Peixian Huang、Yiqing Yang、Junwei Lian、Tao Yu、Gaofei Li、Yiyue Zhang

华南理工大学医学院 · 广东省人民医院 · 深圳北理莫斯科大学医学中心 · 大湾生物医药创新中心

Journal of Genetics and Genomics (2025)　doi:10.1016/j.jgg.2025.04.012
收稿 2024-11-20　修回 2025-04-17　接收 2025-04-17

摘要

斑马鱼肠道炎症中，IL-22 先把中性粒细胞「招」到肠道，随后这些中性粒细胞通过 TGF-β 通路把 Mmp9 大量分泌出来，最终由 Mmp9 亲手拆掉肠上皮屏障——中性粒细胞由「治病的守卫」变成了「破墙的拆迁队」。这条 IL-22 → 中性粒细胞富集 → TGF-β → Mmp9 → 屏障破坏 的链条，为炎症性肠病提供了全新的干预靶点。

核心要点

1. DSS（硫酸葡聚糖）可成功诱导斑马鱼幼鱼结肠炎：肠道评分升高、肠道缩短、ZO-1 紧密连接蛋白下调，葡聚糖荧光由肠道内扩散至全身。

2. 肠道转录组提示 il22 是 DSS 后显著升高的关键细胞因子；敲低 il22 显著缓解结肠炎，并抑制中性粒细胞在肠道的富集。

3. 关键限定：IL-22 只驱动肠道内的中性粒细胞富集，对尾部的中性粒细胞增多无影响——说明这条通路具有明确的组织特异性。

4. 对分选出的中性粒细胞做 RNA-Seq，KEGG 指向 TGF-β 信号通路；用选择性抑制剂 SIS3 阻断 TGF-β 可缓解结肠炎，且不改变中性粒细胞数量——提示 TGF-β 位于中性粒细胞「下游」发挥作用。

5. GO 分析指向细胞外基质重塑；mmp9 是中性粒细胞中表达最高的 mmp 家族成员。IL-22 与 TGF-β 均可上调 Mmp9 蛋白。

6. mmp9 突变体的肠屏障在 DSS 后被显著保护，且中性粒细胞数量不变——最终锁定「中性粒细胞来源的 Mmp9」是真正执行屏障破坏的分子。

一、引言：IBD 里，中性粒细胞到底扮演什么角色？

炎症性肠病（IBD）由一组异质性的肠道慢性炎症性疾病构成。目前的治疗策略主要着眼于维持缓解、减轻继发影响，而并未真正逆转其致病机制。IBD 的发病过程涉及肠屏障功能障碍、组织损伤，以及固有免疫与适应性免疫的失衡。

已有报道指出 IBD 中中性粒细胞活性升高，但它们在疾病进展中的确切作用与机制仍未阐明。由于斑马鱼与哺乳动物之间高度保守，斑马鱼已成为研究 IBD 机制的重要模型；此前已有用 DSS 在斑马鱼幼鱼和成鱼中建立 IBD 模型的报道。本研究即从这一模型入手，聚焦「中性粒细胞如何破坏肠屏障」这一关键问题。

二、结果

1. 先建模型：DSS 能在斑马鱼幼鱼中诱导结肠炎

我们首先在受精后 3 至 7 天（dpf）的斑马鱼幼鱼中测试不同浓度的 DSS，确定 0.65% 是不引起显著死亡的最高浓度。随后采用既有的 0–5 级肠道评分系统评估损伤：DSS 处理后肠道评分显著升高、肠道长度缩短，提示出现广泛的肠道损伤。

葡聚糖（dextran）灌流检测进一步证实了屏障破坏：屏障完整时葡聚糖信号局限于肠道内，而 DSS 处理后扩散至整个幼鱼体内。此外，DSS 显著降低了紧密连接蛋白 ZO-1 的表达；RT-qPCR 也确认促炎因子（il1b、il6、tnfa）与抗炎因子（il4、il10）表达升高。至此，DSS 诱导斑马鱼结肠炎的模型建立成功。

图 1A–B　DSS 处理后斑马鱼肠道中 il22 表达显著升高。A 热图：基于肠道 RNA-Seq，对比 Vehicle 组与 DSS 组中 il22 的表达谱。色标表示相对表达量区间（−1 至 1.5）。DSS，硫酸葡聚糖；dpf，受精后天数；MO，吗啡啉反义寡核苷酸。数据以均值 ± 标准差表示。

图 1C–D　敲低 il22 可挽救 DSS 造成的肠屏障破坏。C 共聚焦图像：7 dpf 时，il22-MO 注射或 DSS 处理组及其相应对照的肠道葡聚糖分布。红色为葡聚糖信号，白色虚线勾勒肠道轮廓。D C 图框选区域内葡聚糖总荧光面积定量（n = 10）。Vehicle 与 il22-MO 组之间无显著差异（NS），DSS 组显著升高，而 il22-MO + DSS 组显著低于 DSS 组。两组比较采用双尾非配对 t 检验，多组比较采用单因素方差分析 + Tukey 事后检验。**，P < 0.01；NS，无显著差异。比例尺，100 μm。

2. 转录组锁定关键因子：肠道中 il22 显著升高

为阐明该模型的机制，我们对肠道进行了 RNA-Seq。样本间距离热图显示组间差异明显大于组内差异，说明重复性良好。GO 分析将 DSS 诱导的高表达基因关联到炎症反应、白细胞迁移、中性粒细胞趋化与中性粒细胞迁移。其中，il22 是炎症反应相关基因中表达量最高的细胞因子之一——这使它成为潜在的「中性粒细胞诱导因子」候选。RT-qPCR 证实 DSS 后肠道 il22 表达升高，同时肠道内中性粒细胞数量增加。

3. 敲低 il22 同时缓解结肠炎并减少中性粒细胞富集

为解析 il22 的作用，我们用吗啡啉反义寡核苷酸（MO）敲低该基因以阻断 IL-22 翻译。为验证效率，我们构建了携带 MO 靶序列的 CMV 启动子驱动 eGFP 报告质粒：与 il22-MO 共注射后，1 dpf 与 7 dpf 时荧光几乎不可检测，证实 MO 效率很高。随后将幼鱼随机分为 Vehicle、il22-MO、DSS、il22-MO + DSS 四组。

结果显示，DSS 升高肠道评分，而 il22 敲低可缓解这一效应；DSS 使相对肠道长度缩短，il22-MO 可将其恢复；DSS 后葡聚糖信号弥漫至全身，而 il22-MO + DSS 组该现象显著减轻。ZO-1 表达的下降同样被 il22-MO 逆转。苏丹黑 B（SB）染色进一步表明，il22-MO 显著抑制了 DSS 后的中性粒细胞富集。为验证 MO 数据，我们还使用了 il22-crisprants（基于 CRISPR 的 G0 瞬时敲除，设计 4 条 sgRNA 且效率验证良好）：同样观察到中性粒细胞与 IBD 表型被救援，与 il22-MO 效应一致。

图 1E–F　敲低 il22 抑制 DSS 诱导的肠道中性粒细胞富集。E SB 染色：7 dpf 时，il22-MO 注射或 DSS 处理组及相应对照的肠道中性粒细胞（黑色沉积）。F E 图肠道中性粒细胞计数定量（n = 20）。Vehicle 与 il22-MO 组无显著差异（NS）；DSS 组显著升高；il22-MO + DSS 组显著回落。两组比较采用双尾非配对 t 检验，多组比较采用单因素方差分析 + Tukey 事后检验。**，P < 0.01；NS，无显著差异。比例尺，200 μm。

小结：il22 是「把中性粒细胞招进肠道」的信号

两条独立的干预路径（MO 敲低与 CRISPR 敲除）一致表明：肠道 il22 既是结肠炎严重程度的驱动因素，也是中性粒细胞肠道富集的必要条件。

4. 关键的组织特异性：IL-22 只管肠道，不管尾巴

我们进一步追问 IL-22 是否引起全身性中性粒细胞增多。RT-qPCR 显示 DSS 后 il22 在肠道及其他组织中均升高，但肠道中的水平显著更高。同时，尾部中性粒细胞在 DSS 后同样增多，而这种增多不被 il22-MO 影响。由此可见，DSS 虽可诱导全身性中性粒细胞富集，但 IL-22 专门、且仅仅诱导肠道内的中性粒细胞富集。

5. 中性粒细胞缺失即屏障恢复：他们确实是「元凶」

为在缺乏中性粒细胞的情况下评估 IBD 表型，我们使用了中性粒细胞缺陷品系 cebp1−/−。葡聚糖检测显示，cebp1−/− 幼鱼的肠屏障完整性得到恢复，证实中性粒细胞在 IBD 中具有明确的损害作用。

随后，我们对中性粒细胞本身进行 RNA-Seq：将可标记中性粒细胞的 Tg(mpx:eGFP) 胚胎注射 il22-MO、经 DSS 处理后分选出中性粒细胞进行测序。KEGG 分析将 il22-MO + DSS 组相对 DSS 组下调的基因关联到 TGF-β 信号通路。组织层面验证显示，DSS 显著提高肠道中 p-SMAD3 与 TGF-β1 的表达，而 il22-MO 注射可缓解这一效应。这些结果表明：IL-22 在中性粒细胞中激活了 TGF-β 信号通路。

图 1G　中性粒细胞 RNA-Seq 的实验流程示意图。

在 0 dpf 注射 il22-MO 的 Tg(mpx:eGFP) 胚胎中，3 dpf 起接受 DSS 处理至 7 dpf；随后制备细胞悬液，经 FACS 分选出 GFP 阳性的中性粒细胞，用于 RNA-Seq 测序。

图 1H　KEGG 分析：IL-22 缺失后中性粒细胞中下调基因富集于 TGF-β 信号通路。

气泡图比较 il22-MO + DSS 组与 DSS 组中性粒细胞中下调基因的通路富集情况。横轴为富集比例（Pathway analysis），气泡大小代表基因数（Count），颜色对应 −log₁₀(P value)。TGF-beta signaling pathway 为最显著富集通路。

6. 阻断 TGF-β 通路可缓解结肠炎，且不减少中性粒细胞

为检验中性粒细胞中 TGF-β 通路的作用，我们使用了选择性 TGF-β 抑制剂 SIS3。SIS3 处理几乎未引起畸形或死亡，提示副作用极小。为验证其有效性，我们检测了中性粒细胞中 TGF-β 靶基因（id2a、id2b）的表达：DSS 显著上调二者，而 SIS3 在 DSS 处理组与对照组中均抑制其表达，确认 TGF-β 抑制有效。

在 IBD 表型上，SIS3 处理显著降低结肠炎严重程度（肠道评分与相对肠道长度均改善），SIS3 + DSS 组的屏障完整性优于单独 DSS 组，ZO-1 表达亦显著升高。关键的是，SIS3 处理后肠道中性粒细胞数量保持不变。这一「表型改善但细胞数量不变」的组合，说明 TGF-β 通路的作用位于中性粒细胞内部、位于其数量变化的下游。

图 1I–J　TGF-β 抑制剂 SIS3 改善 DSS 造成的肠屏障破坏。I 共聚焦图像：7 dpf 时，SIS3 或 DSS 处理组及相应对照的肠道葡聚糖分布。红色为葡聚糖信号，白色虚线勾勒肠道轮廓。J I 图框选区域内葡聚糖总荧光面积定量（n = 10）。Vehicle 与 SIS3 组无显著差异（NS）；DSS 组显著升高；SIS3 + DSS 组显著低于 DSS 组。两组比较采用双尾非配对 t 检验，多组比较采用单因素方差分析 + Tukey 事后检验。**，P < 0.01；NS，无显著差异。比例尺，100 μm。

7. 效应分子锁定 Mmp9：细胞外基质重塑是真正的破坏者

对 il22 敲低后的中性粒细胞 RNA-Seq 进一步做 GO 分析，显示下调基因关联到创伤愈合、细胞外基质组织、细胞外结构组织。在细胞外基质相关条目中，多个 mmp 家族基因在 il22-MO 注射后下调。测序数据进一步表明，mmp9 在中性粒细胞中的表达远高于其他 mmp 家族成员，且在中性粒细胞中的表达远高于其他细胞类型——提示中性粒细胞是 Mmp9 的主要来源。

蛋白水平验证显示：DSS 处理后 Mmp9 蛋白水平显著升高，il22-MO 可抑制这一升高；TGF-β 抑制同样使 Mmp9 表达显著下降。至此通路链条完整闭合：IL-22 → TGF-β → Mmp9，IL-22/TGF-β 轴通过增强中性粒细胞中的 Mmp9 表达发挥作用。

图 1K　GO 分析：下调基因富集于创伤愈合与细胞外基质重塑过程。

比较 il22-MO + DSS 组与 DSS 组中性粒细胞中下调基因的生物学过程（Biological process）富集情况。Extracellular structure organization 与 Extracellular matrix organization 显著富集，指向细胞外基质重塑这一潜在损伤机制。

8. 最终验证：mmp9 突变体的肠屏障被成功保护

为直接检验中性粒细胞来源 Mmp9 的作用，我们构建了 mmp9 突变斑马鱼品系，其 Mmp9 蛋白水平显著降低。将同窝野生型（sibling）与 mmp9 突变体一同接受 DSS 处理。在无 DSS 条件下，突变体的肠道评分、相对肠道长度、屏障完整性与 ZO-1 表达均无显著改变——说明 mmp9 缺失本身不会自发性造成肠道异常。

而在接受 DSS 处理后，mmp9 突变体的肠屏障完整性得到显著恢复，同时肠道中性粒细胞数量保持不变。综合以上证据：中性粒细胞来源的 Mmp9 是执行肠屏障破坏的关键效应分子——它既不改变中性粒细胞的「数量」，也不在无炎症时造成损伤，唯独在 DSS 诱导的炎症背景下成为屏障崩塌的直接执行者。

图 1L–M　mmp9 突变体在 DSS 处理后肠屏障完整性得到保护。L 共聚焦图像：7 dpf 时，同窝野生型（Sibling）与 mmp9−/− 突变体在 Vehicle 或 DSS 处理下的肠道葡聚糖分布。红色为葡聚糖信号。M L 图框选区域内葡聚糖总荧光面积定量（n = 10）。Sibling 与 mmp9−/− 在 Vehicle 条件下无显著差异（NS）；DSS 后野生型显著升高，而 mmp9−/− + DSS 组显著低于野生型 + DSS 组。两组比较采用双尾非配对 t 检验，多组比较采用单因素方差分析 + Tukey 事后检验。**，P < 0.01；NS，无显著差异。比例尺，100 μm。

关键结论

三个层次的证据（il22 敲低→缓解；TGF-β 抑制→缓解但中性粒细胞数量不变；mmp9 突变→屏障被保护且中性粒细胞数量不变）层层递进，共同指向同一条因果链。

三、机制模型

综上，在斑马鱼 IBD 模型中，由 IL-22 富集于肠道的促炎中性粒细胞，通过 IL-22/TGF-β/Mmp9 轴介导了肠屏障破坏。完整机制可概括为五个环节：

1. DSS 损伤肠道，引发局部炎症与屏障通透性升高；

2. 肠道上皮释放 IL-22，在肠道局部特异性富集中性粒细胞；

3. 中性粒细胞内 TGF-β 信号被激活（p-SMAD3、TGF-β1 升高），SIS3 阻断即缓解症状；

4. TGF-β 驱动 Mmp9 大量表达，中性粒细胞成为 Mmp9 的主要来源；

5. Mmp9 降解细胞外基质与紧密连接结构，肠屏障崩塌，葡聚糖外泄。

图 1N　中性粒细胞破坏斑马鱼 IBD 模型肠屏障的机制模型。

DSS 处理诱导斑马鱼肠道炎症；IL-22 促使中性粒细胞在肠道中富集（Increase Neutrophil）；这些中性粒细胞通过 Smad2/Smad3/Smad4 依赖的 TGF-β 信号通路诱导 mmp9 表达上升；分泌至胞外的 Mmp9 降解上皮细胞间的连接结构，最终导致 Damage（屏障损伤）。

四、讨论：这项研究告诉了我们什么？

本研究首次在斑马鱼 IBD 模型中完整勾勒出 IL-22 → 中性粒细胞 → TGF-β → Mmp9 → 肠屏障破坏 的致病链条，为 IBD 的治疗提供了新思路。

一个值得玩味的「双重角色」问题：已有研究报道 IL-22 能在小鼠中改善 IBD，机制可能包括诱导肠道干细胞或 Paneth 细胞再生。而本研究揭示，在斑马鱼模型中，IL-22 却会通过招募中性粒细胞而加重组织损伤。这提示 IL-22 的作用高度依赖细胞类型与组织微环境：在中性粒细胞主导的炎症场景下，它是「帮凶」而非「保护者」。

从机制上看，中性粒细胞本身并非「坏细胞」——它们通过吞噬病原体、形成细胞外诱捕网（NET）等方式调控炎症。但它们也会产生包括 MMP 在内的蛋白水解酶。本研究清晰地表明，正是中性粒细胞来源的 Mmp9，在 IL-22/TGF-β 轴的驱动下成为肠道屏障的破坏者。这也提示干预策略应转向「细胞内信号传导」与「下游效应酶」两个层面，而非简单地完全清除中性粒细胞——后者可能损害宿主必要的防御功能。

本文核心信息

1. IL-22 在肠道中是「危险信号」：它不直接损伤组织，而是通过富集中性粒细胞间接致病，且作用具有严格的肠道特异性。

2. 中性粒细胞数量不变，毒性照样发挥：SIS3 与 mmp9 突变均在「中性粒细胞数量不变」的前提下改善屏障，说明杀伤力来自细胞内的分子程序，而非细胞的数量。

3. IL-22/TGF-β/Mmp9 是潜在治疗靶点：阻断链条上任一环节（IL-22、TGF-β、Mmp9）都能显著缓解结肠炎，为 IBD 治疗提供了明确的分子靶标。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

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