Zhao S, Xia J, Wu X, Zhang L, Wang P, Wang H, Li H, Wang X, Chen Y, Agnetti J, Li Y, Pei D, Shu X

中国科学院广州生物医药与健康研究院 ｜ 中国科学技术大学

Nature Communications, 2018, 9: 2639　doi:10.1038/s41467-018-05105-8
收稿：2017-08-09　接受：2018-05-22　发表：2018

摘要

III 类磷脂酰肌醇激酶（PIK3C3）是一种负责生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）的酶，而 PI3P 是囊泡膜的关键组分。本研究报告，斑马鱼的 PIK3C3 缺失会导致肠道损伤与炎症。在pik3c3 突变体中，肠道管腔可以形成，但无法维持。基因表达分析显示，与屏障功能相关的 IBD 易感基因（e-cadherin、hnf4a、ttc7a）受到抑制，而炎症应答基因则被激活。组织学分析显示中性粒细胞浸润突变体的肠上皮，同时肠道菌群被清除。然而，肠道微生物似乎并非必需——在无菌条件下培养的突变体，其肠道缺陷与常规条件下的突变体相似。机制上，我们证明 PIK3C3 缺失抑制了 PI3P 的形成，并破坏肠上皮细胞中细胞连接蛋白的极性分布。这些结果不仅揭示了 PIK3C3 在肠道稳态中的作用，也提供了一个斑马鱼 IBD 模型。

导言：从 GWAS 位点到功能答案

炎症性肠病（IBD，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）是一类慢性炎症性疾病，全世界有数百万人受其困扰。它的核心问题出在肠道上皮的屏障功能——那层本该把肠道内容物和免疫系统隔开的"墙"一旦漏水，免疫细胞就会涌入并持续攻击自身组织。

过去十多年里，全基因组关联研究（GWAS）找到了 200 多个 IBD 遗传易感位点。但其中大部分基因究竟在肠道里做什么、缺失后会发生什么，一直缺乏答案。

这项发表在 Nature Communications 的研究给出了一个漂亮的答案：把斑马鱼的 PIK3C3（又称 Vps34）敲掉，小鱼就会长出完整的 IBD 症状——而且这个模型还出人意料地"干净"，连细菌都搅不乱。

一、肠道屏障：一道由细胞连接砌成的墙

肠道上皮的完整性由上皮细胞之间的细胞连接建立并维持，这是抵御肠道微生物屏障功能的基础。这种完整性的丧失，正是 IBD 的标志性特征。

动物模型中的遗传学研究已经鉴定出多个参与肠上皮稳态的基因，E-Cadherin 就是其中最关键的一个。在小鼠中特异性敲除 E-Cadherin（由 Cdh1 基因编码），会破坏肠道屏障功能，并诱导上皮细胞死亡和细菌清除能力缺陷。

另一个例子是 Hnf4a（肝细胞核因子 4α），一种参与肝脏、肠道等组织发育的上皮转录因子。在成年小鼠肠道中条件性敲除该基因，会导致紧密连接蛋白 ZO-1 下调、E-Cadherin 在细胞质中错误定位，以及细胞间连接稳定性下降。

耐人寻味的是，CDH1 与 HNF4A 都被 GWAS 鉴定为溃疡性结肠炎患者的易感基因。这意味着：实验室里敲掉的小鼠表型，与人类遗传学数据指向的基因，是同一批。

二、PIK3C3：一个"双面人"激酶

PIK3C3（又称 Vps34）是一种 III 类磷脂酰肌醇-3-激酶，催化由 PI 产生 PI3P。这个脂质分子是囊泡膜的关键组件——细胞内部所有"运输小泡"的身份证和交通枢纽。

有意思的是，PIK3C3 会和不同搭档组装成两个功能截然不同的复合物：

在小鼠中的研究已经显示，PIK3C3 在不同组织里肩负着完全不同的使命：全身敲除会导致胚胎致死；感觉神经元中特异性删除会引起神经元退化；肌肉中删除会引发肌营养不良；足细胞中删除会导致肾小球硬化。

但有一个领域，PIK3C3 的功能此前完全空白——肠道稳态与先天免疫。这正是本文要填补的缺口。

三、结果一：肠道"塌陷"了

研究者用 CRISPR/Cas9 建立了 pik3c3 敲除斑马鱼品系，获得了两个缺失等位基因（−19 bp 和−2 bp）。杂合胚胎发育正常且可育，但纯合突变体在受精后 10 天内全部死亡。

表型的关键在于一个时间差：7 dpf 时突变体肠道结构看起来完全正常；可到 8 dpf，肠腔就塌了。消化功能的活体荧光检测也印证了这一点——吞咽、脂质消化、蛋白消化三项指标在 7 dpf 全部正常，8 dpf 全面崩盘。

图 1　pik3c3 突变体中的肠道缺陷。a 野生型（WT）与 pik3c3 突变体在 8 dpf 的整体形态。突变体表现出身体弯曲和肠道塌陷。b 使用荧光报告物对斑马鱼消化器官进行体内成像。FITC 标记的葡聚糖用于评估营养物质摄取活性；淬灭荧光报告物 PED6 或 Enzchek 只有在被肠道磷脂酶或蛋白酶切割后才会被激活。7 dpf 时突变体的消化功能表现正常，而 8 dpf 时出现缺陷。标尺，500 μm。c 7–8 dpf 胚胎中肠球（intestinal bulb）或中肠对应位置的横切面苏木精-伊红染色。突变体在 8 dpf 时失去了典型的肠道褶皱，并可检测到细胞脱落。标尺，50 μm。d 肠上皮细胞（IEC）的透射电镜（TEM）分析。突变体中黏着连接（箭头）存在缺陷；8 dpf 时微绒毛和细胞连接被严重破坏。标尺，1 μm。

电镜结果把矛头精准指向了细胞连接：7 dpf 时突变体的 IEC 仍呈柱状、微绒毛正常，但黏附带已经是坏的；到 8 dpf，微绒毛崩溃，黏着连接几乎完全检测不到。

四、结果二：不是发育失败，而是"维持失败"

RNA-Seq 分析揭示了一处很有意思的细节：肠道标志基因（fabp2、vil1、slc15a1b）在突变体中确实下调，但它们在 6 dpf 时已被充分诱导，此后才逐渐走低。

这个时序排除了两种简单解释：不是"肠道细胞一开始就没被正确指定"，也不是"小鱼整体发育迟缓"。真正的问题是——肠道建好了，但维持不住。

图 2　pik3c3 突变体中缺陷的基因表达。a 6–8 dpf 突变体与对照同窝幼鱼的 RNA-Seq 分析。代表性热图显示三类基因的表达：细胞外基质相关基因（左）、肝脏和肠道代谢基因（中）、内胚层衍生细胞谱系标志物（下）。蓝色代表表达下调。b 整体胚胎匀浆中指定基因的 qRT-PCR。蓝色为 WT、红色为突变体。注意 vil1 和 fabp2 在 6 dpf 时 WT 与突变体几乎无差异，到 8 dpf 才出现显著分离；而胰腺标志物 ins 全程无差异。c 8 dpf 胚胎的原位杂交。红色箭头指向肠道，黑色箭头指示胰腺——肠道信号减弱，胰腺信号不变。

五、结果三：中性粒细胞"集结"

促炎基因的热图显示，炎症在 6 dpf 就已启动，8 dpf 达到峰值。qPCR 证实了 tnfa、il1b、cxcl8a、lect2l、mmp9 和 mpx 的全面激活。

但这些数据只说明"发生了炎症"，不告诉你是谁来了、来了多少。作者用谱系标记的转基因鱼系回答了这个问题：8 dpf 时中性粒细胞在突变体消化道中大量富集，横切面上能清楚看到它们钻进肠上皮。而巨噬细胞的分布则完全正常。

为排除"中性粒细胞本身有问题"的可能，作者检测了它们的迁移能力——对尾鳍切割的趋化迁移、以及炎症消退期的反向迁移都正常。所以中性粒细胞是被正常召来的，但召来之后走不掉了。

图 3　pik3c3 突变体肠道中的促炎应答。a 炎症相关基因热图，显示突变体中炎症应答从 6 到 8 dpf 逐步激活（红色代表上调）。b 指定炎症相关基因的 qRT-PCR。cxcl8a 是 IL8 的斑马鱼同源基因。c, d mpx:GFP 转基因鱼系用 GFP 标记中性粒细胞。8 dpf 突变体中，中性粒细胞（绿色）主要积聚于消化道区域。标尺，500 μm / 50 μm。e D8 胚胎肠球的横切面（红色为F-actin，蓝色为细胞核）。突变体中可清楚看到中性粒细胞（绿色）浸润肠上皮。标尺，50 μm。f mpeg1:GFP 标记的巨噬细胞谱系细胞在突变体中分布正常。标尺，500 μm。g 解剖肠道中 IBD 候选基因的表达。炎症基因（il1b、card9、mmp9）和 igfbp1a 显著上调；屏障基因 hnf4a、ttc7a 严重下调；hp（zonulin，可打开紧密连接）上调。而细菌感知相关基因 nod2、atg16l1、irgm 未被诱导。

六、结果四：最有说服力的一组对照

这项研究设计得最漂亮的部分，是一个无菌对照实验。

逻辑是这样的：既然 IBD 涉及菌群，那么"敲掉 PIK3C3 导致炎症"这件事，到底需不需要细菌参与？如果把细菌全部去掉炎症照样发生，那说明问题出在宿主自身；如果炎症消失，说明是菌群驱动的。

结果是：无菌条件下，炎症照样发生，而且更强烈。中性粒细胞照样在消化道积聚。肠道微生物根本不是这件事的必要条件。

更有意思的是反方向的结果：在标准培养条件下，突变体的肠道细菌从野生型的 2754 CFU/肠道暴跌到几乎测不到的水平。也就是说，这场失控的炎症反过来把肠道菌群给清空了——炎症是"果"，菌群消失是"果"，而不是反过来。

图 4　肠道微生物并非 PIK3C3 缺失诱导炎症所必需。a 标准与无菌培养条件下 8 dpf 胚胎中指定基因的 qRT-PCR 散点图。每个点代表单枚胚胎三次技术重复的均值。关键点：在无菌条件下（右侧两组），突变体的 tnfa、il1b、cxcl8a、mmp9 依然显著升高——炎症不依赖细菌。b 无菌培养条件下，中性粒细胞（绿色）依然积聚于突变体的消化道。标尺，500 μm。c 标准培养条件下单个胚胎肠道匀浆中的细菌数量。6、7 dpf 时野生型与突变体相似；8 dpf 时突变体的细菌数量几乎归零（纵轴为肠道 CFU）。

七、结果五：机制拆解

为追踪 PIK3C3 的作用链，作者构建了表达 PI3P 特异性探针 2xFYVE-GFP 的转基因鱼系。结果非常清楚：突变体的肠上皮细胞中，PI3P 阳性囊泡几乎消失；而同一只鱼的体节肌肉中，6 dpf 时信号还正常，7–8 dpf 才下降。

这个对照说明：PIK3C3 确实是肠上皮细胞里 PI3P 的主导生产酶，而肌肉里还有其他 PI3K 家族成员在补位。

图 5　突变体 IEC 中 PI3P 阳性囊泡减少。a 在泛素启动子控制下表达 PI3P 探针 2xFYVE-GFP 的转基因斑马鱼代表性图像（Sh，盾状期）。b 6–8 dpf 胚胎横切面。野生型肠上皮细胞中可清楚看到 GFP 阳性囊泡（箭头）；突变体中信号微弱且弥散。标尺，20 μm。c 体节横切面中的 PI3P 阳性囊泡（对照组织）。标尺，20 μm。d (b, c) 的定量：肠道（上）与体节（下）中囊泡数量。注意体节在 D6 时无显著差异，D7、D8 才出现下降。

核心机制：E-Cadherin 去哪儿了？

PI3P 是参与膜蛋白内体运输的脂质。它一消失，质膜蛋白的极性分布就乱了。作者的免疫荧光结果非常有说服力：

在野生型中，柱状的肠上皮细胞排列整齐，E-Cadherin 沿着细胞侧壁均匀分布，像一道连续的"拉链"。而在突变体中，细胞排列散乱，细胞表面的 E-Cadherin 大幅减少，取而代之的是细胞内部堆积成团的 E-Cadherin 聚集体。

两个细节让结论更硬：这些聚集体不与溶酶体标志物 LAMP1 共定位（所以不是被降解掉了）；而且总蛋白水平和mRNA 水平都正常（所以不是表达出了问题）。

换句话说，E-Cadherin 蛋白被正常制造出来了，但送不到该去的地方。这是一次纯粹的运输失败。

图 6　PIK3C3 缺失诱导 IEC 的极性缺陷。a 8 dpf 肠道横切面的免疫荧光。绿色为 E-Cadherin，红色为 F-actin 或 LAMP1，蓝色为细胞核。WT 行：柱状细胞排列成片，E-Cadherin 呈侧向连续分布；MU 行：细胞排列紊乱，E-Cadherin 被内吞并在胞内形成聚集体（绿色团块）。LAMP1（红色）与聚集体不共定位，说明未被溶酶体降解。极性蛋白 ATP1A1 和紧密连接蛋白 ZO-1 同样失去极性分布。标尺，20 μm。b E-Cadherin 与 ZO-1 的 Western blot：E-Cadherin 总量不变，但 ZO-1 明显减少。c cdh1 与 zo-1 的 mRNA 水平（无显著差异）。d siRNA 敲低 PIK3C3 的效率验证。e, f 人Caco2 细胞 3D 囊泡模型：敲低 PIK3C3 后，出现 E-Cadherin 内化的囊泡比例从 8% 升至 42%（p = 0.005）。g 敲低后 E-Cadherin 蛋白总量同样不变。这套人体细胞模型完全复现了斑马鱼的表型。

Caco2 细胞实验排除了一个关键干扰：斑马鱼肠道里既有极性缺陷、又有炎症，谁先谁后？在没有任何免疫细胞的纯培养体系里，只敲低 PIK3C3，E-Cadherin 的内化照样发生。所以极性缺陷是独立于炎症的直接后果。

那么，是自噬还是内吞运输？

PIK3C3 的两条复合物通路——自噬（ATG14）与内吞运输（UVRAG）——哪一个才是真凶？

Western blot 显示自噬标志物 LC3B-II 在野生型和突变体之间没有差异，自噬通路是清白的。而在 Caco2 模型中，敲低 UVRAG 能重现表型，敲低 ATG14 不能。答案是内吞运输通路。

图 7　内吞运输缺陷是 PIK3C3 缺失诱导极性缺陷的原因。a 解剖肠道的 LC3B Western blot。D6、D7、D8 三个时期，WT 与突变体的自噬标志物 LC3B-II 水平均无差异——说明自噬不是原因。b siRNA 对 UVRAG 和 ATG14 的敲低效率。c, d Caco2 囊泡的 E-Cadherin 免疫荧光与腔形成异常定量。敲低 UVRAG 导致异常的"双腔"结构（约 40%），敲低 ATG14 无此现象。e, f 内质网应激标志物hspa5 的表达与免疫荧光。注意：突变体中 HSPA5 主要在肝脏（箭头）表达，肠道中仅限少数细胞；而衣霉素（tunicamycin，内质网应激诱导剂）处理的野生型胚胎则在肝脏和肠道都强烈诱导——两种模式明显不同，说明内质网应激不是主因。

八、这套通路在进化上高度保守

这项研究还有一个漂亮的收尾。E-Cadherin 的囊泡运输在 MDCK 等上皮细胞系中早已被研究得相当清楚：泛素化的 E-cadherin 要么经 Rab5/Rab7 通路送去溶酶体降解，要么经 Rab11 介导的再循环通路回到基底外侧膜。

本文把这条线索往前推了一步：在斑马鱼肠上皮和人体 Caco2 细胞中，PIK3C3 → PI3P → UVRAG 复合物 → E-Cadherin 再循环这条轴是完整打通的。这条通路从果蝇到斑马鱼再到人类类器官都存在。

更值得注意的是它的治疗潜力：近期有研究发现，酿酒酵母（Saccharomyces boulardii）CNCM I-745 上清液能通过 Rab11A 依赖通路刺激 E-Cadherin 的表面运输，并在 IBD 患者中恢复肠道屏障功能。这为"操纵这条运输通路治疗 IBD"提供了直接的希望。

九、机制总结

一条完整的因果链

1. PIK3C3 缺失 → 肠上皮细胞中 PI3P 合成不足

2. PI3P 不足 → UVRAG 复合物介导的内吞运输受阻（自噬通路正常）

3. E-Cadherin 无法正常再循环回细胞表面 → 在胞内错误聚集（表达量不变）

4. 上皮细胞连接与极性结构破坏 → 屏障功能崩溃，紧密连接蛋白 ZO-1 降解

5. 屏障破损 → 中性粒细胞持续浸润，炎症无法消退

6. 炎症失控 → 反过来清除肠道菌群（但菌群并非炎症的起因）

这条链条最漂亮的地方在于它的可干预性：如果阻断的是"炎症→菌群"这一步，那意味着面对 IBD 患者，也许控制炎症本身就是保护菌群；而如果能找到恢复 E-Cadherin 运输的小分子，理论上可以在炎症启动之前就把屏障修好。

十、这项研究的价值

1. 填补了 GWAS 位点的功能空白。IBD 领域已有 200 多个易感位点，但大部分基因功能不明。本文提供了一个可以完整解析的范本——从位点到基因功能，再到细胞机制。

2. 提供了一个高保真的 IBD 模型。pik3c3 突变体同时具备：屏障缺陷、炎症细胞浸润、菌群变化、类 IBD 基因表达谱——而且表型稳定、遗传背景清晰、可批量繁殖。

3. 验证了跨物种的保守性。斑马鱼、Caco2 细胞，甚至果蝇，都指向同一条通路。这大幅提升了该机制作为药物靶点的可信度。

4. 提示了一个反直觉的治疗思路。既然炎症会清空肠道菌群，那么"用抗生素杀菌"可能恰恰是 IBD 治疗中的一条歧路。

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