Wanying Wen、Jiakui Chen、Yuxin Zhou、Gaofei Li、Yiyue Zhang

华南理工大学医学院 · 细胞发育与整合生物学教研室

Cell Death Discovery (2022) 8:88　doi:10.1038/s41420-022-00891-z
收稿 2021-12-03　修回 2022-01-27　接收 2022-02-09　|　开放获取（CC BY 4.0）

摘要

斑马鱼身上敲掉 ripk3 基因，血细胞生成、细胞因子表达、乃至「切断尾鳍」这种无菌损伤后的炎症反应全都照常；但一旦遇上细菌内毒素（LPS），中性粒细胞死活不肯聚集到感染部位。这说明 Ripk3只在「感染性炎症」里才是关键，而在「无菌性炎症」里可有可无——用抑制剂阻断 Ripk3 也能得到同样的效果，提示它是一个潜在抗炎靶点。

核心要点

1. 研究团队用 CRISPR-Cas9 自行构建了 ripk3 缺失斑马鱼品系（−17 bp，+0），该突变提前终止密码子、破坏 PKc_like 结构域，属功能丧失型。

2. 「三无」验证：ripk3 缺失对静息期造血（中性粒细胞/巨噬细胞/淋巴细胞/红细胞）、基础细胞因子表达、无菌性炎症（尾鳍切割）中性粒细胞募集均无显著影响。

3. 但在 LPS 诱导的感染性炎症中，ripk3 缺失幼鱼的中性粒细胞在卵黄囊区域完全不聚集（2、5、8 hpi 均如此），而野生型呈现强烈的剂量-时间依赖性聚集。

4. 细胞因子层面：LPS 后促炎因子 il1b、il6 在突变体中升高幅度明显受限；抗炎因子 il4、il13 的下调被完全阻断，il10 反而强烈上调。

5. 药理学验证：四种 Ripk3 抑制剂（GSK872/840/843、RIPK3-IN-1）均能阻断 LPS 诱导的中性粒细胞聚集，且对基础发育无影响——与基因敲除表型高度一致。

一、引言：中性粒细胞是一把双刃剑

炎症是机体各组织器官对生物性、物理性、化学性致炎因素触发的免疫反应。它起始于一个短期的急性反应，主要涉及白细胞向炎症区域浸润、吞噬作用以及组织修复。炎症启动时，巨噬细胞、树突状细胞等哨兵固有免疫细胞被激活，开始产生包括细胞因子和趋化因子在内的一系列介质；随后中性粒细胞、自然杀伤细胞和单核细胞被这些介质吸引到炎症部位。

炎症期最重要的效应细胞之一是中性粒细胞，它扮演双重角色：一方面，中性粒细胞在感染中发挥关键的抗病原作用——招募受损会直接导致病原体扩散甚至死亡；另一方面，它们也会在炎症灶处造成局部组织损伤，甚至引发器官功能障碍。中性粒细胞的激活甚至可以触发某些慢性炎症性疾病，如动脉粥样硬化与2 型糖尿病。因此，对中性粒细胞的适度激活与抑制，对炎症进程与机体稳态都至关重要。

受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 3（RIPK3）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，被视为坏死性凋亡（necroptosis）的关键元件。针对 RIPK3 依赖性坏死性凋亡的抑制剂，在肿瘤与代谢性疾病等多种疾病中已显示出治疗潜力。越来越多的证据表明，RIPK3 同时也是炎症调节因子，且这一功能很可能不依赖坏死过程：在骨髓来源树突状细胞和主动脉平滑肌细胞中，RIPK3 通过控制 NF-κB 的活化参与炎症反应；RIPK3 活性不当会导致原发性免疫缺陷与自身炎症综合征。在 LPS 诱导的急性炎症反应中，RIPK3 也扮演着关键角色，且这一过程不依赖半胱天冬酶（caspase）。因此，RIPK3 能否作为「缓解炎症」的潜在靶点，值得进一步探索。

为什么选斑马鱼？

斑马鱼是研究炎症反应与药物评价的理想模型：除体外受精、繁殖力强、易于显微注射外，其造血系统与哺乳动物高度保守，炎症反应也与哺乳动物相似。已知斑马鱼 Ripk3 对坏死性凋亡的调控至关重要；在 2 型糖尿病斑马鱼模型中，Ripk3 通过诱导局部 IL-1β 产生并招募巨噬细胞，参与胰岛炎症。但 Ripk3 在斑马鱼中性粒细胞相关炎症中的调控作用，此前从未有过报道——这正是本研究要填补的空白。

二、结果

1. 用 CRISPR-Cas9 敲除斑马鱼 ripk3 基因

为确定 ripk3 在炎症中的作用，我们用 CRISPR-Cas9 技术靶向 ripk3 的第二个外显子，构建了 ripk3 缺失斑马鱼品系。F0 个体与野生型（WT）杂交获得 F1 杂合子，其中检测到 ripk3 基因存在 17 个碱基对缺失（Δ17, +0）。预测该突变会引入提前终止密码子，从而破坏 Ripk3 蛋白的 PKc_like 超家族结构域。

为验证突变，我们用 Q-PCR 检测 WT 与 ripk3 缺失幼鱼中 ripk3 mRNA 的表达水平。结果显示共有产物（common product）在突变幼鱼中显著降低。我们另外针对 WT 和突变型 ripk3 基因分别设计了特异性正向引物（Mut_FP 与 WT_FP）：突变型 Q-PCR 产物在 WT 幼鱼中几乎不可检出，野生型产物在 ripk3 缺失幼鱼中同样不可检出，说明突变幼鱼中野生型 mRNA 已被突变型取代。因此，ripk3 缺失品系（Δ17, +0）构建成功，确认为功能丧失型突变。

图 1　ripk3 敲除斑马鱼品系的构建与验证。A ripk3 的 CRISPR 靶位点。在 ripk3 第二个外显子上设计 CRISPR/Cas9 靶序列（红色标注），并用 CRISPR-Cas9 技术制造突变。B ripk3 缺失幼鱼的突变形式。本研究采用 ripk3 基因缺失 17 bp 的突变株（Δ17, +0）。C ripk3 突变导致的蛋白改变。在 ripk3 缺失幼鱼中产生了提前终止密码子（*stop），破坏了 PKc_like 超家族蛋白结构域。D ripk3 突变的验证。Q-PCR 显示野生型或突变型 ripk3 mRNA 产物只能在相应基因型（WT 或 ripk3 缺失）幼鱼中检出；共有产物的表达结果显示 ripk3 在 ripk3 缺失幼鱼中表达显著降低（n ≥10，Student t 检验）。WT，野生型；PKc_like，蛋白激酶 C 样超家族结构域；FP，正向引物；QRP，反向引物；bp，碱基对。

2. ripk3 缺失不影响造血

为表征 ripk3 破坏对静息期造血的影响，我们用苏丹黑（SB）染色和整体原位杂交（WISH）检测 ripk3 缺失幼鱼中髓系、淋巴系与红系细胞的数量。SB 染色结果显示，在 3 dpf 时 ripk3 缺失幼鱼与 WT 幼鱼的中性粒细胞数量无显著差异。依据既往研究，分别选用 mfap4、rag1、βe1 作为巨噬细胞、淋巴细胞与红细胞的标志物。WISH 结果显示，在 5 dpf 时两个品系的巨噬细胞、淋巴细胞与红细胞数量均无显著差异。因此，ripk3 缺失对斑马鱼的静息期造血没有显著影响。

图 2　ripk3 缺失幼鱼的造血系统未发生改变。A SB 染色显示中性粒细胞数量未改变（n = 8，Student t 检验）。B mfap4 的 WISH 显示巨噬细胞数量未改变（n = 8，Student t 检验）。C rag1 的 WISH 显示 T 淋巴细胞正常（红圈标示胸腺）（Fisher 精确检验，n = 14）。D βe1 的 WISH 显示红细胞正常（红框标示尾部造血组织）（Fisher 精确检验，n > 12）。SB，苏丹黑染色；WISH，整体原位杂交；dpf，受精后天数；ns，无显著差异。

3. ripk3 缺失不影响细胞因子基础表达

为检验 ripk3 缺失是否影响炎症状态，我们用 Q-PCR 检测了若干促炎细胞因子（il1b、il6、cxcl8a）与抗炎细胞因子（il4、il10、il13）的表达水平。结果显示，所有这些细胞因子在 ripk3 缺失后表达均未改变，与各自 WT 对照一致。这表明 ripk3 缺失不影响正常生理条件下细胞因子的基础表达。

图 3　ripk3 缺失幼鱼的细胞因子表达保持不变。A ripk3 缺失后促炎细胞因子表达正常。3 dpf ripk3 缺失幼鱼中 il1b、il6、cxcl8a 的表达水平未发生改变（n ≥10，Student t 检验）。B ripk3 缺失后抗炎细胞因子表达正常。3 dpf ripk3 缺失幼鱼中 il4、il10、il13 的表达水平未发生改变（n ≥10，Student t 检验）。柱高为相对 mRNA 表达倍数变化（fold change）；黑柱为 WT，灰柱为 ripk3−/−；ns，无显著差异。

4. ripk3 缺失对无菌性炎症影响有限

尾鳍褶皱损伤（caudal fin fold injury）是诱导斑马鱼无菌性炎症反应的成熟方法。我们先对 WT 幼鱼进行损伤，在不同时间点取材以优化最稳健的炎症反应。SB 染色显示，中性粒细胞持续迁移至损伤横切部位直至伤后 5 小时（5 hpi），5 hpi 后中性粒细胞离开尾鳍褶皱。据此，我们对 ripk3 缺失幼鱼同样施加尾鳍褶皱损伤，并在 5 hpi 取材检测其炎症反应。

结果发现：处理前，ripk3 缺失与 WT 幼鱼在尾鳍褶皱区域几乎没有中性粒细胞；而在 5 hpi 时，两者呈现相似的中性粒细胞聚集量，无显著差异。因此，在无菌性炎症反应中，ripk3 缺失不影响中性粒细胞的募集。细胞因子方面亦然：未处理的 ripk3 缺失与 WT 幼鱼共享相似的细胞因子表达水平，与前面的基础表达数据一致。

损伤后，WT 中所有检测的促炎细胞因子（il1b、il6、cxcl8a）均上调；但在 ripk3 缺失幼鱼中，损伤诱导的 il1b 与 il6 上调被减弱，而 cxcl8a 的诱导在两品系间无差异。抗炎因子方面，损伤在两个品系中均能诱导 il4 上调；耐人寻味的是，损伤诱导的 il10 表达在 ripk3 缺失幼鱼中被显著阻断，而原本不受损伤影响的 il13 在 ripk3 缺失幼鱼中反而被轻微诱导。综上，ripk3 缺失确实影响了无菌性炎症中若干细胞因子的表达，但对中性粒细胞募集几乎没有影响。

图 4　ripk3 缺失在无菌性炎症中仅引起有限变化。A 实验设计。用无菌注射针损伤 3 dpf 幼鱼的尾鳍褶皱，并在 5 hpi 检测局部中性粒细胞聚集与细胞因子表达。B, C 中性粒细胞正常趋近损伤部位。0 hpi 时损伤区域（红圈）几乎未见中性粒细胞；5 hpi 时，ripk3 缺失与 WT 幼鱼尾鳍褶皱处吸引了数量相似的中性粒细胞（红色箭头所指）（n ≥12，Student t 检验）。D 促炎细胞因子（il1b、il6、cxcl8a）的表达水平（n ≥10，单因素方差分析）。E 抗炎细胞因子（il4、il10、il13）的表达水平（n ≥10，单因素方差分析）。hpi，伤后小时数；SB，苏丹黑染色；ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。

小结：先把「无菌性炎症」这条路排除掉

尾鳍切割模型与 LPS 模型的一对比非常关键：同样都是「受伤」，但结果截然不同。这说明 Ripk3 的作用不是泛泛地管炎症，而是专门参与「病原体感受」相关的炎症启动。

5. ripk3 缺失显著减轻 LPS 诱导的炎症反应

为验证 Ripk3 是否参与感染性炎症反应，我们用脂多糖（LPS，革兰阴性菌成分）处理斑马鱼幼鱼。先在 3 dpf 对 WT 幼鱼的卵黄进行 LPS 或 PBS（对照）注射，在不同时间点取材以优化最稳健的感染性炎症反应。发现 LPS 注射组在 2 hpi 即出现明显的局部中性粒细胞聚集；中性粒细胞聚集在 5 hpi 达到峰值，此后开始下降。据此我们在 5 hpi 检测 LPS 组与 PBS 组的促炎细胞因子表达，WT斑马鱼的促炎因子在 LPS 挑战后普遍上调。上述数据表明，向 3 dpf 斑马鱼幼鱼卵黄显微注射 LPS 可成功诱导强烈的感染性炎症反应。

随后，我们用 LPS 处理 ripk3 缺失与 WT 幼鱼，并在 2、5、8 hpi 三个时间点检测中性粒细胞富集状态。结果极具说服力：WT 幼鱼呈现强烈的中性粒细胞聚集，而 ripk3 缺失幼鱼的中性粒细胞在卵黄区域保持原状、毫无聚集。这证明 Ripk3 对 LPS 诱导的中性粒细胞聚集是必需的。

细胞因子层面（5 hpi）：LPS 处理后，促炎因子 il1b 与 il6 在 WT 与 ripk3 缺失幼鱼中均显著上调，但突变体中的上调幅度不及WT，提示 ripk3 缺失可能减弱了促炎进程。相比之下，LPS 仅引起 cxcl8a 表达的轻微变化，说明 cxcl8a 对 LPS 诱导的炎症反应可能不是关键。抗炎因子方面，LPS 处理使 WT 幼鱼中 il4 与 il13 显著下调，而这一下调在受 LPS 挑战的 ripk3 缺失幼鱼中被完全阻断；il10 在 WT 中保持不变，却在 ripk3 缺失幼鱼中经LPS 诱导后强烈上调。综上，在 LPS 挑战过程中，ripk3 缺失幼鱼促炎细胞因子表达被减弱，同时抗炎细胞因子维持在相对较高水平。

图 5　ripk3 缺失减轻了 LPS 诱导的炎症反应。A 实验设计。对 3 dpf 的 WT 与 ripk3 缺失幼鱼注射 LPS，并在 5 hpi 取材检测细胞因子；中性粒细胞聚集则通过 2、5、8 hpi 的 SB 染色评估。B 迁移至注射部位的中性粒细胞减少。在 2、5、8 hpi，ripk3 缺失幼鱼卵黄囊中可见的中性粒细胞（红色箭头所指）均少于 WT 幼鱼。C B 图的定量（n ≥6，单因素方差分析）。D B 图的定量，展示累积中性粒细胞的变化趋势。E 5 hpi 时促炎细胞因子（il1b、il6、cxcl8a）的表达水平（n ≥10，单因素方差分析）。F 5 hpi 时抗炎细胞因子（il4、il10、il13）的表达水平（n ≥10，单因素方差分析）。LPS，脂多糖；SB，苏丹黑染色；hpi，注射后小时数；ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。

关键结论

在感染诱导的炎症中，ripk3 缺失能阻断中性粒细胞聚集、防止促炎细胞因子过度产生、并维持相对较高的抗炎细胞因子水平。这提示干预 Ripk3 有可能减轻感染性疾病的炎症。

6. 药理学证据：Ripk3 抑制剂同样能阻断 LPS 诱导的炎症

为评估 Ripk3 能否作为治疗炎症反应的候选靶点，我们对 WT 幼鱼应用了四种 Ripk3 抑制剂——GSK872、GSK840、GSK843 与 RIPK3-IN-1，并同时注射 LPS。抑制剂的浓度用 2 dpf 的 WT 幼鱼进行测试，以确定能诱发畸形的浓度；最终实验浓度选取约为致畸浓度的一半（见下表）。

注：致畸浓度指能诱发幼鱼畸形的最低浓度；实验浓度指本研究中最终使用的浓度。

我们随后考察 LPS 诱导的 SB 阳性中性粒细胞聚集能否被 RIPK3 抑制剂阻断。结果显示：经这些抑制剂处理后，PBS 注射组与未处理对照组之间无显著差异，说明这些抑制剂不会影响中性粒细胞的基础发育。而当 LPS 注射与 RIPK3 抑制剂处理同时进行时，每个处理组内的 LPS 注射组与 PBS 注射组之间均无显著差异——这意味着LPS 诱导的中性粒细胞富集被抑制 RIPK3 后彻底消除。因此，结果既验证了 Ripk3 在中性粒细胞相关炎症反应中的关键作用，也提示以 RIPK3 为靶点减轻炎症具有临床治疗应用的潜力。

图 6　靶向 Ripk3 可抑制 LPS 诱导的炎症。A 抑制 Ripk3 后 LPS 诱导的中性粒细胞聚集被削弱。WT 幼鱼先经 Ripk3 抑制剂预处理，再于 3 dpf 注射 LPS。5 hpi 时，中性粒细胞聚集（红色箭头所指）被 Ripk3 抑制剂显著抑制。B A 图的定量（n ≥5，单因素方差分析）。SB，苏丹黑染色；LPS，脂多糖；hpi，注射后小时数；ns，无显著差异；*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001。

三、讨论

以下从三个方面展开讨论：无菌性炎症为何不受影响、细胞因子层面的机制推测，以及本研究的模型价值与治疗应用前景。

1. 为什么「无菌性炎症」不受影响？

由于白细胞是参与炎症的主要效应细胞，我们首先检测了 ripk3 缺失是否影响静息状态下的造血，尤其是白细胞的发育。结果是髓系、淋巴系与红系造血均未发生改变。作为对照，小鼠中 RIPK 家族的另一成员 RIPK1 被发现可调控胚胎造血；而当 RIPK1 的抑制因子 LUBAC 与 Caspase-8 缺失时，RIPK3 可阻止 RIPK1 诱导致命的造血缺陷。也就是说，只有 Ripk3、Caspase-8 与 Hoil-1（LUBAC 组分）三重突变才会触发严重的 RIPK1 依赖性造血缺陷，而单独突变 Ripk3 基因不足以影响造血。另一项研究中，骨髓特异性敲除 Ripk3 基因导致骨髓有核细胞死亡率升高，但整体造血谱系并无缺陷，可能归因于造血干/祖细胞更强的扩增能力。结合斑马鱼研究可以得出结论：Ripk3 缺失不足以影响静息期造血。

随后，为表征 Ripk3 在无菌性炎症中的作用，我们在 ripk3 缺失幼鱼中诱导尾鳍褶皱损伤。结果显示，两品系在中性粒细胞募集与细胞因子表达上均相似，提示物理性的、无菌性的炎症反应很可能独立于 Ripk3。原因在于：组织损伤时会释放损伤相关分子模式（DAMPs），DAMPs 可激活经典模式识别受体（PRRs），此外还可被多种非 PRR 受体感知——包括晚期糖基化终末产物受体（RAGE）、髓系细胞上表达的触发受体（TREMs）以及 N-甲酰肽受体（FPRs）。值得注意的是，RAGE、TREMs 与 FPRs 在中性粒细胞上均有表达。因此，触发中性粒细胞募集至受损尾鳍的这条高度复杂的 DAMP 相关炎症通路，在斑马鱼中不太可能依赖 Ripk3 功能。

2. 机制推测：IL-1β 与抗炎因子的此消彼长

为表征 Ripk3 在感染性炎症中的作用，我们给 ripk3 缺失幼鱼注射 LPS，结果发现 ripk3 缺失彻底消除了注射部位的中性粒细胞富集。为揭示这一现象的潜在机制，我们检测了促炎细胞因子表达，发现 il1b 在 LPS 注射的 WT 幼鱼中表达显著更高。作为广为人知的促炎因子，IL-1β 主要由巨噬细胞释放，而中性粒细胞在炎症过程中受 IL-1β 招募。哺乳动物中已有报道，RIPK3 在激活 NLRP3 炎症小体中发挥不可或缺的作用，而 NLRP3 炎症小体介导 IL-1β 的成熟与分泌。因此，RIPK3 可能在斑马鱼与哺乳动物中都以保守的方式诱导 IL-1β 的产生；IL-1β 产量的不足（可能发生在巨噬细胞中），或许正是中性粒细胞聚集受损的原因。

另一方面，抗炎细胞因子（il4、il10、il13）在 LPS 诱导的炎症中于 ripk3 缺失幼鱼里维持高表达：IL-4 能显著抑制单核细胞分泌 IL-1β、IL-6 与 TNF-α；IL-13 也能抑制经LPS 处理的单核细胞产生 IL-1β、IL-6、IL-8 等细胞因子；IL-10 则是最重要的抗炎细胞因子，可抑制单核细胞、中性粒细胞与自然杀伤细胞来源的促炎细胞因子。因此，这些抗炎细胞因子的上调可能通过抑制促炎细胞因子的释放来发挥作用，从而阻止中性粒细胞的募集。不过，Ripk3 与这些抗炎细胞因子之间的关系鲜有报道，值得进一步研究——它可能揭示炎症反应中新的调控网络。

3. 应用前景：疾病模型与治疗靶点

由于 ripk3 缺失幼鱼在 LPS 感染后中性粒细胞聚集减弱，该斑马鱼品系可作为「中性粒细胞富集功能失常」疾病的模拟模型。例如，脓毒症（sepsis）是感染继发的综合征，其特征正是中性粒细胞向感染部位的迁移被严重损害。因此，当在 ripk3 缺失斑马鱼中诱导细菌或真菌感染时，缺陷的中性粒细胞反应很可能触发类脓毒症紊乱。鉴于斑马鱼模型非常适合药物评价与筛选，基于 ripk3 缺失斑马鱼开发更多疾病模型值得投入。

另一方面，鉴于中性粒细胞在不同疾病中的作用差异很大，我们也探索了靶向 Ripk3 治疗中性粒细胞增多相关疾病的可能性。当我们把 Ripk3 抑制剂用于经 LPS 处理的幼鱼时，抑制剂强烈抑制了注射部位的中性粒细胞富集。因此，靶向 Ripk3 还可能成为控制「中性粒细胞性炎症」疾病的潜在临床治疗手段。阿尔茨海默病、癫痫、2 型糖尿病、系统性红斑狼疮与动脉粥样硬化均与局部促炎中性粒细胞聚集相关，因此都可能是 Ripk3 靶向治疗的适用场景。

本文核心信息

1. Ripk3 的作用是「感染特异」的：无菌性损伤引发的炎症完全不需要 Ripk3，而 LPS 诱导的感染性炎症则严重依赖它。区分「有没有病原体」决定了 Ripk3 是否登场。

2. 「不致病」不等于「无功能」：ripk3 缺失幼鱼造血正常、细胞因子正常、无菌性炎症正常——正因如此，它才能作为研究「中性粒细胞应答缺陷」类疾病的干净模型，例如脓毒症。

3. 基因与药理学双重验证：四种 Ripk3 抑制剂的效果与基因敲除表型高度一致，且不干扰中性粒细胞基础发育——Ripk3 是一个「可成药」的中枢节点，其抑制剂已现成可用。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。