Cholan PM, Han A, Woodie BR, Watchon M, Kurz ARM, Laird AS, Britton WJ, Ye L, Holmes ZC, McCann JR, David LA, Rawls JF, Oehlers SH

悉尼大学百年研究所 ｜ 杜克大学医学院

Gut Microbes, 2020, 12(1): 1824563　doi:10.1080/19490976.2020.1824563
收稿：2020-05-14　修回：2020-08-11　接受：2020-09-08　发表：2020-10-16

摘要

短链脂肪酸（SCFAs）是肠道菌群发酵膳食纤维的产物。丁酸是其中尤为重要的 SCFA，具有抗炎属性，在哺乳动物肠道菌群失调相关的炎症性疾病中通常处于较低水平。我们旨在确定斑马鱼菌群是否产生 SCFA，以及 SCFA 是否对斑马鱼免疫产生保守效应，作为非哺乳动物脊椎动物免疫系统的例子。我们证明，成年斑马鱼肠道的细菌群落在体外能合成全部三种主要 SCFA，尽管在斑马鱼肠道内体内检测不到这些 SCFA。浸泡丁酸——而非乙酸或丙酸——减少了中性粒细胞和 M1 型促炎巨噬细胞向伤口的募集。我们发现中性粒细胞通过羟基羧酸受体 1（hcar1）的直系同源基因感应丁酸，这一感应机制是保守的。来自 Hcar1 缺失胚胎的中性粒细胞不再响应丁酸的抗炎效应，而巨噬细胞对丁酸的敏感性则独立于 Hcar1。我们的数据证明了丁酸抗炎效应的保守性，并鉴定出鱼中存在一个保守的分子受体。

导言：把"菌群—丁酸—抗炎"这条线往前推 4 亿年

丁酸是肠道菌群发酵膳食纤维的明星代谢物，在哺乳动物中抗炎作用明确。它对鱼有没有用？本文给出三个干脆的答案：① 斑马鱼肠道菌群确实能在体外合成三种主要 SCFA，但比例（90:5:5）与人结肠（60:20:20）不同；② 浸泡丁酸能抑制斑马鱼中性粒细胞向伤口募集，但乙酸和丙酸不行；③ 中性粒细胞靠 HCAR1 受体感应丁酸——这条"丁酸-Hcar1-中性粒细胞"轴从 4.2 亿年前的共同祖先一路保守到人。更有意思的是，巨噬细胞对丁酸的响应走的是另一条不依赖 HCAR1 的 HDAC 通路。

一、SCFAs：菌群给宿主的"抗炎礼包"

短链脂肪酸（SCFAs）——乙酸、丙酸、丁酸——是大肠菌群厌氧发酵膳食纤维的产物。它们的抗炎机制主要有两条：抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），以及激活 G 蛋白偶联受体（GPCR）。哺乳动物研究汗牛充栋，但鱼类里丁酸抗炎的机制从没被报道过。

斑马鱼是检验"保守性"的理想平台：肠道免疫关键分子（TLR、NLR）与哺乳动物同源，身体透明、适合活体成像。但此前连"斑马鱼肠道能不能产生 SCFA"都没定论——宏基因组里查到了丁酸代谢基因，关键的丁酰 CoA:乙酸 CoA 转移酶却一直没检出。

图 1 ｜ 斑马鱼肠道菌群体外合成 SCFA。常规饲养成年斑马鱼肠道微生物群在 BHI、Gifu 两种培养基中的 SCFA 产量；"Negative"为培养基本底。乙酸在有氧／厌氧条件下均可合成，丁酸与丙酸仅在厌氧条件下检出。BHI 厌氧条件下三种 SCFA 比例约为 90:5:5（n = 2）。

二、体内测不到，体外却产得欢

第一个反直觉的结果：直接测成年斑马鱼肠道内容物，三种 SCFA 全部低于检测限（0.00132 mmol/g）。但把肠道菌群取出来培养，它们有能力合成全部三种 SCFA。

为什么体内测不到？作者推测：要么斑马鱼把肠道内产生的 SCFA 代谢得极快，要么实验饲料蛋白含量太高、纤维太少（缺底物）。另外菌群组成也是因素——斑马鱼肠道以变形菌门和梭杆菌门为主，而人和小鼠以拟杆菌门和厚壁菌门为主，所以产酸比例 90:5:5 与哺乳动物结肠的 60:20:20 明显不同。

关键点：斑马鱼菌群"会做"丁酸，只是体内环境没让它积累。这使接下来"外源丁酸是否有效"的问题变得更有意义。

图 2 ｜ 丁酸减少中性粒细胞向伤口募集。A 标准切割位点（横断背主动脉与主静脉）与活体成像用尾鳍切位示意；B 伤后 6 hpw 各处理组中性粒细胞计数——丁酸组显著减少，地塞米松（阳性对照）同样有效，乙酸、丙酸无效（P = 0.0008）；C 丁酸处理的中性粒细胞运动速度降低（P = 0.0044）；D 蜿蜒指数升高（P = 0.012）；E 2 dpf 胚胎（肠道成形前）中丁酸同样抑制募集（P = 0.0026）。

三、只有丁酸管用，中性粒细胞是主角

尾鳍切断是最常用的斑马鱼急性炎症模型。把胚胎泡在 30 mM 的各种 SCFA 里，结果高度分化：只有丁酸显著减少伤后 6 小时向伤口募集的中性粒细胞，乙酸和丙酸毫无作用，地塞米松作为阳性对照有效。

活体追踪进一步显示，丁酸不仅让人少，还让"到场"的中性粒细胞跑得更慢、路径更绕——运动行为被系统性改变。更惊人的是，2 dpf 胚胎（肠道尚未成形、卵膜基本隔绝微生物）同样对丁酸敏感，说明感应 SCFA 的能力在发育早期就已编程，不依赖菌群定植。

图 3 ｜ 丁酸减少巨噬细胞募集并抑制其促炎分化。A 伤后 6 hpw 巨噬细胞荧光面积——丁酸减少、丙酸反而增加；B 24 hpw（消退期）趋势保持；C tnfa 启动子荧光总面积在丁酸组显著降低；D 双转基因（红＝巨噬细胞，绿＝tnfa 活性）代表性图像；E tnfa 阳性巨噬细胞比例从对照约 55% 降至丁酸组约 15%（P < 0.0001）。

四、巨噬细胞也被丁酸"劝退"，但走的另一条路

对巨噬细胞，丁酸做了两件事：一是减少募集（6 hpw 与 24 hpw 都成立）；二是降低极化——用 tnfa:gfp 报告鱼看，tnfa 阳性巨噬细胞比例从约 55% 掉到约 15%，等于把促炎的 M1 型拉向抗炎方向。

一个细节值得注意：丙酸在斑马鱼里是促炎的——它反而增加了巨噬细胞募集和纤维蛋白凝块积累。这与哺乳动物里丙酸盐的抗炎效应相反，但与硬骨鱼养殖文献中丙酸盐的"免疫刺激"报道一致。物种差异，可能比想象的大。

毒性方面作者也做了把关：纤维蛋白沉积与血小板聚集两项止血指标均不受丁酸影响——排除"白细胞变少是因为鱼被毒坏了"的替代解释。

图 4 ｜ 斑马鱼 Hcar1 受体表征与 CRISPR 验证。A 共线性图——人 12 号、小鼠 5 号、斑马鱼 10 号染色体上 HCAR1 与邻近基因（DENR／CCDC62／HIP1R）的保守排布，斑马鱼含 hcar1a／hcar1b 两个串联拷贝；B hcar1 在肠道的表达高于躯体（P = 0.042）；C CRISPR 敲低使 hcar1 转录本下降约 50%（P = 0.026）；D crispant 胚胎形态正常；E hcar1 敲低后丁酸不再抑制中性粒细胞募集（对照胚胎 P = 0.0048，crispant P = 0.78）；F 巨噬细胞募集的抑制不依赖 hcar1；G tnfa 表达的抑制同样不依赖 hcar1。

五、一个受体，两种机制：这是本文最漂亮的结果

作者在斑马鱼 10 号染色体上找到了哺乳动物 HCAR1 的同源物——还是串联重复的两个拷贝（hcar1a／hcar1b，氨基酸同一性 89%，与人 HCAR1 约 43% 同一）。表达分析显示 hcar1 在中性粒细胞中富集，肠道表达高于躯体其他部分。

CRISPR 敲低（约 50% 敲低、发育正常）后的结果泾渭分明：

中性粒细胞：丁酸效应完全消失（P 从 0.0048 变成 0.78）→ 依赖 Hcar1。

巨噬细胞募集：丁酸效应照常存在 → 不依赖 Hcar1。

tnfa 表达抑制：丁酸效应照常存在 → 不依赖 Hcar1。

这与哺乳动物的机制图谱完全对上：中性粒细胞靠细胞表面的 HCAR1 受体感应丁酸；巨噬细胞则靠丁酸自由扩散入胞抑制 HDAC——本文用 H3K9／H4K5 乙酰化升高且不受 hcar1 敲低影响，直接验证了这条 HDAC 通路。同一分子、同一动物体内、两条独立通路，分工精确到细胞谱系，而且4.2 亿年前就是这样的。

六、结论速览

1. 斑马鱼肠道菌群有能力合成三种 SCFA，但体内检测不到（可能被快速代谢或饲料缺底物）；

2. 浸泡丁酸抑制中性粒细胞向伤口募集，且 2 dpf（肠道成形前、无菌状态）依然有效；

3. 丁酸同步减少巨噬细胞募集、把巨噬细胞从 tnfa+ 促炎态拉回；丙酸反而促炎；

4. "丁酸-Hcar1-中性粒细胞"轴与"丁酸-HDAC-巨噬细胞"轴双通路保守，分工精确到谱系；

5. 止血指标无异常，排除毒性假象。

七、一句话点评

"菌群-丁酸-抗炎"这条线在哺乳动物里已经卷得厉害，本文的价值在于把时间轴往前推了 4 亿年：丁酸的免疫调节不是哺乳动物的新发明，而是脊椎动物的老家底。对鱼类养殖（丙酸促炎的提示直接可用）和对人类炎症性肠病研究（斑马鱼可作为高通量活体筛选平台）都有实际意义。简洁的简报体量、干净的 CRISPR 验证，是一篇"小而美"的典型工作。

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