题目：Deficiency of Werner RecQ-type DNA helicase causes premature malnutrition in zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41732282/

期刊：iScience

研究亮点

l 斑马鱼wn截断突变体分离成轻度和重度表型类

l 严重的WRN突变体显示高DNA损伤和凋亡，导致肠道和胰腺缺陷

l 严重的WRN突变体表现出低葡萄糖、糖原和脂肪水平，表明营养不良

l 食物供应的增加部分挽救了wn突变斑马鱼的生存

摘要

沃纳综合征是一种以早衰症状为特征的遗传性早老症，但其早发性病理机制仍不明确。我们利用CRISPR/Cas9技术构建了wrn截短突变体（((wrn ^{-1-} ))）斑马鱼，并鉴定出两个早衰死亡阶段：受精后7-21天和60-90天。时间序列转录组学分析揭示了两个(wrn-1-)亚群。其中一个亚群在受精后7-9天出现肠道和胰腺外分泌基因表达降低，而另一个亚群最初维持正常表达，但到受精后21-35天最终出现胰腺外分泌基因表达降低。早衰死亡的wrn-/-幼虫表现出肠道绒毛和胰腺缺陷，同时存在DNA损伤、细胞周期阻滞和细胞凋亡。与野生型及迟发性死亡的wrn-/-幼虫相比，它们的糖原、葡萄糖和脂肪水平更低，提示存在营养不良。值得注意的是，过量喂食可部分改善其存活率。这些研究结果揭示了沃纳综合征斑马鱼模型中的早期病理特征。

图形摘要

引言

早老症及相关早老样综合征是一类以与年龄相关的疾病过早发作为特征的遗传性疾病。典型例子包括哈钦森-吉尔福德早老症综合征、布卢姆综合征、科凯恩综合征、着色性干皮病（XP）、共济失调毛细血管扩张症（A-T）⁵和沃纳综合征。哈钦森-吉尔福德早老症综合征、布卢姆综合征和科凯恩综合征在生命早期（1-10岁）发病，而沃纳综合征则在20岁左右发病。沃纳综合征的症状包括头发变白、白内障、皮肤萎缩、胰岛素抵抗性糖尿病和动脉硬化。沃纳综合征患者还表现出特征性的身材矮小。人类患者中已发现沃纳综合征基因WRN的多种变异型。人类WRN蛋白由1432个氨基酸组成，包含外切核酸酶、解旋酶、Recq C末端（RQC）、解旋酶和RNaseD样C末端（HRDC）以及核定位信号（NLS）等多个功能结构域。该蛋白在DNA修复、复制、转录和端粒维持中发挥关键作用，且从细菌（大肠杆菌）到人类的多个物种中均高度保守。然而，其致病机制沃纳综合征中WRN缺失导致加速衰老的机制目前仍 largely unclear，且尚未确立预防早衰的有效治疗方法。此外，20岁之前的早发症状也未得到深入研究。

在以往的细胞研究中，从WRN缺失型胚胎干细胞分化而来的间充质干细胞表现出细胞增殖能力降低、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性升高，同时(p15 ^{lnk4a })和(p21 ^{Waf1 })等衰老标志物的表达水平也有所升高。有趣的是，尽管有研究报道，从沃纳综合征患者皮肤成纤维细胞诱导产生的多能干细胞（iPS细胞）在长期培养两年后仍能维持未分化状态，且未出现衰老相关基因的上调，但近期的一项研究表明，在特定条件下，沃纳综合征iPS细胞相比野生型细胞会表现出加速衰老的特征，这提示衰老表型存在依环境而异的差异性。WRN基因敲除小鼠模型的研究则得出了复杂的结果。缺失部分基因的小鼠解旋酶结构域（((W m^{Delta heV Delta heh }))）的小鼠表现出基因组不稳定以及寿命略有缩短。 相比之下，完全缺乏 Wrn 基因（((W r n^{-1}))）的小鼠则未表现出明显症状，然而，当(Wrn ^{-1-})与p53或端粒酶RNA组分（Terc）的突变结合时，这些双突变体显示缩短的寿命和与基因组不稳定和过早衰老相关的特征。这些发现表明，仅Wrn损失不足以触发小鼠中明显的早衰症表型，从而强调了利用替代模型系统来研究沃纳综合征生理基础的必要性。

我们采用斑马鱼（Danio rerio），一种越来越多地被利用的脊椎动物模型，用于研究发育、行为和疾病，建立沃纳综合征模型。在标准实验室条件下，斑马鱼通常存活2到3年。在早期发育期间，胚胎依赖于蛋黄衍生的营养物质，直到受精后大约5天（dpf），此时它们开始外部喂养。幼虫期从5到大约30 dpf，然后是幼年期从30到90 dpf，性成熟度达到大约90 dpf。这些明确定义的发育转变使斑马鱼成为研究脊椎动物生长、代谢和衰老的有价值的模型。突变体胚胎在胚胎发生过程中在受精后40小时（hpf）时表现出较短的体长，并显示出软骨和骨骼发育的损伤。另一项研究报告了斑马鱼中wrn的两个突变等位基因：一个无意义的突变（((wm ^{c q 216})，L173*）导致核酸外切酶结构域的截断，一个内部缺失等位基因（((w m^{c q 217}))）导致从核酸外切酶结构域中间到HRDC结构域末端的大量缺失。这些突变体在8 dpf时在肠道中表现出增加的SA-β-gal活性，而没有明显的形态缺陷，在30 dpf时表现出减少的体长，并在60 dpf前死亡。用mTOR抑制剂sapanisertib治疗，抑制了突变体肠道中SA-β-gal活性。

在这里，我们独立生成了携带2-bp缺失的斑马鱼wrn突变体，该突变体导致解旋酶域中的移码。与之前的研究不同，我们的wrn突变体在胚胎阶段没有表现出缩短的体长。大约90%的wrn突变体幼虫过早死亡30 dpf，而其余10%表现出生长迟缓，死亡90 dpf。转录组分析显示，过早死亡的wrn突变体幼虫在胰腺外分泌和肠细胞中表现出缺陷。与这些发现一致，我们发现，由于消化和吸收受损，wrn突变体幼虫营养不良。

结果

斑马鱼wn突变体在幼体阶段很小，寿命很短

为了产生Wrn-/-斑马鱼，我们设计了一个以Wrn基因为目标的CRISPR，并获得了一个外显子19中2-bp缺失的等位基因。该突变等位基因在位于解旋酶结构域三分之二的716位（T717Sfs*9）丙氨酸残基之后存在移码。可通过PCR检测到2-bp缺失，从而能够对(wrm+/+)、(wrn ^{+/-})和(wrn ^{-1-})进行基因分型(wrn ^{-1-})Wrn mRNA的转录水平与(wrm ^{+/+})和(w m^{+1-})相当。为了评估Wrn缺乏是否影响胚胎发生，我们首先检查了(wrn ^{+/+})和(w m^{-1-})个体在1-5 dpf的形态。我们没有发现(w m^{-1-})胚胎/幼虫在5 dpf的任何形态缺陷。由于另一个携带解旋酶结构域上游无意义突变（Q431*）的Wrn突变斑马鱼显示发育畸形并减少了2 dpf的体长，我们的突变等位基因被认为表现出较温和的表型，因此适合胚胎后分析。为了解决Wrn缺乏是否影响斑马鱼的寿命，我们进行了生存实验。从(w m^{+/-})杂交获得的(w m^{+/+})、Wrn和(wrm-1-)幼虫在5 dpf时表型无法区分。它们在5 dpf时被转移到水循环系统并饲养高达90 dpf。每天收集死亡的幼虫/稚鱼并进行基因分型。总共86%（185/214）的(wrn ^{+/+})和75%（353/472）的(w m^{+/-})幼虫存活90天，而86%（114/133）的(wrn-1-)幼虫在7-21 dpf时死亡（图1B）。虽然存活超过21 dpf的(wrn ^{-1-})幼虫看起来很健康，并且在该阶段与(w m^{+/+})幼虫没有区别，但它们最终比(w r n^{+/+})幼虫小75 dpf，并表现出不规则条纹图案的色素沉着中断。其余14%（19/133）的(wrn ^{-1-})幼虫在60-90 dpf之间死亡。这些结果表明(w m^{-1-})斑马鱼表现出两个不同的死亡阶段：7-21 dpf的早期阶段，称为过早死亡，60-90 dpf的后续阶段，称为晚期死亡。这些(wrn-1-)表型不同于先前报道的wn突变体。

图1。(wrn-1-) 斑马鱼表现出体型矮小且会过早死亡(A)野生型和突变型斑马鱼 Wrn 蛋白的结构域。（上）野生型 Wrn 蛋白包含核酸外切酶结构域、解旋酶结构域、RecQ 羧基端（RQC）结构域、解旋酶与 RNaseD 样羧基端（HRDC）结构域以及核定位信号（NLS）结构域。（下）移码突变导致解旋酶结构域内发生截短。(B) (w m^{+1+})（黑色，(n=214)）、(w r n^{+/ *})（绿色，(n=472)）和 (wm~)（红色，(n=133)）斑马鱼的生存曲线。采用对数秩检验评估统计学显著性。(C–F) 21 日龄（dpf）斑马鱼幼鱼（C）wrn+/+ ((n=9)) 和（D）wrn((n=4))）的图像（比例尺，1 毫米）；以及 75 日龄（dpf）斑马鱼幼鱼（E）(w r n^{+/+}(n=7)) 和（F）(w m^{-1}(n=5))）的图像（比例尺，5 毫米）。(G) 21 日龄 (w m^{+/+}) 斑马鱼幼鱼（((n=9)) 和 wrn((n=4))）的体长测量结果，以及 75 日龄 (wrn ^{+/+}) 斑马鱼幼鱼（((n=7))）和 (wrn) 斑马鱼幼鱼（((n=5))）的体长测量结果。采用非配对双尾 Student 氏 t 检验评估统计学显著性。数据以平均值±标准差（SD）表示。详细的平均值±标准差见表 S2。

(wrn ^{-1-})斑马鱼肠道和胰腺外分泌基因表达降低

为探究wrn-/-斑马鱼幼虫在幼虫阶段发生过早死亡时的分子事件，我们对单个幼虫进行了时程转录组分析。我们从编号为(wrn ^{+/+})和(wrn-1-)的整尾斑马鱼幼虫中提取RNA，选取覆盖过早死亡发生时期（4–35天胚胎期，其中(n=3-8)组为3–8天胚胎期，每组各时间点）的13个不同时间点的样本，进行转录组分析。主成分分析（PCA）结果显示，5–9天胚胎期的(w r n^{+/+})幼虫呈现出相对一致的基因表达谱，并在9–10天胚胎期出现显著的表达轨迹转变。随后，10–21天胚胎期的样本形成一个稀疏聚类，且在21–28天胚胎期基因表达出现又一次轨迹偏移。(wrn-1-)幼虫的转录组图谱在6天胚胎期前的数据点分布与(w r n^{+/+})幼虫相似。但从7–9天胚胎期开始，(wrn-1-)样本中的一部分开始偏离(wrn ^{+/+})组，这一时间上的变化与过早死亡的发生相关。值得注意的是，这种早期的表达差异出现在可见的形态学异常出现之前，表明转录组变化先于表型表现出现。尽管大多数9天胚胎期后存活的(w m^{-1-})幼虫在10–21天胚胎期的转录组特征与(w r n^{+/+})幼虫相似，但其基因表达模式在28–35天胚胎期再次出现差异。聚类分析进一步将样本分为十组。

值得注意的是，8号簇仅包含(wrm)号7至9日龄幼体，这一类很可能代表早亡群体，该群体会在21日龄前出现死亡（图2F）。相比之下，(wrn ^{+/+})号和(w m^{-1-})号28至35日龄幼体均被归为2号簇。2号簇中的(wrn ^{-1-})号幼体则可能代表晚亡群体，该群体会在60至90日龄间出现死亡。

我们对(w m^{-1-})幼虫的基因表达变化进行了研究，以探究其致死性的潜在原因。在所有样本中21887个差异表达基因里，有108个基因在受精后7-9天的8号簇中显著上调。但对这些基因进行基因本体（GO）富集分析后，未得到具有统计学显著性的条目。相比之下，有146个基因在8号簇中表达下调。其中，35个基因在8号簇和2号簇的wrn-/-幼虫中均出现表达下调，而这两个簇均与死亡率升高相关。利用斑马鱼单细胞转录组在线图谱分析发现，35个基因中有26个特异性表达于胰腺外分泌细胞、ε细胞，以及肠道肠上皮细胞和杯状细胞中。胰腺外分泌标志物prss1和amy2a的表达在(wrm)幼虫的受精后7-9天和21-35天均出现降低，肠道标志物fabp2和apoa1a则在受精后8-9天表达下调。这些结果表明，(wrn ^{-1-}) 致死性的病理特征归因于胰腺外分泌和肠道功能受损。

我们还评估了DNA损伤和细胞衰老的时间进程。从受精后7天开始，(w m^{-1-})幼虫中DNA损伤标志物(p53)的表达水平升高，并在此后逐渐增强。相比之下，在受精后35天内，(w m^{+/+})和(wrn ^{-1-})幼虫的细胞衰老标志物p21和(p16)的表达水平无差异。这些结果表明，(wrn ^{-1-})幼虫早在受精后7天就出现DNA损伤，而细胞衰老至少在受精后35天内未发生进展。

图2. 斑马鱼wrn-/-中胰腺细胞和肠道标志物的表达水平降低(A)*wrn⁺/⁺*与*wrn⁻/⁻*个体的主成分分析（PCA），依据基因型进行颜色编码。(B) *wrn⁺/⁺*个体的主成分分析，依据发育阶段进行颜色标注。(C) *wrn⁻/⁻*个体的主成分分析，依据发育阶段进行颜色标注。(D) 基于聚类结果的主成分分析，依据聚类编号进行颜色编码。(E) *wrn⁺/⁺*个体的主成分分析，采用图 2D 中的聚类编号进行颜色编码。(F) *wrn⁻/⁻*个体的主成分分析，采用图 2D 中的聚类编号进行颜色编码。(G) 用于筛选在*wrn⁻/⁻*中特异性下调的 35 个基因的基因筛选策略。(H) 在 79 dpf 以及 2135 dpf 两个时期，*wrn⁻/⁻*中均下调的 35 个基因的热图。(I) 基于斑马鱼细胞图谱数据库得到的 32 个基因的组织特异性表达情况（剔除 cela1.3、cela1.5 与 cela1.6 基因）。(JM) *wrn⁺/⁺*（黑色）和*wrn⁻/⁻*（红色）中胰腺外分泌细胞及肠道标志物基因的表达。外分泌细胞标志物：*prss1*（J）和*amy2a*（K）；肠道标志物：*fabp2*（L）和*apoa1a*（M）。每个时间点均采用韦尔奇 t 检验进行统计学显著性分析。(*p<0.05)，(**p<0.01)，(***p<0.001)；ns 代表无统计学差异。详细 P 值参见补充表 S5。

(wrn ^{-1-})幼虫在濒死阶段肠道和胰腺的进行性组织学缺陷

为了检测(wrm-1-)幼虫的组织学异常，我们使用了转基因斑马鱼品系Tg(ptf1a:EGFP)，该品系可标记胰腺外分泌细胞，从而显示出其整体形态胰腺。在受精后5天（5 dpf），绿色荧光蛋白（GFP）阳性的外分泌细胞为在 (w r n^{+/+}) 和 (w m^{-1-}) 幼虫的身体右侧鱼鳔下方均观察到。到7 dpf时，(w m^{-1-}) 幼虫可分为两类不同的表型组。其中一组（下文称为 wrn-/-_轻度型）形态上看似正常，但绿色荧光蛋白信号呈中度减弱。另一组称为(w m^{-1-})_重度型，表现出消瘦状态，绿色荧光蛋白阳性区域显著缩小，且常伴随结构不连续与碎裂现象。在受精后第9天和第12天，wrn-/-_轻度型幼体的绿色荧光蛋白阳性外分泌细胞相较于(w m^{+/+})幼体更小，而wrn_重度型幼体的绿色荧光蛋白表达稀疏且不连续。这些重度受损的幼体在出现明显消瘦后的五天内死亡。这些研究结果表明，受精后第5天起，一部分(w m^{-1-})幼体会随机出现胰腺外分泌缺陷，进而引发进行性消瘦和早夭。受精后第9天石蜡切片的苏木精-伊红染色证实，(wm-1-)_轻度型幼体的胰腺略小于(wrm ^{+/+})幼体，而(wrn ^{-1-})_重度型幼体的胰腺则显著小于(wrm+/+)和wrn-/-_轻度型幼体。斑马鱼的肠道上皮含有称为绒毛的突起结构，可增强营养吸收。 延伸至肠腔的肠绒毛在 wrn+/+ 幼虫中可观察到该现象，但在 wrn-/-_轻度和 (wrn ^{-1-})_重度幼虫中均呈现缩短的表现。此外，(wrn-1-)_轻度和 wrn-/-_重度幼虫的肠道表面积较 (w r n^{+/+}) 幼虫有所减小。胰腺和肠道的这些组织学缺陷与转录组异常相一致。原位杂交实验证实，wrn 在5日龄和7日龄斑马鱼幼虫的胰腺和肠道中均有表达，这支持了这些消化器官主要受 wrn 功能缺失影响的观点。

鉴于WRN蛋白作为参与DNA损伤修复的DNA解旋酶发挥作用，我们推测(w m^{-1-})幼虫无法修复DNA损伤，进而导致胰腺和肠道出现细胞周期停滞及细胞凋亡。在受精后5天（5 dpf），对Tg(ptf1a:EGFP)幼虫冷冻切片进行γ-H2AX免疫染色显示，(w m^{+/+})幼虫的肠道或GFP标记的胰腺中未检测到DNA损伤信号。相比之下，(wrm)幼虫的这两种组织中均出现了γ-H2AX信号。在受精后7天（7 dpf），(w m^{+/+})幼虫的两种组织中均未检测到γ-H2AX信号，而轻度(wrn ^{-1-})和重度(w m^{-1-})幼虫的两种组织中均观察到清晰的信号。值得注意的是，重度(w m^{-1-})幼虫的两种组织中信号强度均有所降低。EdU标记显示，在5天龄（dpf）时，(w m^{+/+})和wrn-/-斑马鱼幼虫的肠道和胰腺中均存在增殖细胞。在7天龄时，(wrn ^{+/+})和(w m^{-1-})_轻度型幼虫的胰腺中仍可检测到EdU阳性细胞，但在(w m^{-1-})_重度型幼虫的胰腺中未检测到。在肠道中，与(w m^{+/+})幼虫相比，wrn-/-轻度型和(w m^{-1-})_重度型幼虫的EdU阳性细胞数量均显著减少。TUNEL标记显示，在5天龄时，wrn+/+和(wrn-1-)幼虫的胰腺和肠道中几乎无细胞死亡。在7天龄时，(wrm ^{+/+})和wrn轻度型幼虫的胰腺和肠道中TUNEL阳性细胞均较少。相比之下，(w m^{-1-})_重度型幼虫的两种组织中均出现了此类细胞，且在胰腺中表现显著，肠道中也有一定程度的分布。综上，这些研究结果表明，wrn基因缺陷会导致DNA损伤，进而在早衰死亡阶段造成消化组织的细胞增殖受损和细胞凋亡增加。

先前的一项研究表明，wrn 基因缺陷型斑马鱼肠道的端粒长度短于野生型斑马鱼。 在本研究中，我们采用基于 qPCR 的方法检测了全身体端粒长度，发现在 7 天龄（dpf）时，(wrn-1-)型严重突变斑马鱼幼体的端粒长度与(w m^{+/+})型或 wrn 轻度突变斑马鱼幼体相比，未出现显著缩短。这些结果表明，在该发育阶段，斑马鱼胰腺和肠道中观察到的异常更可能由 DNA 损伤的积累导致，而非端粒缩短。

图3. wn-/-幼虫胰腺和肠道的形态异常(AK) 转基因品系*Tg(ptf1a:EGFP); casper*幼鱼的胰腺外分泌细胞形态。(A) 受精后 5 天（5 dpf）的*wrn⁺/⁺*幼鱼（n=24/24）；(B) *wrn⁻/⁻*幼鱼（n=6/6）。(C) 受精后 7 天（7 dpf）的*wrn⁺/⁺*幼鱼（n=27/27）；(D) *wrn⁻/⁻*轻度表型幼鱼（n=8/13）；(E) *wrn⁻/⁻*重度表型幼鱼（n=5/13）。(F) 受精后 9 天（9 dpf）的*wrn⁺/⁺*幼鱼（n=47/47）；(G) *wrn⁻/⁻*轻度表型幼鱼（n=8/19）；(H) *wrn⁻/⁻*重度表型幼鱼（n=11/19）。(I) 受精后 12 天（12 dpf）的*wrn⁺/⁺*幼鱼（n=40/43）；(J) *wrn⁻/⁻*轻度表型幼鱼（n=8/15）；(K) *wrn⁻/⁻*重度表型幼鱼（n=7/15）。比例尺：0.5 mm。(LN) 石蜡切片苏木精伊红（HE）染色，样本为受精后 9 天（9 dpf）幼鱼。(L) *wrn⁺/⁺*幼鱼（n=6）；(M) *wrn⁻/⁻*轻度表型幼鱼（n=6）；(N) *wrn⁻/⁻*重度表型幼鱼（n=6）。绿色虚线框标示胰腺外分泌区域；黑色箭头指向肝脏，白色箭头指向肠道。比例尺：50 μm。(O) 受精后 5、7、9 和 12 天（dpf）时 GFP 阳性胰腺外分泌组织的面积（对应图 3A3K）。样本数量如下：5 dpf 时，*wrn⁺/⁺*（n=24），*wrn⁻/⁻*（n=6）；7 dpf 时，*wrn⁺/⁺*（n=27）、*wrn⁻/⁻mild*（轻度突变，n=8）、*wrn⁻/⁻severe*（重度突变，n=5）；9 dpf 时，*wrn⁺/⁺*（n=47）、*wrn⁻/⁻mild*（n=8）、*wrn⁻/⁻severe*（n=11）；12 dpf 时，*wrn⁺/⁺*（n=43）、*wrn⁻/⁻mild*（n=8）、*wrn⁻/⁻severe*（n=7）。5 dpf 组采用**非配对双尾 Studentt 检验**进行统计学显著性分析；7、9、12 dpf 组采用**单因素方差分析（oneway ANOVA）**，之后进行图基（Tukey）真实显著性差异（HSD）事后检验。数据以**平均值 ± 标准差（mean ± SD）**表示，详细的平均值与标准差见补充表 S6。(P、Q) 对受精后 9 天（9 dpf）的*wrn⁺/⁺*（野生型，n=6）、*wrn⁻/⁻mild*（轻度突变，n=6）以及*wrn⁻/⁻severe*（重度突变，n=6）幼鱼的**肠道绒毛平均长度 (P)**和**肠道面积 (Q)**进行定量分析（对应图 3L3N）。采用单因素方差分析（oneway ANOVA）结合 TukeyHSD 事后检验评估统计学显著性。数据以**平均值 ± 标准差（mean ± SD）**表示，详细的平均值及标准差数据参见补充表 S7。(R、S) 野生型同窝斑马鱼（WT sib）受精后 5 天（5 dpf，R）和 7 天（7 dpf，S）*wrn*基因表达的原位杂交结果。红色、白色、绿色箭头分别指向胰腺、肠道和肝脏。比例尺：100 μm。

图4.(wrm)幼虫胰腺和肠道发生DNA损伤、细胞死亡和增殖阻滞(A–E) 冷冻切片的γH2AX染色。(A) 5天龄（5 dpf）的(w m^{+/+}(n=5))和(B) (w m^{-1-}(n=5))幼虫，以及(C) (wrm++)、((n=6)) (D) 轻度（((n=6))）和(E) 重度（((n=6))）的7天龄（7 dpf）(wrn)幼虫。(F和G) 胰腺(F)和肠道(G)中gammaH2AX染色信号的定量分析（对应图4A-4E）。样本数量。(w m^{+/+}(n=5) :) (w m^{-1}(n=5)) 在(5 dpf; w r n^{+/+}(n=6): w r n^{-1 / 4}) 处为_轻度( ((n=6): w m^{-1}) )_重度( ((n=6)) )，样本取自受精后7天(7 dpf)。受精后5天(5 dpf)的统计学显著性采用非配对双尾Student’s t检验评估，受精后7天(7 dpf)的统计学显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)后接Tukey’s HSD检验评估。数据以平均值±标准差(mean ± SD)表示。详细的平均值±标准差见表S8。(H–L) 冷冻切片的 EdU 标记。(H) 5 dpf 时的 (w m^{+/+}(n=4)) 和 ((i) w m^{-1-}(n=6)) 号幼虫，以及 (J) (wm+/+) 号和 ((n=5)) 号幼虫。((K) w m^{-1}) 号为轻度（((n=6)) 号和 ((L) w m^{-1}) 号），重度（((n=7)) 号）幼虫为 7 dpf。（M和N）胰腺（M）和肠道（N）中EdU标记信号的定量分析（对应图4H–4L）。样本数量：5 dpf时为(w m^{+1+}(n=4): w m^{-1-})、((n=6))；7 dpf时为wm**(n=5)：(wm)、轻度(((n=6): w r n^{-1}))、重度(((n=7)))。5 dpf时的统计学显著性采用非配对双尾Student’s t检验评估，7 dpf时采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey’s HSD检验。数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。详细的平均值±标准差见表S8。(O–S) 冷冻切片的TUNEL标记。(O) 5 dpf时的(w m^{+/+}(n=5))和(P) (w r n^{-1-}(n=5))幼虫，以及(Q) 7 dpf时wrn+/+（(=6))、((R) w r n^{-1})_轻度（((n=6))）和((S) w r n^{-1})_重度（((n=6))）幼虫。（T和U）胰腺（T）和肠道（U）中TUNEL标记信号的定量分析（对应图4O–4S）。样本数量：5 dpf时为(w m^{+/+}(n=5): w m^{-1-})、((n=5))；7 dpf时为wm**(n=6)、wm*轻度（((n=6): w m^{-1 / 2})）和重度（((n=6))）。5 dpf时的统计学显著性采用Wilcoxon秩和检验评估，7 dpf时采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn多重比较检验并采用Holm校正。由于(w m^{+/+})和wrn-/-均为零值，未对5 dpf时的胰腺进行统计学分析。数据以平均值±标准差表示。详细的平均值±标准差见表S8。（A–E、H–L和O–S）比例尺为100 μm。白色框内比例尺为30 μm。

wrn 基因敲除斑马鱼存在营养不良的情况

由于胰腺和肠道是营养消化所必需的分别发挥促进营养吸收和消化的作用，我们探究了(w m^{-1-}) 幼虫表现出营养缺乏。我们通过杂交 Tg(ptf1a:EGFP) 鱼系和 (wrn ^{+/-}) 鱼系获得幼虫，并根据绿色荧光蛋白（GFP）信号强度将其分为轻度、重度或表型正常的幼虫。从受精后第9天（9 dpf）的幼虫中收集全幼虫提取物，用于葡萄糖和糖原含量测定，随后进行基因分型以确认其基因型分类。wrn-/-重度幼虫的葡萄糖水平显著低于轻度幼虫。同样，与轻度幼虫相比，重度幼虫的糖原水平也显著降低。油红O染色结果显示，在受精后第9天，wrn-/-轻度和重度幼虫的脂肪积累量均低于对照组幼虫。我们的转录组分析显示，在(w m^{-1-})幼虫中，参与糖酵解（hk1）、糖异生（pcca）、三羧酸循环（cs）或脂肪酸代谢（acadm）的基因表达无显著变化。相反，与自噬相关的基因（如atg9a、atg14、optn和sqstm1）通常在饥饿状态下上调，在9 dpf时，(wrn-1-)幼虫中的这些基因表达水平高于(wrn ^{+/+})幼虫，这与饥饿样反应一致。此外，atg9和optn还与线粒体自噬相关，且已知optn和sqstm1均会因氧化应激而上调。9 dpf时，(w m^{-1-})幼虫中的线粒体自噬标志物bnip3lb和fis1表达水平高于(wrn ^{+/+})幼虫。同样，在相同时间点，(wrn ^{-1-})幼虫中的氧化应激标志物gclm和txn也被上调。这些发现表明，(w m^{-1-})_severe幼虫在5 dpf后卵黄储备耗尽时，因消化功能受损而出现营养不良。这种营养缺乏可能诱导自噬，进而触发线粒体自噬并加剧氧化应激，最终导致(w m^{-1-})_severe幼虫的胰腺和肠道发生进行性细胞损伤。

如果wrn-/-_严重型幼虫在受精后5天（5 dpf）因营养不良死亡，提供过量食物可能通过更易获取营养来提高其存活率。为验证这一假设，我们使用wrn+/-杂交的幼虫重复存活率实验，分别采用过量喂食和正常喂食的饲养方式。当wrn+/+和(wrn ^{-1-})型幼虫正常喂食时，无论基因型如何，所有个体均在受精后9至14天死亡，这一时期与wrn-/-_严重型幼虫过早死亡的阶段一致。在过量喂食条件下，(w m^{+/+})型幼虫的存活率相较于正常喂食对照组无明显改善，而(w m^{-1-})型幼虫在受精后21天时的存活率提升了约20%。为进一步探究过量喂食对wrn-/-幼虫的挽救作用，我们根据胰腺外分泌组织的形态，将正常喂食和过量喂食的(wrn-1-)型幼虫分为(w m^{-1})_轻度型和(w m^{-1-})_严重型两组（图5H-5M）。与正常喂食的幼虫相比，过量喂食使wrn-/-_严重型幼虫的胰腺体积增大。这些结果表明，营养不良是(w m^{-1-})型幼虫过早死亡的主要原因，而营养补充可通过促进胰腺状态的恢复来延长其存活时间。

图5. 过早死亡的(wrm-1-)斑马鱼出现营养不良(A和B) (A) 9天龄仔鱼全鱼的葡萄糖和糖原水平。样本数量。(w m^{+/+}(n=12) ; w m^{-1 /-}) _轻度组( ((n=10) ; w m^{-1}) _重度组( ((n=13))。采用Welch方差分析后进行Games-Howell事后检验评估统计学显著性。数据以平均值±标准差表示。详细的平均值±标准差见表S10。(C–E) 仔鱼整体的油红O染色。(C) wrn+/+ ((n=21)) 型仔鱼；(D) (wm) _轻度组( ((n=20)))和(E) w m^{-1 / 2}) _重度组( ((n=11)))型9天龄仔鱼。比例尺，0.5毫米。(F) 油红O信号强度的定量分析（对应图5C–5E）。样本数量：wrn+/+ ((n=21))、wrn-/-_轻度组( ((n=20): w m^{-1}))、wrn-/-_重度组( ((n=))共11例。采用Welch方差分析后进行Games-Howell事后检验评估统计学显著性。数据以平均值±标准差表示。详细的平均值±标准差见表S11。(G) 正常、饥饿和过量喂食条件下的存活实验。wrn+/+_饥饿组（紫色，(n=56)）、wrn-/-_饥饿组（橙色，(n=54))；(wrn ^{+/+})）、wrn-/-_过量喂食组（蓝色，(n=78)）和野生型过量喂食组（绿色，(n=68)）。正常条件下野生型((wm+/+)，黑色，(n=214))和突变型((and wm^{-1-})，红色，(n=133))的数据复用自图1B。采用对数秩检验评估统计学显著性。(H–M) Tg(ptf1a:EGFP); casper品系仔鱼在9天龄时胰腺外分泌细胞的形态。(H) 正常喂食条件下(The w r n^{+/+}(n=47 / 47))、((i) w m^{-1-}) _轻度组(((n=8 / 19)))和((J) w r n^{-1-}) _重度组(((n=11 / 19)))型仔鱼（数据复用自图3F–3H）。(K) 过量喂食条件下wrn+/+ (((n=15 / 15)))、wrn-/-_轻度组((wm-1)、((n=16 / 33)))和wrn-/-_重度组(((M) w m^{-1-})、((n=17 / 33)))型仔鱼。比例尺，0.5毫米。

讨论

wrn基因缺陷的斑马鱼表现出两个死亡阶段：90%的个体在受精后7至21天过早死亡，而10%的个体则在受精后60至90天较晚死亡。我们推测，早发性和迟发性死亡的出现是由突变表型的随机变异导致的，而非额外突变所致，因为我们通过反复与野生型菌株回交来维持斑马鱼wrn突变等位基因，且这两个不同亚群的出现情况在多代中保持一致。幼虫在肠道和胰腺外分泌细胞中出现DNA损伤、细胞增殖减少以及细胞死亡增多的现象。由于这些组织对营养物质的消化和吸收至关重要，其功能障碍会导致营养不良和早期死亡，而过量投喂可部分挽救这一表型。

图6. wrn-/-斑马鱼示意图约90%的wrn-/-斑马鱼幼虫在7至21天龄期间因胰腺和肠道缺陷以及后续的营养不良出现胰腺和肠道发育异常，并过早死亡。营养补充提高了它们的存活率。(N) 9天胚胎期（dpf）GFP阳性胰腺外分泌组织的面积（对应图5H-5M）。样本数量：正常喂食条件下，wrn-/-轻度（((n=8) :)）、wrn-/-重度（((n=11))）；过量喂食条件下，wrn+/+轻度（((n=15): w m^{-1 / 4})）、wrn+/+重度（((n=16): w n^{-1 / 4})）。统计显著性通过非配对双尾Student’s t检验评估不同条件间的比较（如正常喂食条件下的(wrm+/+)与过量喂食条件下的(wrn ^{+/+})），并采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey’s HSD检验评估过量喂食条件下的组间比较（((wm+/+)、(wrn)轻度组与wrn-/-重度组）。数据以平均值±标准差（SD）表示，详细的平均值±标准差见表S6。

RNA测序的应用

我们开发了一种高通量RNA收集方案，并对(wrn ^{+/+})和(w m^{-1-})幼虫进行了时间序列RNA测序。这揭示了(wrn-1-)个体中胰腺和肠道基因的下调，确定消化组织缺陷是导致过早死亡的原因。尽管我们尝试寻找区分wrn-/-_轻度和wrn-/-_重度的早期标志物，但未找到明确的候选基因，这可能是由于单幼虫RNA样本的细胞分辨率有限。时间序列单细胞RNA测序或有助于鉴定表型出现前细胞类型特异性的脆弱性或信号。

Autophagy-mitophagy-oxidative应力轴

我们的RNA-Seq分析揭示了(wrn-1-)斑马鱼自噬、线粒体吞噬和氧化应激反应相关基因的上调。这一发现与以前的研究一致，表明人类细胞中WRN缺乏导致线粒体功能障碍、(NAD+)耗竭和氧化应激增加丝裂吞噬和减轻WRN缺陷细胞的衰老在我们的斑马鱼模型中，自噬和线粒体吞噬相关基因（atg9a、optn、bnip3lb和fis1）的表达升高可能反映了对氧化应激增加和线粒体损伤的代偿反应。这些转录组在我们的斑马鱼模型中，自噬和线粒体吞噬相关基因（atg9a、optn、bnip3lb和fis1）的表达升高可能反映了对氧化应激增加和线粒体损伤的代偿反应。这些转录组变化支持了WRN缺乏症中代谢和线粒体功能障碍会导致组织退化这一观点。未来的研究需采用活性测定法，例如检测活性氧、NAD+/NADH比率以及线粒体自噬通量，以确定这些转录变化是否会在我们的模型中转化为生理缺陷。

营养不良诱导斑马鱼的脆弱性

为探究营养不良是否会导致(w m^{-1-})幼虫过早死亡，我们在不同喂食条件下进行了存活实验。在饥饿状态下，(wrn ^{+/+})和(wrn-1-)两种幼虫的存活时间相近（受精后9-14天），这表明两种基因型的幼虫进食后存活率均有所提升。过量喂食改善了(wrn-1-)幼虫的存活情况，同时提高了胰腺外分泌细胞中荧光水平正常的个体比例，说明饮食条件是(w m^{-1-})幼虫早期死亡的关键因素。由此可见，增加营养供给可降低斑马鱼的死亡率。尽管外分泌胰腺功能不全尚未被报道为沃纳综合征的常见临床特征，但该疾病的常见症状——身材矮小，可能部分归因于营养供给不足。事实上，有一例伴随营养不良的沃纳综合征患者，在接受营养和维生素补充治疗后病情显著改善补充。

过度喂养的有益效应与mTOR抑制的有益效应之间的明显差异，或许可通过潜在机制的差异来解释。过度喂养可能通过改善营养可及性来缓解营养不良的继发效应，从而支持wrn-/-幼虫的整体代谢和器官维持。相比之下，mTOR抑制剂直接作用于营养感知通路，以减轻mTOR信号通路的过度激活，而这一过程与wrn缺乏的发病机制相关。因此，尽管两种干预措施均能提高存活率，但它们可能通过不同的机制发挥作用：过度喂养在机体水平上弥补营养缺乏，而mTOR抑制则在分子水平上减轻细胞应激。

基于突变类型的表型变异性

我们的斑马鱼wrn突变体（((wrm ^{agu26 } ))）表现出的表型比已报道的wrn突变体（((wm ^{c q 216})和(wm cq217)）更强Ma 等人的研究中，尽管保留了该蛋白质更大的部分。一种可能的解释是我们的突变体中的截断蛋白保留了完整的N末端核酸外切酶结构域，该结构域可能表现出改变的生化特性或异常的相互作用，而不是产生典型的WRN功能。此外，截断蛋白中的残余结构域可能会错误折叠或错位，进一步加剧表型。发育分析时间的差异、组织特异性敏感性和用于评估表型的分析也可能导致明显的差异。有趣的是，在沃纳综合征小鼠模型中也有类似的观察报告。Wrn功能的完全丧失产生相对温和的表型，而保留部分结构域的突变可能会导致更明显的异常，可能是由于错误折叠或错误处理的截断蛋白扰乱了细胞同源性stasis.这些事实表明，trun的存在阳离子化的、部分功能性的WRN蛋白有时比蛋白质完全丧失更有害，这与我们在斑马鱼突变体中观察到的更强的表型一致。因此，在斑马鱼和小鼠中，突变类型和保留的域严重影响表型严重性，突出了WRN缺乏模型中突变特异性影响的重要性。携带WRN基因突变的沃纳综合征个体也表现出不同的临床特征与WRN蛋白保留的程度密切相关

其他RecQ解旋酶在RN缺陷斑马鱼中的潜在补偿作用

先前的研究表明RecQ解旋酶在维持基因组中具有重叠和补偿功能在人类细胞中，RECQL5与WRN合作确保正确的脱氧核糖核酸复制和修复，同时失去两种解旋酶会导致复制叉恢复和基因组维护的协同缺陷停滞的复制叉与同源重组的介导因子。 RECQL4 也具有部分冗余的功能在DNA修复过程中与WRN相关。这些研究结果表明，其他RecQ解旋酶，如recql5、blm和recql4，可能会补偿斑马鱼中WRN的缺失。因此，在wrn-/-幼虫中观察到的可变表型严重程度可能反映了这种代偿反应程度的差异。为了验证这一可能性，构建同时缺失WRN和另一种RecQ解旋酶（如recql5或blm）的双突变体将具有重要意义。对这些突变体的存活率、生长情况和基因组稳定性进行比较分析，能够揭示这些基因是否在体内减轻了WRN缺失带来的影响。此类研究将加深我们对RecQ解旋酶家族功能冗余性的理解，并阐明沃纳综合征表型变异背后的分子基础。

晚亡型wrn-/-斑马鱼作为沃纳综合征模型的潜力

在人类中，WRN 基因突变会导致沃纳综合征，患者在 20 岁左右就会出现早衰症状。相比之下，仅缺乏 WRN 基因的小鼠仅会出现轻微的早衰特征，只有当该基因缺陷与 p53 基因或端粒酶缺陷同时存在时，症状才会加重。突变。另一方面，wrn 缺陷型斑马鱼类在单基因敲除后会表现出特定表型。部分带有((w m^{-1})的**重度**表型个体在幼体阶段会因肠道和胰腺缺陷出现营养不良，而另一些带有((wm-1-)的**轻度**表型个体则会在后续出现生长迟缓与寿命缩短。在人类中，不育生育能力是沃纳综合征的主要临床特征之一。

然而，我们无法评估wrn-/-斑马鱼是否达到性成熟，因为它们在约90天pf时死亡，这与斑马鱼性成熟的典型起始时间相符。本研究中，我们主要关注wrn-/-斑马鱼的幼体阶段，以明确其基础表型。不过，一部分突变体出现晚期死亡，这可能与人类沃纳综合征中观察到的成年发病表现相关。这一晚期死亡阶段为研究疾病的进展特征提供了重要契机，包括细胞衰老、代谢损伤和氧化应激积累。未来针对这些晚期阶段的研究，结合分子衰老标志物和线粒体功能的评估，将有助于阐明早衰的潜在机制，并进一步验证(wrn ^{-1-})斑马鱼作为成年发病型沃纳综合征综合模型的有效性。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。

到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。