Stoddard M, Huang C, Enyedi B, Niethammer P

美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）｜ 康奈尔大学医学院

Scientific Reports, 2019, 9: 28　doi:10.1038/s41598-018-36771-9
收稿：2018-03-07　接受：2018-10-30　发表：2019

摘要

要原位研究组织损伤引起的早期免疫应答，需要适合血管内活体成像的动物模型。我们利用透明的斑马鱼幼鱼——先天免疫研究的有力动物模型——来测量白细胞向受损肝脏的募集。在肝脏特异性启动子驱动下表达硝基还原酶（NTR）的斑马鱼幼鱼，经甲硝唑（Mtz）浴处理后，肝脏在 24 小时内受到损伤，表现为氧化应激升高、肝脏形态扭曲、TUNEL 阳性细胞积聚，以及凋亡基因和抗氧化基因转录上调。受损肝细胞中的炎症基因转录被减弱。与以凋亡为主的特征一致，大量巨噬细胞被募集到 Mtz/NTR 损伤的肝脏中。相比之下，中性粒细胞的浸润变化更大且出现延迟，这与坏死较少以及受损肝细胞炎症能力减弱相符。

导言：为什么要「化掉」肝脏再拍一遍

要弄清楚"组织受伤之后免疫系统会发生什么"，最理想的办法是活体观察——而不是把细胞拿出来，放进培养皿里看。

斑马鱼幼鱼在这方面几乎是完美的实验对象：全身透明、体型微小、先天免疫系统高度保守，而且一次能获得成千上万条。这让研究者可以把白细胞的真实行为拍下来。

但长期以来，这类研究基本只用一个套路：切掉尾鳍，然后拍中性粒细胞怎么冲过去。问题在于，切尾鳍本质上是对外上皮屏障的机械性破坏。而真实的病理场景——缺氧、化学中毒、病毒感染——损伤的是身体内部的器官，皮肤完好无损。屏障被破坏和不被破坏，免疫反应能一样吗？

一、"化掉"肝脏：一套成熟的手术刀

研究肝脏损伤，肝脏作为解毒器官本身就常暴露于细胞毒性物质之下。除缺血再灌注和病毒性肝炎外，药物中毒（对乙酰氨基酚、乙醇过量）是人类肝损伤的主要原因。在斑马鱼中拥有一套"定点清除肝脏"的成熟工具：

NTR/Mtz 系统。原理分两步走：第一步，用肝脏特异性启动子 fabp10 驱动，让肝细胞表达细菌来源的硝基还原酶（NTR）蛋白。第二步，幼鱼泡在甲硝唑（Mtz）里——Mtz 本身无毒，但 NTR 会把它还原成细胞毒化合物，肝细胞随即死亡。整个过程时空可控：想在肝脏第 6 天开始损伤、持续 48 小时，掐指一算就行。

但问题在于：这套方法被用得很多，它造成的免疫后果却一直没人系统研究过。

二、先摆背景：坏死招中性粒细胞，凋亡招巨噬细胞

细胞损伤的类型随损伤刺激而变化。经典认知是：对乙酰氨基酚过量导致的肝损伤主要涉及肝细胞坏死；而病毒性肝炎主要涉及凋亡。

这两种死亡方式召唤的是不同的免疫细胞：

不同白细胞群被认为以不同方式促进损伤后的愈合、纤维化和再生。它们在这些过程中的确切机制贡献仍知之甚少。

所以，如果 NTR/Mtz 造成的到底是哪一类死亡、招来的是哪一类细胞，就成了使用这套模型的第一个前提问题。

三、损伤确实很"精准"

先确认这套系统好用：7 dpf（施加 Mtz 一天后）就能看到肝脏形态改变——肝血窦进行性破坏、细胞变圆、细胞间接触丧失、肝脏体积减小。

关键的两个对照实验：

1. 无NTR 表达的鱼泡在同样的 Mtz 浓度里——肝脏形态毫无变化。说明损伤确实来自 NTR 的酶活反应，不是药物副作用。

2. 除了肝脏体积减小和鱼鳔萎缩，整条鱼其他部位形态基本正常。组织选择性成立。

图 1　NTR/Mtz 系统在幼鱼斑马鱼肝脏中诱导选择性损伤。A 上：在肝脏中表达青色荧光 NTR 融合蛋白（图中鱼体蓝色区域）的转基因幼鱼示意图。下：实验时间线。黑色箭头/数字表示成像前鱼在 5 mM Mtz 或 DMSO 中的浸泡时长（12 h / 24 h / 36 h / 48 h）；蓝色箭头表示摄食窗口，成像前一天停止摄食以减少自发荧光。B 8 dpf 幼鱼肝脏的苏木精-伊红（H&E）染色。对照（左）与 Mtz 处理 48 小时（右）。虚线标示肝脏轮廓。损伤肝脏中的肝血窦结构明显紊乱，细胞排列松散。标尺，50 μm。C 双通道共聚焦成像。左列青色为 NTR-mTq2（肝细胞胞质），中列绿色为 PM2-eGFP（质膜），右列为两者合并的最大强度投影（MIP）。四行分别对应无/轻度、中度（24 h）、中度（48 h）、重度损伤。损伤推进时，肝细胞由规则的柱状排列变为圆缩、边界不清。标尺，50 μm；插图 10 μm。

四、伴随氧化应激，但只限于肝脏

用 CellROX Orange 活性氧探针检测，肝脏的氧化应激水平随损伤进程显著升高——从对照的接近零，到 24 小时的小幅上升，再到 48 小时的明显跃升（每肝脏约 10 个阳性细胞区室）。

作者还建立了一套三档损伤评分标准（无/轻度、中度、重度），把形态学量化，这个方法学细节对后续做 NTR/Mtz 研究的人很有参考价值。

图 2　NTR/Mtz 诱导的肝损伤与氧化应激相关。A 对照、24 h、48 h 三组斑马鱼肝脏的最大强度投影（MIP）。青色为 NTR-mTq2，红色为 CellROX 氧化应激染料。红色信号随损伤加重而明显增多。标尺，50 μm。B 按损伤评分（蓝：无损伤／绿：中度／红：重度）划分的各组幼鱼比例。随时间推移，重度损伤的比例从对照的 2% 升到 48 h 的 47%。柱内数字为各组动物数。C CellROX 活体染色的定量（纵轴为每肝脏的阳性细胞数）。方括号内为动物数，误差线为 SEM。***p < 0.0005。

五、核心发现：这是凋亡，不是坏死

作者用两种染料分别标记两类死亡：TUNEL 标记凋亡细胞（检测核 DNA 断裂），SYTOX Green 标记坏死细胞。结果一目了然：

暴露 24 小时后，TUNEL 阳性细胞（约 20→40 个/肝脏）明显多于 SYTOX Green 阳性细胞（始终在 0–5 个之间徘徊）。mRNA 测序也印证了这一点：凋亡相关基因 casp8、baxa、aifm2、aifm4 全部上调。

更有意思的是炎症信号本身：本该在坏死时爆发的炎症因子完全没有动静——il1b（由坏死介导的 DAMP 信号诱导的关键炎症细胞因子）和趋化因子 il8l1 表达均无显著改变；cxcl18b 以及补体级联基因反而是下调的。

同时，抗氧化基因大幅上调（prdx1、gsr、gstp1、txn），而抗炎酶 ptgr1（可使中性粒细胞趋化因子 LTB4 失活）表达量激增。整套分子特征指向同一个判断：这是一场以非炎症性凋亡为主的死亡。

图 3　NTR/Mtz 主要诱导凋亡和零星坏死。A TUNEL 染色（左中，红色）与 NTR-mTq2（青色）及合并图像（右）。右图为定量。24 小时即可见大量 TUNEL 阳性细胞，48 小时进一步增加。标尺，50 μm。B SYTOX Green 染色（坏死细胞，绿色）及合并图像与定量。绿色信号稀少且零星，与 A 中的红色信号形成鲜明对比——这正是"以凋亡为主、坏死为辅"的影像学证据。标尺，50 μm。**p < 0.005，***p < 0.0005。

图 4　NTR/Mtz 处理肝细胞中感兴趣基因的差异表达。从未受损或受损（48 h NTR/Mtz）斑马鱼肝脏中 FACS 分选出肝细胞进行 mRNA 测序。横轴为基因，纵轴为表达变化倍数（log2）。颜色分组一目了然：红色 = 凋亡基因（aifm2、AifM2、casp8、baxa，均为升高）；黄色 = 炎症基因（PTGR1、tpr1 大幅升高，而 c8a、cc8b、cfb、c3a 等向下）；绿色 = 抗氧化基因（gclm2、prdx1、gclm、gstp2、gsr、txn 普遍升高，prdx3、dntt 略降）；蓝色 = DNA 损伤基因（gadd45a、wee1、th53 升高）。所示为两次独立 mRNA 制备的平均值。

六、那么，谁被招来了？

既然死亡模式是凋亡为主，那么按理说该来的是巨噬细胞。作者也确实在 mpeg1:eGFP 报告品系中看到了强烈而早发的巨噬细胞募集——24 小时就大量涌入肝脏，而且这些巨噬细胞在主动吞噬变圆的、推测处于凋亡状态的肝细胞。

但中性粒细胞那边就有意思了。作者用了两个独立的报告品系：lysC 和 mpx。结果是：

· 24 小时、12 小时、18 小时，两个品系都没有显示显著的中性粒细胞募集（无论是否按肝脏体积归一化）。

· 48 小时，只有 mpx 品系显示严重受损肝脏中有一些中性粒细胞积聚，lysC 品系则没有。两个品系表现不一致，原因不明。

· 反常现象：在无 NTR 表达的情况下，仅仅 Mtz 孵育就使未受损肝脏中的中性粒细胞数量减少了约 50%。这"仅 Mtz"效应，恰好解释了为何损伤诱导后 12 小时反而看到肝脏中性粒细胞数量下降。而尾部造血龛的白细胞总数几乎没变，说明 Mtz 抑制的是募集而非中性粒细胞的总量或发育。

图 5　Mtz 诱导的肝损伤后的中性粒细胞募集。A lysC 中性粒细胞报告品系中，对照、24 h、48 h 三组肝脏的最大强度投影（MIP）。青色为 NTR-mTq2，红色为 PM2-mK2 标记的中性粒细胞。损伤后肝脏内并没有出现明显的中性粒细胞积聚。绿色箭头为完整中性粒细胞，白色箭头为红色荧光包涵体。标尺，50 μm。B 上：A 中框选区域的放大（红色包涵体与"细胞样"对象对比）。左下：lysC 中性粒细胞数量定量。各时间点均无显著升高。右下：红色荧光包涵体定量。C Mtz 暴露 24 小时的肝脏正交切片视图。白色箭头标示与肝细胞重叠的红色荧光包涵体。标尺，50 μm。D mpx 中性粒细胞报告品系的三组 MIP 图像，布局同 A。48 小时组损伤最严重。E 上：D 中框选区域放大。左下：mpx 中性粒细胞数量定量，48 小时组出现显著升高。右下：红色包涵体数量。F Mtz 暴露 48 小时的 lysC 品系肝脏正交切片视图。标尺，50 μm。*p < 0.05，**p < 0.005，***p < 0.0005。

关于图中反复出现的红色荧光包涵体，作者给出了谨慎的解释：它们可能代表被巨噬细胞吞噬的、来自死亡中性粒细胞的红色荧光膜碎片。但作者坦承——他们从未直接观察到中性粒细胞发生死亡或囊泡脱落，且 NTR/Mtz 处理并未显著增加肝脏内坏死中性粒细胞的数量。所以这个解释只能算假说，不能算结论。这种诚实标注不确定性的写法值得学习。

图 6　Mtz 诱导的肝损伤后的巨噬细胞募集。A mpeg1 巨噬细胞报告品系中，对照、24 h、48 h 三组肝脏的 MIP 图像。青色为 NTR-mTq2，绿色为 eGFP 标记的巨噬细胞。对照中巨噬细胞稀疏分布于肝外；24 小时组肝脏内部出现大量绿色信号，48 小时组同样显著。标尺，50 μm。B 上：A 中框选区域的放大。红色箭头标示一个正在被巨噬细胞包裹的变圆肝细胞——这是巨噬细胞吞噬凋亡肝细胞的直接影像证据。标尺，10 μm。下：巨噬细胞数量定量。24 小时组的巨噬细胞数量是对照的近 4 倍。***p < 0.0005。

七、结论与警示

研究发现小结

1. NTR/Mtz 通过诱导肝细胞凋亡（而非坏死）介导肝脏消融，很可能由细胞毒性氧化应激驱动。

2. 炎症应答是非炎症性的：il1b、il8l1 等不升高，cxcl18b 与补体级联基因反而下调，抗炎酶 ptgr1 大幅上调。

3. 巨噬细胞（而非中性粒细胞）是 NTR/Mtz 肝损伤的主要应答者，24 小时即大量募集并吞噬凋亡肝细胞。

4. 中性粒细胞早期无明显募集，仅在 48 小时后于部分品系中轻度积聚；且 Mtz 本身会抑制中性粒细胞募集。

5. Mtz 的抑制作用可能使损伤应答偏向促消退的巨噬细胞驱动模式。

这项研究最实用的价值，其实是一句提醒。使用 NTR/Mtz 系统做器官再生研究的人需要注意：药物本身（Mtz）就会影响免疫细胞的募集行为，而所募集免疫细胞的类型和数量会关键性地决定结局——是再生，还是纤维化。忽略这一层，可能得出完全相反的结论。

另一个衍生结论：这套模型非常适合用来研究巨噬细胞功能，比如凋亡细胞清除（efferocytosis）和 M1/M2 极化在肝脏再生中的作用。毕竟幼鱼斑马鱼的肝脏和哺乳动物一样具有高度再生性——而巨噬细胞的作用，正是在凋亡尸体发生继发性坏死并释放促炎信号之前把它们清除掉。

作者还提出了几个开放性问题：巨噬细胞如何从远处感知凋亡的肝损伤？细胞外 ATP 或磷脂酰丝氨酸外翻这类"寻找我"信号如何在长距离上起效？果蝇研究提示吞噬凋亡尸体能产生"先天免疫记忆"，那么斑马鱼肝脏中广泛发生的凋亡细胞清除，是否也会影响后续的抗感染能力？

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