Mayumi F. Miller、Leah J. Greenspan、Derek E. Gildea、Kathryn Monzo 等
Brant M. Weinstein

美国国立儿童健康与人类发展研究所（NIH）发育生物学部 · 国家人类基因组研究所 · 生物信息学与科学编程核心

Angiogenesis (2025) 28:40　doi:10.1007/s10456-025-09990-8
收稿 2024-12-16接收 2025-06-09　在线发表 2025-07-04

摘要

研究内皮细胞，现有办法都得先把组织剪碎、酶解、排序——过程长达一个半小时以上，足以让细胞的原位状态消失得一干二净。这篇工作做出了一条AngioTag 转基因斑马鱼：给内皮细胞装上带 HA 标签的核糖体蛋白，直接在活体里把「正在被翻译的 mRNA」捞出来。结果发现，同样是分选内皮细胞，TRAP 抓到的内皮基因比 FACS 多了 3 倍（9个 vs 3 个 GO 条目）——这套工具让「在体测序」这件事第一次真正接近了生理真相。

核心要点

1. 核心策略：让细胞自己「盖章」。把带 3×HA 标签的 Rpl10a（60S 核糖体亚基）融合到内皮细胞特异性启动子 kdrl 下游，凡是这个品系的内皮细胞，其正在翻译的 mRNA 上就挂着一个可被抗 HA 抗体抓住的「分子把手」——TRAP（翻译核糖体亲和纯化）由此实现。

2. 技术验证严密：蔗糖密度梯度离心证明 HA 标记核糖体确实与内源 Rpl11 多聚核糖体共沉淀；EDTA 处理后两者一同沉降于 60S 片段——完全符合核糖体装配的生化原理。

3. 最关键的对照实验：同一批胚胎，一边走 FACS（酶解+分选，耗时 1.5 小时以上），一边走 TRAP（立即匀浆）。主成分分析显示「经历解离」的样本彼此差异巨大，且与其他样本明显分离；解离样本中 fos、hsp70、gadd45、egr1、atf3 等应激基因全面升高——FACS 测到的是「受惊后的细胞」，不是「体内的细胞」。

4. 挖出全新基因：TRAP 富集到一批此前从未报道在内皮表达的基因（exoc3l2a、slc22a7b.1、bpifcl），原位杂交确认其内皮特异性表达；更有4 个全新注释基因内皮富集超20 倍。

5. 功能验证闭环：用 CRISPR/Cas9 敲除其中两个基因，突变体分别出现尾部血管丛扩张与头脑血管减少——从「测序发现」一路走到「表型验证」。

6. 通用化扩展：再构建 UAS:RiboTag 品系，配合任意 Gal4 驱动系即可对任意组织/细胞做 TRAP——已验证肌肉、内皮、神经三类驱动均成功，为「按需定制细胞类型测序」提供了通用平台。

一、引言：我们一直在「伤害」细胞，才测到它的基因

血管系统是由动脉、静脉和毛细管协同工作的复杂网络，让含氧血液流遍全身，将激素与小分子输送至靶组织。这些血管由管腔化的内皮细胞管构成，外包平滑肌细胞（大血管尤其是动脉）或与基底膜紧邻贴附的周细胞。血管管腔内的内皮细胞彼此之间、以及与周围血管平滑肌细胞之间存在广泛的细胞连接。此外，内皮的管腔面持续暴露于血流动力学、循环细胞与血源性因子，而其背面（abluminal face）则与细胞外基质及大量非血管细胞和组织广泛互作。

要在体内理解内皮细胞如何响应如此复杂的外界线索来调控血管生长与功能，具有巨大的意义——血管在癌症、缺血与先天性血管疾病中都扮演重要角色。然而，现有的内皮基因表达与功能分析，几乎都依赖死亡后的单细胞分离和/或体外培养，这破坏了内皮细胞在体内经历的大部分正常互作。FACS 分选等方法需要酶解与机械解离成单细胞悬液，再经过（往往很耗时的）分选流程才能制备 RNA；这些操作很可能引入了信号通路变化，包括细胞应激与凋亡通路的激活，从而掩盖内皮细胞原生的转录状态。

解法：翻译核糖体亲和纯化（TRAP）

TRAP 的思路很巧：不抓细胞，而是抓「正在翻译的 mRNA」——免疫沉淀下那些挂着核糖体、正在被翻译的 mRNA。能否实现，取决于一个前提：让特定细胞表达带标签的核糖体蛋白（如 RiboTag）。随后的多项研究已充分验证该工具——证明标记核糖体亚基确实装配进核糖体，且核糖体结合的 mRNA 与蛋白表达高度相关。

本文的最大优势在于「快」：从这些品系分离血管 mRNA 极其迅速，胚胎与器官在含环己酰亚胺（cycloheximide）的裂解液中立即匀浆以戛然而止翻译——所收集到的 mRNA 因而忠实代表未被扰动的原位细胞的真实表达谱。

二、结果

1. RiboTag 表达盒能在体内纯化「正在翻译的 RNA」

为确定 TRAP 能否从发育中的斑马鱼中分离多聚核糖体结合的 mRNA，我们设计了 egfp-2a-rpl10a3xHA RiboTag 表达盒。该表达盒将 60S 核糖体蛋白 L10a（rpl10a）与三重复血凝素（HA）表位序列融合（rpl10a3xHA）；为可视化转基因表达，还包含通过病毒 2A 切割位点与 rpl10a3xHA 相连的 EGFP，从而实现 EGFP 与 rpl10a3xHA 两条多肽的双顺反子表达。Rpl10a3xHA 蛋白装配进功能性核糖体后，即可标记该转基因表达细胞中正在翻译的 mRNA。

验证结果令人满意。Western blot 显示，Rpl10a3xHA 蛋白在 RiboTag mRNA 注射动物中可被检出，并可用抗 αHA 抗体从裂解液中拉下。蔗糖密度梯度离心进一步证实：HA 标记的核糖体与 Rpl11 阳性的多聚核糖体共同沉淀；经 EDTA 处理后，Rpl11 阳性内源核糖体与 HA 标记核糖体均沉降于 60S 片段——这完全符合核糖体的生化性质，彻底排除了「标签蛋白只是随便贴在别处」的疑虑。

图 1　带亲和标签的核糖体蛋白亚基（RiboTag）可在体内纯化正在翻译的 RNA。A egfp-2a-rpl10a3xHA RiboTag 表达盒的结构示意图。B 3×HA 标记核糖体正在翻译 mRNA 的示意图。C 从 RiboTag mRNA 注射斑马鱼中 TRAP 纯化 RNA 的流程示意图。D Western blot：对照或 RiboTag 注射动物的起始裂解液、TRAP 上清与洗脱液，抗 αHA 抗体检测。拉下物中可见 IgG 轻链。E 蔗糖密度梯度离心分级后各组分的 Western blot，抗 αRpl11 或 αHA 抗体检测。在 RiboTag 注射样本中，HA 标记核糖体与 Rpl11 阳性多聚核糖体共同沉淀。F EDTA 处理后裂解液梯度分级的 Western blot。Rpl11 阳性内源核糖体与 HA 标记核糖体在 EDTA 处理后均沉降于 60S 片段。G IsceI(kdrl:egfp-2a-rpl10a3xHA) 转基因结构示意图。H, I 3dpf Tg(kdrl:egfp)^la116（对照，H）与 Tg(kdrl:egfp-2a-rpl10a3xHA)^y530（「AngioTag」，I）转基因动物的复合共聚焦显微图。J 从 AngioTag 斑马鱼 TRAP 纯化 RNA 的流程示意图。K Western blot：对照或 AngioTag 动物的起始裂解液、TRAP 上清与洗脱液，抗 αHA 抗体检测（同一张膜的长曝光与短曝光）。IgG 轻链存在于拉下物中。L 定量 RT-PCR：RiboTag 对照（黑柱）与 AngioTag（白柱）动物 TRAP 纯化 RNA 中内皮基因 cdh5、kdrl 与非内皮基因 desma、neurog1 的相对表达——AngioTag 样本中血管特异基因被富集、非血管特异基因被耗竭。HA，血凝素；EDTA，乙二胺四乙酸；GFP，绿色荧光蛋白；dpf，受精后天数；PCR，聚合酶链式反应；SDS-PAGE 后的 Western blot。

2. 构建 AngioTag：内皮细胞专属的「分子把手」

既然 RiboTag 有效，我们便想把它装进内皮细胞里。既往研究已构建过驱动 EGFP 单独表达的 Tg(kdrl:egfp)^la116 转基因系；我们据此构建了强表达的 Tg(kdrl:egfp-2a-rpl10a3xHA)^y530 生殖系转基因品系，其血管受限的 EGFP 表达模式与既往品系高度吻合，即呈现内皮细胞特异的表达格局。

为测试该品系能否用于内皮 mRNA 的 TRAP 富集，我们制备 24 hpf AngioTag 与对照非转基因动物的匀浆液并执行 TRAP。Western blot 显示 Rpl10a3xHA 蛋白在 AngioTag 动物（第 2 泳道）中即可被检出、在对照中（第 1 泳道）则无；且 rpl10a3xHA 可用抗 αHA 抗体从 AngioTag 裂解液中拉下。定量 RT-PCR 进一步表明：AngioTag 动物分离的 RNA 中，内皮特异基因（cdh5、kdrl）高度富集，而非内皮特异基因（desma、neurog1）相对 RiboTag mRNA 注射对照被显著耗竭——AngioTag TRAP 确实实现了内皮 mRNA 的选择性富集。

3. 头对头比较：TRAP vs FACS，谁测得更准？

证明 AngioTag 能选择性富集后，我们将其与既往已发表的斑马鱼 FACS 内皮表达谱分析做正面对比。FACS 流程要求将胚胎解离成单细胞悬液，在细胞裂解与 RNA 收集之前长时间破坏细胞—细胞、细胞—基质及其他外部互作；而 TRAP 流程则立即匀浆、裂解并稳定翻译中的 RNA，提供的是胚胎匀浆那一刻翻译基因表达的「即时快照」，因而在潜在更能代表「体内」真实谱。

我们共对6 种样本类型各做 3 次生物学重复（共 18 个样本）进行 RNAseq：① 24 hpf RiboTag mRNA 注射动物的 TRAP 纯化多聚核糖体（样本 2，「全动物 TRAP 转译组」）；② 24 hpf AngioTag 动物 FACS 分选的内皮细胞（样本 4，「内皮 FACS 转录组」）；③ 24 hpf AngioTag 动物 TRAP 纯化多聚核糖体（样本 6，「内皮 TRAP 转译组」）。每种样本另设对照 RNA（样本 1/5 为 TRAP 起始裂解液，样本 3 为未分选细胞）。

每个样本至少获得 4500 万 reads，平均 84% 唯一比对（登录号 GSE292080）。主成分分析结果极具说服力：RiboTag-TRAP 与 AngioTag-TRAP 的起始裂解液与 TRAP 样本聚类相对靠近；而「FACS 未分选（样本 3）」与「FACS 分选（样本 4）」细胞样本不仅与其他样本差异显著，彼此之间也相差甚远。这提示细胞解离与分选本身即可引起偏离内源表达的变化。

图 2　用 FACS 与用 TRAP 制备内皮特异RNA 的流程对比。A FACS 流程：对 24 hpf Tg(kdrl:egfp-2a-rpl10a3xHA)y530 AngioTag 转基因动物分选 EGFP 阳性内皮细胞并制备 RNA（C 图样本 #4）。RNA 是在经历超过 1½ 小时胚胎解离与细胞分选之后才收集的。B TRAP 流程：从 24 hpf egfp-2a-rpl10a3xHA RiboTag mRNA 注射动物（样本 #2）或 Tg(kdrl:egfp-2a-rpl10a3xHA)y530（AngioTag）转基因动物（样本 #6）TRAP 纯化正在翻译的 mRNA。裂解液直接由完整动物制备，RNA 在流程起始即被稳定。C 用于 RNAseq 的样本（各 3 重复）：24 hpf RiboTag mRNA 注射（样本 1、2）、解离后的 AngioTag 转基因动物（样本 3、4）、AngioTag 转基因动物（样本 5、6）。每份样本的一部分用于全裂解液总 RNA 收集（样本 1、3、5），剩余部分用于 TRAP 纯化（样本 2 或 6）或 FACS 分选后 RNA 分离（样本 4）。D 六种样本类型 RNAseq 数据的主成分分析（各 3 重复，共 18 个样本）。最大的方差出现在「细胞被解离」（样本 3、4）与「未被解离」（样本 1、2、5、6）的样本之间。FACS，荧光激活细胞分选；TRAP，翻译核糖体亲和纯化；hpf，受精后小时数；IP，免疫沉淀；input，对照（起始裂解液）。

4. 顺带回答一个基础问题：翻译旺盛的基因偏爱哪些密码子？

比较全胚胎裂解液转录组（样本 1）与配对的全胚胎 TRAP 转译组（样本 2）显示，1430 个基因在两个 RNAseq 数据集中差异显著，其中 807 个基因在 TRAP 转译组中表示增加（log2 fold > 0.35），623 个表示减少（log2 fold < −0.35）。在转译组中倍数增加最大的十个 PANTHER GO 条目里，有 8 个与剪接相关——提示这些基因的 mRNA 翻译得更为活跃。

我们继而考察是否存在与翻译升高或降低相关的序列特征。通过计算两组基因间的密码子使用变化，发现高翻译基因对特定密码子存在强烈偏好，而回避另一些密码子。耐人寻味的是，我们关于高翻译基因密码子偏好的发现，与既往报道的斑马鱼基因组「高转录基因」密码子偏好高度相关（r² = 0.95），仅在终止密码子使用上存在轻微差异。这些发现提示被高度翻译的基因存在优先的密码子使用偏好，进而可影响蛋白表达效率。

图 3　全动物转录组与其转译组的比较。A 用于 RNAseq 的样本：24 hpf RiboTag mRNA 注射动物的全动物转译组（样本 2）vs 全动物转录组（样本 1）。B 基于平均倍数增加量，翻译程度最高的基因的前 10 个 GO 条目。其中 8 个与剪接相关。C 翻译程度最高的基因（log2 fold > 0.35，BH 校正 p < 0.05，样本 2 vs 1）与翻译程度最低的基因（log2 fold < −0.35）之间的密码子使用百分比变化。配色表示某密码子相对用量在两组基因间的变化（以编码同一氨基酸的密码子总数为百分比计算）。D 散点图：将本研究的密码子使用发现与 Horstick 等人（参考文献 [40/41]）的结果比较。本数据集高翻译基因的密码子使用与既往报道的高转录基因密码子使用呈强相关（r² = 0.95）。GO，基因本体论；BH，Benjamini-Hochberg 多重检验校正；CDS，编码序列。

5. 核心对照：TRAP 的内皮富集能力远超 FACS

既有研究已用 FACS 从发育中斑马鱼分离内皮细胞做表达谱分析，为便于比较，我们先对 24 hpf AngioTag 动物经 FACS 分离的内皮细胞 mRNA 做 RNAseq。结果显示：3363 个基因在 FACS 分选的内皮细胞中显著富集（log2 fold > 0.35），3106 个基因显著耗竭。在倍数富集最高的 20 个 GO 条目中，仅 3 个与内皮/血管相关，其余 17 个均与内皮无关。

随后我们用 TRAP-RNAseq 检测 AngioTag 品系内皮：1365 个基因在内皮 TRAP 转译组中富集（log2 fold > 0.35），1141 个基因相对全动物转译组耗竭。在其前 20 个 GO 条目中，有 9 个是内皮/血管相关条目——数量上远超 FACS 的 3 个。其中 3 条虽也出现在 FACS 的前二十中，但在 TRAP 数据集中倍数富集程度更高。

更具说服力的是直接的应激信号对比：解离细胞样本（样本 3 vs 1；样本 4 vs 6）中已知应激诱导基因大幅升高，包括 Fos 家族成员（fos）、热激 70 蛋白（hsp70）、生长阻滞与 DNA 损伤诱导表达（gadd45）、早期生长反应基因（egr1）和激活转录因子（atf3）。这表明细胞解离与分选流程会诱发应激相关的转录改变。综上，TRAP-RNAseq 比 FACS-RNAseq 更好地读出了目标细胞的体内基因表达。同时，AngioTag TRAP 数据集中 cdh5、kdrl 等已知内皮特异基因高度富集，desma、neurog1 等非内皮基因被耗竭，印证了先前 RT-PCR 的结论。

图 4　TRAP 相比 FACS 显示出更强的内皮基因富集能力。A 样本：24 hpf AngioTag 转基因动物解离成细胞悬液，用于对 FACS 分选内皮细胞（样本 4）或未分选输入细胞（样本 3）的 mRNA 做 RNAseq。B 基于 A 图样本比较的内皮富集火山图。C FACS 分选内皮细胞样本 vs 全动物解离未分选细胞中，倍数富集最高的基因的前 20 个 GO 条目。其中仅 3 个（红色标注）代表内皮过程相关条目。D 样本：24 hpf AngioTag 动物 TRAP 纯化的内皮多聚核糖体 mRNA（样本 6，以其输入总 mRNA 样本 5 归一化）vs 24 hpf RiboTag mRNA 注射动物 TRAP 纯化的全胚多聚核糖体 mRNA（样本 2，以样本 1 归一化）。E 基于 D 图样本比较的内皮富集火山图。F TRAP 纯化内皮多聚核糖体 mRNA 样本中倍数富集最高的基因的前 20 个 GO 条目。其中 9 个（红色标注）代表内皮过程相关条目，而 FACS 组仅 3 个（对比 C 图）。G AngioTag TRAP-RNAseq（样本 6，以 5 归一化）相比 RiboTag TRAP-RNAseq（样本 2，以 1 归一化）中内皮特异基因的 log2 倍数富集与非内皮特异基因的耗竭。cdh5 与 kdrl 位于红色横线以上（内皮基因），gata2、sox17、gata1b、hbz、myh6a1、desma、neurog1、crybb1 位于蓝色横线以下（非内皮基因）。GO，基因本体论；BH，Benjamini-Hochberg 校正；log2FC，log2 倍数变化。

6. AngioTag 挖出全新的内皮基因（含功能验证闭环）

AngioTag TRAP-RNAseq 高度富集的基因绝大多数已有注释，且不少已知在内皮表达；但其中也包含此前从未报道在内皮表达的基因。对其中三个（exoc3l2a、slc22a7b.1、bpifcl）的原位杂交证实了其内皮特异的表达模式，提示这些基因可能参与血管发育。更引人注目的是，富集基因集还包含缺乏既往内皮相关报道的未注释基因——其中 4 个高度富集的基因内皮富集均超过 20 倍（log2 fold > 4）。整体原位杂交确认这 4 个基因均呈现高度内皮特异的表达模式，其中一个的表达基本局限于尾部血管丛的内皮。

为探究这些未注释基因的功能意义，我们用 CRISPR/Cas9 技术构建了 Gene B（ENSDARG00000076721）与 Gene C（ENSDARG00000098293）的定向突变。结果显示：纯合 76721^y587 突变体呈现尾部血管丛轻度扩张；纯合 98293^y588 突变体则表现出中脑与后脑血管生长减少。这些结果提示，本研究发现的 4 个全新未注释基因中，至少 2 个在早期血管发育中发挥作用。

图 5　TRAP-RNAseq 揭示了早期血管发育中表达的新型内皮基因。A AngioTag TRAP-RNAseq 数据集中三个「已有注释但此前未被认知为内皮表达」的富集基因。B A 图三个注释基因在 AngioTag TRAP-RNAseq（样本 6，以 5 归一化）相比 RiboTag TRAP-RNAseq（样本 2，以 1 归一化）中的 log2 倍数富集。C–E 24 hpf 野生型斑马鱼的整体原位杂交，分别探测 exoc3l2a（C）、slc22a7b.1（D）、bpifcl（E）。图像为整动物侧视图（C–D），或头部背视图并标示心脏染色（E）。F AngioTag TRAP-RNAseq 数据集中四个未注释的富集基因。G F 图四个未注释基因在 AngioTag TRAP-RNAseq（样本 6，以 5 归一化）相比 RiboTag TRAP-RNAseq（样本 2，以 1 归一化）中的 log2 倍数富集。H–O 24 hpf 野生型斑马鱼的整体原位杂交，分别探测未注释基因 A（H–I）、基因 B（J–K）、基因 C（L–M）、基因 D（N–O）。图像为整动物侧视图（H、J、L、N），并附躯干的高倍侧视图（I、K、M、O）。基因 B 的表达基本局限于尾部血管丛内皮（J–K）。dpf，受精后天数；RNAseq，RNA 测序。

图 6　未注释内皮基因的突变体具有血管表型。A 在 76721y587 突变体中，ENSDARG00000076721 基因的 5 bp 缺失引入提前终止密码子，导致蛋白从 316 个氨基酸截短至 78 个氨基酸。B–D 76721y587/+ 杂合互交的 3 dpf 胚胎共聚焦显微图：与野生型同窝幼鱼（B）相比，杂合子（C）与纯合突变体（D）均呈现尾部血管丛扩张。E 野生型、76721y587/+ 杂合子与 76721y587/y587 纯合突变同窝幼鱼的尾部血管丛高度比较。数值表示相对野生型的百分比变化（N = 41 野生型、58 杂合子、23 纯合突变）。F 在 98293y588 突变体中，ENSDARG00000098293 基因的 20 bp 缺失引入提前终止密码子，导致蛋白从 104 个氨基酸截短至 27 个氨基酸。G–I 3 dpf 野生型（G）与 98293y588/y588 纯合突变胚胎（G–I）的共聚焦显微图，显示突变胚胎头脑血管较野生型减少（白色箭头所指）。kdrl:GFP，kdrl 启动子驱动的 EGFP 报告（绿色）；bp，碱基对；*，Student t 检验 p ≤ 0.05；dpf，受精后天数；N，样本数。

关键结论

这是少见的「工具 → 全基因组发现 → 形态学验证」完整闭环的一篇工作——不只是提出一个方法，而是用该方法发现了新基因、再用基因编辑证明了这些基因真的影响血管发育。

7. 成年器官：不同组织的血管床，既有共性也有个性

除了发育中的血管，我们还想知道 AngioTag 能否揭示成年不同器官内皮转译组的组织特异性差异。我们对成年 AngioTag 转基因鱼 dissected 出的皮肤、肌肉、肝脏、心脏、脑分别做 TRAP-RNAseq，并以整条 AngioTag 鱼作对照。每种组织样本 3 个重复，每个重复含 4 条成年鱼的器官。在每个器官的 TRAP 拉下物相对其全器官总输入中，血管生成与血管形态发生均位居前十 GO 条目。

为找出所有血管床共有的内皮基因，我们将各器官内皮转译组与其器官转译组比较，寻找在各器官数据集中均显著富集的基因（log2 fold ≥ 1.2，padj ≤ 0.05）。如预期，我们看到了 kdrl、cdh5 及多个 Notch 通路成员的富集；数据还揭示了一些跨器官内皮富集但知名度较低的血管基因，包括 fgd5a、bcar1 以及本文的未注释基因 D。我们进一步做两步比较，筛选出在特定器官内皮中独有富集的基因，全组织合并得到 3304 个基因的列表。

与既往在小鼠单细胞测序中的报道一致，我们也发现内皮与周围细胞共享表达的组织特异基因：在肌肉中，预测编码溶酶体膜蛋白的清道夫受体 B 类成员 2b（scarb2b）在肌肉内皮细胞与肌纤维中均有表达，而 cav1 等其他基因则仅限于肌肉血管内表达。综上，AngioTag TRAP-RNAseq 在发育过程中与成年器官血管床的内皮基因表达谱分析中都非常高效。

图 7　AngioTag 的 TRAP-RNAseq 揭示不同器官血管床共有的血管特征与独特的基因表达谱。A 样本：成年 AngioTag 转基因鱼五个不同器官（皮肤、肌肉、肝脏、心脏、脑）及整鱼（whole fish, WF）的 TRAP 纯化内皮多聚核糖体 mRNA，均以其对应器官的输入总 mRNA 归一化。B 热图：展示整鱼（WF）与各器官血管床中共有的内皮富集基因，按其 log 转换归一化计数的基因层面 z-score 着色。图中展示了每个重复的 TRAP 拉下物（IP）与总器官 mRNA（input）。C–G 成年 Tg(kdrl:egfp)la116 转基因鱼共聚焦图像，结合 cdh5 的杂交链式反应（HCR）原位，显示皮肤（C）、肌肉（D）、肝脏（E）、心脏（F）、脑（G）血管中 kdrl（白色）与 cdh5（品红色）的表达。展示合并通道与仅 cdh5 通道。白色箭头标示 cdh5 转录本表达，黄色箭头标示血细胞自发荧光。H–K 各器官内皮 TRAP 拉下物相对其输入中特有富集基因的分布（每个器官的独特内皮基因谱）。L 肌肉组织中 scarb2b 在内皮与肌纤维中共表达，而 cav1 局限于肌肉血管内。IP，免疫沉淀；input，输入对照；HCR，杂交链式反应；z-score，标准化分数；WF，整鱼（whole fish）。

8. 通用化：UAS:RiboTag，想测哪个细胞就测哪个

AngioTag 的成功促使我们追问：这套方法能否推广到非内皮组织？为此我们构建了 Tg(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA)^y531（UAS:RiboTag） 转基因品系——只要存在对应的 Gal4 驱动系，即可在任意感兴趣的组织或细胞类型中驱动表达该 RiboTag 表达盒。该品系与多种 Gal4 驱动系杂交后均呈现强烈的组织特异性表达：肌肉特异的 Tg(xa210:gal4)^y241、内皮特异的 Tg(fli1a:gal4ff)^ubs4、神经特异的 Tg(huC:gal4)。

从这些杂交胚胎中 TRAP 分离 mRNA 显示，相应品系样本中组织特异基因强烈富集——内皮系中为 kdrl，神经系中为 snap25。值得注意的是，Tg(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA)^y531; Tg(fli1a:gal4ff)^ubs4 双转基因动物 TRAP 纯化 mRNA 中内皮特异基因 kdrl 的富集程度，与我们的 AngioTag 品系相当——说明 UAS:RiboTag 提供了同样有效的组织特异基因表达谱分析工具。

图 8　利用 RiboTag 报告者转基因品系，可用 TRAP 确定不同组织与细胞类型的基因表达。A Tol2(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA) RiboTag 报告者转基因结构示意图。B 绿色荧光显微照片：30 hpf Tg(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA)y531; Tg(xa210:gal4)y241 双转基因动物（肌肉特异）。C 绿色荧光显微照片：3 dpf Tg(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA)y531; Tg(fli1a:gal4ff)ubs4 双转基因动物（内皮特异）。D 绿色荧光显微照片：6 dpf Tg(uas:egfp-2a-rpl10a2xHA)y531; Tg(huC:gal4) 双转基因动物（神经特异）。E–G 从上述各杂交系胚胎 TRAP 分离 mRNA 的流程与结果：相应品系样本中组织特异基因强烈富集，内皮系中为 kdrl，神经系中为 snap25。UAS，Gal4 上游激活序列；Gal4/Gal4ff，酵母转录因子及其融合形式；dpf，受精后天数；hpf，受精后小时数；Tol2，Tol2 转座子。

三、讨论与意义

本研究引入了一条全新的 AngioTag 转基因品系，用于在未被扰动的内源环境中分析斑马鱼血管内皮细胞的全局基因表达，并通过 TRAP-RNAseq 完成了内皮转译组谱分析。方法学上最关键的一步，是把 AngioTag TRAP-RNAseq 与斑马鱼既有的 FACS 内皮表达谱做正面对照：无论从内皮相关 GO 条目的数量（9 vs 3）、已知内皮基因的倍数富集程度，还是应激诱导基因的普遍升高来看，TRAP 都给出了更接近「体内真实状态」的答案。

生物学层面，研究揭示了三类此前「看不见」的内皮信息：①新血管发育基因——3 个已有注释的新内皮基因与 4 个全新未注释基因（内皮富集超20 倍），其中 2 个经 CRISPR 敲除后确实验证出血管表型；②成年器官血管床的共性与个性——所有器官共有的 350 个内皮特征基因，以及各器官独有的 3304 个基因；③通用化能力——UAS:RiboTag 让这套方法从「内皮专用」变成「任意细胞类型可用」。

这项工作的方法学意义超出血管领域本身：任何需要「特定细胞类型原位表达谱」的研究，都可以考虑用 TRAP 替代 FACS——尤其是在研究应激、干细胞状态、肿瘤微环境等对解离操作敏感的课题中。当然 TRAP 也有其固有局限：它只能捕获正在翻译的 mRNA（不包含未翻译或降解中的转录本），且需要构建对应的转基因驱动系。但对于「翻译水平调控」这一维度而言，TRAP 恰恰给出了 FACS 无法触及的信息。

本文核心信息

1. 「装标签」比「分细胞」更能保住真相：给目标细胞表达带HA 标签的核糖体蛋白，直接从完整组织里抓「正在翻译的 mRNA」，全程只需几分钟——避免了 FACS 一个半小时解离带来的应激转录改变。

2. 内皮富集从 3 个 GO 条目提升到 9 个：同一批细胞、同一批测序，仅仅更换捕获方式，FACS 排第 3 的内皮相关条目在 TRAP 中依然存在且倍数更高，而另6 个内皮条目「解锁」。

3. 方法的价值由「发现—验证」闭环证明：TRAP 找到的 4 个全新内皮基因中，2 个经 CRISPR/Cas9 敲除后分别导致尾部血管丛扩张与脑血管减少——工具的产出是可被独立验证的生物学事实。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。