Sacco A, Roccaro AM, Ma D, Shi J, Mishima Y, Moschetta M, Chiarini M, Munshi N, Handin RI, Ghobrial IM

丹娜-法伯癌症研究所 ｜ 哈佛医学院

Cancer Research, 2016, 76(2): 463–471　doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-1926
主题：多发性骨髓瘤

摘要

许多实体瘤和血液肿瘤的进展，常伴随癌细胞向骨髓的播散与归巢。目前哺乳动物模型中定量刻画这一转移级联关键步骤的方法非常有限，且无法开展快速的大规模基因组或药物筛选。鉴于斑马鱼的光学透明性，我们用它建立了癌细胞播散与归巢到骨髓的活体模型。我们将源自人骨髓的多发性骨髓瘤（MM）细胞及细胞系进行心内注射，并监测其向尾部造血组织（CHT）——斑马鱼胚胎中发生造血的区域，重现了一个骨髓样生态位——的迁移。转录组分析证实，归巢到 CHT 的 MM 细胞与 CHT 之外的 MM 细胞相比存在基因表达差异，其中显著富集了调控白细胞介素-6（IL6）信号、细胞黏附和血管生成的基因。这些发现共同指出，斑马鱼是研究癌细胞归巢到造血生态位的有价值模型，并可用于建立筛选平台，以鉴定促成骨转移早期步骤的因素与机制。

导言：把一个昂贵的小鼠实验改造成筛选平台

骨转移是乳腺癌、前列腺癌等实体瘤和多发性骨髓瘤（MM）等血液肿瘤中最常见的转移形式之一，但小鼠模型难以定量、难以高通量筛选。本研究把人 MM 细胞注射进透明的斑马鱼胚胎，让它们归巢到胚胎的"迷你骨髓"——尾部造血组织（CHT），几分钟内就能在显微镜下直接数细胞。归巢 MM 细胞的转录组变化（IL6 信号、细胞黏附、血管生成）与人骨髓微环境一致，敲低 CXCR4、VLA4、FAK 都能阻断归巢——一套 400 个细胞/胚胎、可混样对照的高通量骨转移筛选平台就此诞生。

一、为什么小鼠模型不够用

研究癌细胞归巢骨髓，经典手段是活体双光子／共聚焦显微镜透过小鼠颅骨观察。但它有几个硬伤：

1. 无法定量——看到细胞但数不准；

2. 不能做大规模筛选——药物筛选、shRNA／CRISPR 筛选都需要量；

3. 用不了原代细胞——需要大量细胞静脉注射，而且很多细胞被截留在肺里，根本到不了骨髓。

斑马鱼胚胎通体透明、产卵量大，尾部的尾部造血组织（CHT）是胚胎期 definitive 造血的场所，被认为相当于哺乳动物的胎肝——HSC 归巢于此，是一个现成的"骨髓样微环境"。更关键的是，CXCR4–CXCL12 轴在斑马鱼造血中的功能与哺乳动物一致，2 亿年的独立演化保守了关键的遗传调控因子。

图 1 ｜ MM 细胞心内注射及其在 CHT 区域的定位。A 心内注射位点示意图；B GFP+ MM.1S 注入 48 hpf 胚胎，注射后 30 分钟即定位于 CHT；C 两名 MM 患者骨髓来源的原代 CD138+ 细胞（DiO／DiD 标记）同样归巢 CHT；D 斑马鱼自身 CD41+ HSC 作为阳性对照，归巢区域与 MM 细胞重合；E–F MM.1S 与 HeLa 等量混合注射，只有 MM.1S 定殖 CHT（P < 0.001）。

二、只有"懂行"的癌细胞才归巢

模型能不能立得住，先看特异性。作者设计了一个漂亮的双色混样竞争实验：把红色标记的 MM.1S 和绿色标记的 HeLa 细胞等量混合、注入同一批胚胎——同一环境、同一血液循环，谁归巢一目了然。

结果 CHT 被 MM.1S 占满，HeLa 几乎绝迹（P < 0.001）。而已知嗜骨转移的乳腺癌细胞 MDA-MB-231 也成功定殖 CHT。这说明斑马鱼 CHT 能重现哺乳动物骨髓的归巢选择性：嗜骨髓的细胞进得去，不嗜骨髓的进不去。

图 2 ｜ 归巢 MM 细胞的转录组分析流程与结果。60 枚确认归巢的胚胎被解剖分离为 CHT 与非 CHT 两部分，人外显子组富集后测序。GSEA 显示归巢细胞的趋化因子／细胞因子（FDR 0.17）、IL6 通路（FDR 0.19）、血管生成与细胞黏附通路（FDR 0.09–0.10）显著富集——与人骨髓微环境中 MM 细胞的变化一致。

三、解剖 60 条鱼，读出归巢后的基因变化

这个实验最"硬核"的一步：确认归巢后，把每 20 枚胚胎解剖，CHT 一份、身体其余部分一份，各合并 3 个池做 RNA 测序。因为人细胞只占极小比例，作者先用人全外显子组探针富集人源序列再测序。

结果非常清晰——归巢 CHT 的 MM 细胞里，三类通路被显著激活：

趋化因子／细胞因子信号（FDR 0.17）与 IL6 通路（FDR 0.19）——MM 的两大生长引擎；

细胞间黏附（FDR 0.09）——锚定在微环境里的关键；

血管生成（FDR 0.10）——制造适合定殖的"土壤"。

这些变化与 MM 细胞在人骨髓微环境中发生的变化高度一致——斑马鱼 CHT 不是随便一块组织，它确实给了 MM 细胞"回到骨髓"的分子信号。

图 3 ｜ CXCR4、VLA4、FAK 沉默抑制 MM 细胞归巢。A CXCR4 敲低细胞（绿）与乱序对照（红）等量混注，CHT 浸润显著减少（P < 0.001）；B CXCR4 抑制剂 plerixafor（AMD3100）处理同样阻断归巢；C、D VLA4 与 FAK 敲低均显著抑制归巢（P < 0.001）；E qRT-PCR 确认归巢 CHT 的细胞表达更高水平的 CXCR4、FAK、VLA4。

四、敲掉三个已知"归巢基因"，全部灵验

一个模型是否"真实"，最好的检验是用它复现已知的生物学。作者沉默了 MM 归巢机制的三个经典分子：CXCR4（趋化因子受体，骨髓归巢的头号引擎）、VLA4（介导与骨髓基质的黏附）、FAK（黏着斑激酶，维持 B 系细胞在骨髓中的滞留）。每一个被沉默，归巢都显著受损；临床已用的 CXCR4 抑制剂 plerixafor 同样灵验。反向验证也对：归巢 CHT 的 MM 细胞，这三个基因的表达都高于未归巢的细胞。

模型还推广到了另一种嗜骨髓的血液肿瘤——华氏巨球蛋白血症（WM）：过表达 CXCR4 归巢增强，敲低则减弱，剂量响应关系完美成立。

图 4 ｜ CXCR4 的功能获得与缺失调控 WM 细胞归巢。A CXCR4 过表达细胞（红）的 CHT 定殖显著多于空载体对照（绿，P < 0.001）；B CXCR4 敲低细胞的归巢显著低于乱序对照（P < 0.001）。

五、结论速览

1. 400 个细胞／胚胎的心内注射即可，几十分钟内完成归巢，显微镜直接定量；

2. 双色混样竞争体系允许实验组与对照组同一条鱼内直接比较，消除个体差异；

3. 归巢细胞的转录组变化复现人骨髓微环境特征（IL6／黏附／血管生成）；

4. CXCR4、VLA4、FAK 敲低均阻断归巢，模型与已知生物学吻合；

5. 适用于患者来源原代细胞与 WM 等其他嗜骨髓肿瘤，可扩展为药物／基因组筛选平台。

六、一句话点评

这项 2016 年的工作是"斑马鱼肿瘤移植"的经典示范：它没有发现新通路，而是用透明胚胎把一个原本昂贵、低通量、难定量的小鼠实验，改造成了一个便宜、高通量、可混样对照的活体筛选系统。对骨转移早期事件（归巢之后、定植之前）的研究，这套平台至今仍是少数可行选项之一。后续研究在此基础上叠加 CRISPR 筛选与药物文库，将持续挖掘骨转移微环境的可干预节点。

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