪黑素在昼行性动物（包括人类）、非人灵长类、家猫、鸟类和斑马鱼中都被报道有促眠效应；但也有研究没能重复出这一结果。更麻烦的是，内源性褪黑素的作用在任何动物中都还是未知数——因为外源性给药无法回答这个问题。

还有两个技术性障碍：褪黑素在昼行性与夜行性动物中都是夜间分泌，而大多数实验室小鼠品系几乎不产生褪黑素。于是乎这一领域只能依赖药理学实验，结果彼此矛盾。

研究者因此转向斑马鱼——一种昼行性动物，其生物钟与睡眠调控机制与哺乳动物高度保守，而且有成熟的视频追踪行为学平台。

二、研究策略：三条独立的攻路

研究用了三条互相独立的路径来验证同一件事：

表 1　三条独立验证路径与读出方式

表 2　关键表型量化结果

三、结果一：敲掉合成酶，夜里睡意大减

斑马鱼的褪黑素在夜间由松果体产生，受生物钟控制——这与哺乳动物一致。研究者用 CRISPR/Cas9 造出 aanat2 预测失功能突变，aanat2 编码芳烷基胺 N-乙酰转移酶 2，是松果体合成褪黑素所必需的酶。

验证结果：野生型幼鱼在 14:10 小时周期的光暗条件下夜间褪黑素水平高、白天低；aanat2 纯合突变体几乎不产生褪黑素。

接下来用视频追踪比较 aanat2−/−、aanat2+/− 与野生型同胞的睡眠—觉醒行为。结果非常干净：

• 白天：三个基因型的睡眠时长与活动量基本相同。

• 夜间：aanat2−/− 幼鱼的睡眠量几乎减半，活动量增至对照的三倍。

• 夜间睡眠减少主要来自睡眠片段变短、相应地清醒片段变长，而睡眠片段的次数基本不变。

• 夜间入睡潜伏期（熄灯到入睡的时间）明显延长。

这直接证明：内源性褪黑素在昼行性脊椎动物中促进夜间睡眠的启动与维持。

一个必须排除的替代解释是：aanat2 缺失会不会只是因为血清素升高？（5-羟色胺经 AANAT 乙酰化为乙酰血清素，再甲基化为褪黑素，所以阻断 AANAT 确实会堆积血清素。）果然，突变体松果体的夜间血清素水平高于杂合同胞。但给予外源褪黑素完全拯救了该表型——说明问题出在褪黑素的缺失，而非血清素的升高。

斑马鱼还有一个旁系同源基因 aanat1（在视网膜表达）。aanat1−/−; aanat2−/− 双突变体的表型与 aanat2−/− 无法区分，说明 aanat1 对睡眠调控不是必需的。

图 1A ｜ 夜间睡眠减半、活动量增至三倍。aanat2−/− 幼鱼夜间睡眠减少。（A–F）aanat2−/− 幼鱼在夜间比同胞对照睡得更少（B 和 D）、活动更多（A 和 F），而白天则无此差异（A, B, C, E）。数据来自一次代表性实验（A, B, G, H）或两次（I–L）／三次（C–F）实验合并。柱状图表示均值 ± SEM。n，幼鱼数量。p < 0.01，与 aanat2−/− 比较（C–F），采用 Dunnett 检验。亦见 Figure S1。

图 1B ｜ 外源褪黑素完全拯救表型。（G–L）箭头表示在第 6 天加入 10 mM 褪黑素。aanat2−/− 的睡眠与运动活动表型在第 6 夜消失（G, H, J, L）。白天时，外源褪黑素对两个基因型都降低运动活动（G, K）并增加睡眠（H, I）。"Day 6 Pre" 与 "Day 6 Post" 分别指褪黑素加入前后时段。第 5 夜与第 6 夜的总睡眠量本身可存在变异，因此不同基因型之间的比较应在同一夜进行。数据来自一次代表性实验（A, B, G, H）或两次（I–L）／三次（C–F）实验合并。柱状图表示均值 ± SEM。n，幼鱼数量。p < 0.01，采用 Dunnett 检验（C–F）或 Tukey 检验（I–L）。

四、结果二：不是"睡得浅"，而是"睡不着"与"睡不久"

既然 aanat2−/− 夜间睡得少，一个自然的推测是它们的觉醒阈值降低了（更容易被吵醒）。研究者用机械声学刺激在夜间以 1 分钟间隔、多种强度测试。

结果出乎意料：三个基因型的半最大反应概率几乎完全相同（log(probability) 分别为 1.17 ± 0.03、1.15 ± 0.03、1.16 ± 0.04；p = 0.92，extra sum-of-squares F 检验）。也就是说，突变体的觉醒阈值是正常的。

第二个问题：睡着的突变体是否更容易被唤醒（失眠的常见特征是浅睡）？研究者改用 5 分钟间隔刺激、允许幼鱼在每次刺激后重新入睡，并选择正常情况下 50% 幼鱼会响应的敲击强度。结果三个基因型之间无显著差异（p = 0.43，单因素方差分析）。

结论很明确：aanat2−/− 的睡眠缺陷不是由"过度觉醒"造成的。它们的觉醒阈值与睡眠深度都与对照相当——真正出问题的是能否入睡与能否维持，而不是睡着之后睡得安不安稳。

五、结果三：灭掉松果体细胞，结论照样成立

为避免"基因敲除可能有其他效应"的质疑，研究者用第二种方法独立验证。他们构建了转基因斑马鱼：用 aanat2 启动子驱动氰荧光蛋白-硝基还原酶（CFP-NTR）融合蛋白表达。NTR 是一种细菌蛋白，能把惰性前药甲硝唑（MTZ）转化为强效 DNA 交联剂，从而造成细胞自主性死亡。

CFP-NTR 只在表达 aanat2 的松果体细胞中表达，这些细胞发育正常，但在加入 MTZ 后发生死亡。研究者通过优化给药方案（60–80 与 108–128 hpf 两个窗口、期间撤除 MTZ），获得了消融最彻底且无非特异性药物毒性的效果。

结果与基因敲除一致：Tg(aanat2:CFP-NTR) 幼鱼夜间睡得更少、活动更多，只是效应稍弱——作者推测是因为仍有少量 aanat2 表达细胞残留。

更有意思的是：撤除 MTZ 48 小时后，观察到少量新生的 aanat2 表达细胞，而此时幼鱼的睡眠与活动量已恢复正常。这说明松果体消融的表型是可逆的，并提示少量松果体细胞就足以维持正常睡眠。

六、结果四：没有生物钟，褪黑素照样管用

此前有两种假说认为褪黑素是通过影响生物钟来促眠的：一是推动生物钟相位前移，二是抑制生物钟的清醒驱动力。如果成立，那么在没有授时、没有生物钟的条件下，aanat2 突变体应该不再表现睡眠缺陷。

研究者把幼鱼在恒定黑暗（DD）中饲养与测试，得到的是节律完全消失的动物（无明显行为或分子节律）。为确认这是"生物钟停摆"还是"生物钟失同步"，他们做了 per1b 荧光原位杂交：

• 若是停摆，per1b 在所有节律时间点表达水平应当相似。

• 若是失同步，表达应当更异质，且许多细胞的平均荧光强度低于 LD 条件下的峰值。

结果显示：LD 条件下 per1b 在全脑范围内振荡，相位与 RT-qPCR 数据一致；而 DD 条件下 per1b 在所有节律时间点表达水平相似，下丘脑的定量分析显示 DD 的平均水平与 LD 的峰值相当。这说明 DD 饲养在细胞水平上消除了昼夜节律。

在这种条件下，aanat2−/− 幼鱼依然表现为持续的睡眠减少与活动增加，差异幅度与 LD 条件下的夜间相当，同样源于睡眠片段缩短与清醒片段延长；而且这个表型依然能被外源褪黑素拯救。

图 2 ｜ 没有昼夜节律，睡眠缺陷依然存在。aanat2−/− 斑马鱼睡眠减少不需要被授时的昼夜节律。（A, B）在 DD 中饲养并测试的幼鱼不表现出昼夜运动活动或睡眠节律。aanat2−/− 幼鱼比同胞对照活动更多（A, E, F）、睡眠更少（B–D）。（G–L）用 DMSO 载体对照处理的 aanat2−/− 幼鱼比 aanat2+/− 同胞活动更多（G, K, L）、睡眠更少（H–J）；而接受 10 mM 褪黑素处理的 aanat2−/− 幼鱼，其运动活动与睡眠与接受褪黑素处理的 aanat2+/− 同胞无法区分（G–L）。数据来自一次代表性实验（A, B, G, H）或两次（I–L）／三次（C–F）实验合并。柱状图表示发育第 5、6 天与夜间的均值 ± SEM。n，幼鱼数量。p < 0.01，采用 Dunnett 检验。亦见 Figure S3。

这是一个决定性的结果：褪黑素是直接作用于睡眠调控系统的，而不是通过生物钟间接起作用的。

七、结果五：褪黑素不是节律的"方向盘"

既然褪黑素在睡眠中如此重要，那它对生物钟本身是否也必需？研究者在两个层面同时检验：

行为层面：自由运行节律

先把幼鱼在 LD 中授时，再转入 DD 自由运行条件。野生型幼鱼在 DD 中维持分子与行为节律，而 aanat2−/− 幼鱼的昼夜振幅较小（因为主观夜的活动增加），但周期长度与相位与对照相似。

分子层面：三个独立读出

研究者使用了 Tg(per3:luc) 转基因鱼系——per3 启动子驱动荧光素酶表达，是完整幼鱼体内分子节律的活体报告系统（Kaneko & Cahill, 2005）。在 DD 中连续记录 100 小时后，各基因型的振幅、周期长度与相位均无显著差异。

此外还从野生型与 aanat2−/− 幼鱼中分离 RNA，对生物钟基因 per1b 与 arntl1a 做 RT-qPCR，两者的昼夜振荡在野生型与突变体之间无法区分。

结合 aanat2 突变体在 LD 条件下运动活动周期长度与相位正常这一事实，结论是：内源性褪黑素对启动或维持昼夜节律并非必需。

更进一步，把幼鱼在 LD 授时后转入 DD 以消除光对行为的"掩蔽效应"，aanat2−/− 幼鱼在主观白天与主观夜间的睡眠量趋于相同（而同胞对照仍保持明显的节律性差异），尽管其分子节律完全正常。这直接证明了褪黑素是节律调控睡眠所必需的——用双过程模型的话说，褪黑素正是介导过程 C 的那个因子。

图 3 ｜ 行为与分子节律均不受影响。aanat2 对行为或分子昼夜节律并非必需。（A）在 LD 中饲养、在 DD 中监测的幼鱼维持运动活动的昼夜节律。运动活动数据（虚线）拟合阻尼余弦曲线（实线），用于量化昼夜振幅（B）、周期长度（C）与相位（D）。aanat2−/− 幼鱼因主观夜运动活动增加而振幅减小，但周期长度与相位与同胞对照无法区分。黑色与斜纹方框分别指示主观夜与主观日。（E–H）Tg(per3:luc) 幼鱼在 LD 中饲养，在 DD 中记录 100 小时的生物发光。（E）虚线与实线分别表示生物发光数据与阻尼余弦曲线拟合。（F–H）各基因型的昼夜节律振幅、周期长度与相位均无显著差异。柱状图表示均值 ± SEM。a.u.，任意单位。n，幼鱼数量。p < 0.01，采用 Dunnett 检验。亦见 Figure S4。

图 3 续 ｜ 自由运行条件下的睡眠节律消失。在 LD 授时后转入 DD 消除光掩蔽效应后，aanat2−/− 幼鱼在主观白天与主观夜间的睡眠量趋于相同，而同胞对照仍保持明显的昼夜睡眠节律，尽管突变体的分子节律完全正常。这说明褪黑素是昼夜调控睡眠所必需的因子。

八、结果六：它可能是通过腺苷信号起作用的

一个引人入胜的线索是：外源褪黑素能诱导哺乳动物前脑产生腺苷。如果褪黑素正是通过腺苷来促眠的，那么在缺乏褪黑素的突变体中，直接激活腺苷信号应当能拯救表型。

研究者用腺苷受体激动剂 NECA 处理幼鱼。结果很有规律：

• 对 aanat2+/−：NECA 在白天降低运动活动，但在夜间对活动量与睡眠毫无影响——推测是因为夜间腺苷受体已处于最大激活状态。

• 对 aanat2−/−：NECA 在夜间增加睡眠、降低活动，把表型拯救到了与杂合同胞相同的水平。

用另一种机制的 ABT702（腺苷激酶抑制剂，通过提高细胞外腺苷水平来增强腺苷信号）得到了完全一致的结果：对野生型夜间无效，但能拯救突变体。

但这里有个需要排除的"天花板效应"：会不会野生型夜间本来就睡满了，所以再加刺激也无从体现？研究者用了一条完全不同的通路来测试——组胺 H1 受体拮抗剂吡拉明（pyrilamine）。与 NECA、ABT702 不同，吡拉明对 aanat2−/− 与 aanat2+/− 幼鱼增加睡眠、降低活动的幅度是相似的。

这说明 NECA 对野生型夜间无效不是因为它们已经睡到极限，而更可能意味着组胺通路与褪黑素通路是平行关系，而非上下游关系。

由此得到的模型

腺苷在褪黑素下游发挥作用，促进夜间睡眠。这就把双过程模型中的稳态过程（依赖腺苷累积）与节律过程（依赖褪黑素）第一次在分子层面接上了——褪黑素像是一个"开关"，在夜间打开腺苷信号的闸门。

作者也坦承这一假说"必须用遗传学手段和腺苷水平测定来进一步检验"——而在斑马鱼上做这件事相当困难：它有数量庞大的腺苷受体基因，脑体积又很小。作者建议的替代方案是：把基因组编辑技术用到昼行性且能产生褪黑素的哺乳动物上。

图 4 ｜ 腺苷信号可以绕过褪黑素拯救表型。褪黑素是昼夜调控睡眠所必需的，并可能通过腺苷信号促进睡眠。（A–C）幼鱼在 LD 中饲养、在 DD 中测试。aanat2−/− 幼鱼（但同胞对照不是）缺乏昼夜睡眠振荡。黑色与斜纹方框分别表示主观夜与主观日。aanat2−/− 幼鱼在每个主观白天（B）与主观夜间（C）的睡眠量均无显著差异（p > 0.22，Tukey 检验）。（D–G）幼鱼在第 6 天接受 DMSO 载体或 50 mM NECA 处理。第 6 夜，载体处理的 aanat2−/− 幼鱼比载体处理的 aanat2+/− 活动更多（D, F）、睡眠更少（E, G）；而 NECA 处理的 aanat2−/− 幼鱼，其活动量（D, F）与睡眠（E, G）与 NECA 处理的 aanat2+/− 幼鱼相同。（H–K）幼鱼在第 6 天接受载体对照或 10 mM 吡拉明处理。吡拉明对 aanat2−/− 与 aanat2+/− 幼鱼降低运动活动（H, J）、增加睡眠（I, K）的幅度相似。柱状图表示均值 ± SEM。n，幼鱼数量。p < 0.01，采用 Dunnett 检验（B, C, F, G）或 Tukey 检验（J, K）。箭头表示移液操作引起的瞬时假象。亦见 Figure S4。

图 4 续 ｜ 组胺 H1 受体拮抗剂的对照实验。（H–K）作为对照，吡拉明（组胺 H1 受体拮抗剂）对 aanat2−/− 与 aanat2+/− 幼鱼的促眠效果幅度相近，说明腺苷通路与褪黑素通路更可能是平行而非上下游关系。

九、讨论：把两个过程接起来的那块拼图

双过程模型提出一个核心问题：稳态线索与节律线索是如何被整合的？而一项理想的过程 C 介导因子应当满足三条标准：

• 其一，生物钟应当调控该因子的水平或活性。

• 其二，给予该因子应当在节律性清醒时段诱导睡眠，而在睡眠时段则不然。

• 其三，丧失该因子应当消除睡眠的节律性调控。

在夜行性啮齿类中，人们已发现一批表达呈节律性振荡的肽类，且过表达会在节律性清醒时段抑制活动或促进睡眠——包括心肌营养素样细胞因子（cardiotrophin-like cytokine）、转化生长因子 α（TGF-α）与前激动力蛋白 2（prokineticin 2）。但功能缺失研究显示，它们对活动或睡眠的节律性调控几乎没有影响。

褪黑素是一个更符合全部三条标准的候选：生物钟调控其产生（标准一），外源褪黑素能在斑马鱼幼鱼白天强烈增加睡眠、降低活动（标准二），而 aanat2 突变体的睡眠节律调控被彻底废除（标准三）。本研究的结论因此是：在昼行性的斑马鱼模型中，褪黑素介导过程 C。

为什么必须用昼行性动物做这个实验？

这一点值得强调：褪黑素在昼行性与夜行性动物中都是夜间分泌，而生理剂量的褪黑素在夜行性动物中并不促进睡眠。这提示昼行性与夜行性动物很可能采用不同机制来调控睡眠的节律性。

一个支持性观察是：大多数用于遗传学研究的夜行性小鼠品系几乎不产生褪黑素，却依然拥有节律性的睡眠控制。因此，作者呼吁：在能产生褪黑素的夜行性与昼行性哺乳动物中敲除 aanat，才能厘清褪黑素在哺乳动物睡眠调控中的角色。

临床意义

作者在最后指出：褪黑素水平下降与衰老、情绪障碍和自闭症都有关联。更深入地理解内源性褪黑素如何与睡眠系统及其他生理环节相互作用，可能为这些疾病带来新的治疗思路。

十、结论与意义

褪黑素是昼夜调控睡眠的必需因子，但它不是生物钟的组成部分。

这是首个昼行性脊椎动物的内源性褪黑素失功能模型，结论直接挑战了"褪黑素只是通过调相位间接起效"的主流假说。它的作用位置是"生物钟下游、睡眠系统上游"。这一点有三重实验支撑：DD 条件下细胞水平生物钟已被废除但表型依然存在；生物钟本身的三种读出（行为、per3:luc、RT-qPCR）全部正常；以及在自由运行条件下睡眠的昼夜振荡被选择性抹平。

它可能通过腺苷信号起效——这是把双过程模型的稳态过程与节律过程在分子层面连起来的关键线索，也是下一步最值得在哺乳动物中验证的方向。

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