题目：Single-cell transcriptomic profiling of zebrafish primary motor neurons reveals subtype-specific gene expression signatures

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.isci.2025.114168

期刊：iScience

研究亮点

l 单细胞转录组学定义斑马鱼初级运动神经元亚型

l 七个pMN簇跨越早期、中期和末期分化状态

l 关键转录因子定义RoP、MiP和CaP神经元的身份

l 受体-配体图谱揭示驱动运动轴突导向的信号

摘要

运动神经元（MNs）将中枢神经系统与骨骼肌相连，实现运动功能。在斑马鱼中，RoP、MiP和CaP这三种运动神经元亚型已通过解剖学明确界定，但其分子特征仍未得到充分研究。我们对发育中的Tg(mnx1:gfp)斑马鱼胚胎开展单细胞转录组学研究，该模型可特异性标记运动神经元，共鉴定出14个细胞簇，其中包括分化中的初级运动神经元。亚群聚类和拟时分析进一步解析出七种初级运动神经元亚型，并将其归为早期、中间和终末分化状态，每种状态均具有独特的基因表达谱，涉及与轴突导向和细胞命运相关的转录因子及膜受体。单分子荧光原位杂交（smiFISH）的空间验证证实了脊髓内亚型特异性标志物的表达。蛋白-蛋白相互作用分析揭示了亚型特异性受体与运动轴突环境中存在的细胞外信号分子之间的潜在相互作用。本研究明确了初级运动神经元亚型的分子特征，为深入了解其身份特征及其在斑马鱼发育过程中参与运动轴突决策的作用提供了新的见解。

图文摘要

引言

运动神经元（MNs）是连接中枢神经系统与肌肉并产生运动的关键结构。运动轴突与其肌肉靶标之间的精准连接对于实现协调运动至关重要。斑马鱼相较于其他脊椎动物结构相对简单，已成为研究运动神经系统发育的强大模型。运动神经元的特化依赖于底板来源的音猬因子（Shh）信号通路，该通路诱导转录因子（TF）olig2的表达；而初级运动神经元（pMNs）的数量则受Delta/Notch信号通路调控。在每个半体节中，根据在脊髓中的位置可识别出三种初级运动神经元亚型：嘴侧初级神经元（RoP）、中间初级神经元（MiP）和尾侧初级神经元（CaP）。受精后17小时（hpf），运动轴突沿共同路径向腹侧延伸，直至抵达水平肌隔这一选择点。在此处，每条运动轴突会分支并支配特定区域：RoP支配外侧肌节，MiP延伸至背侧肌节，CaP则投射到腹侧肌节。在某些情况下，还存在第四种亚型VaP（可变初级神经元），其发育特征与CaP相似，但停留在选择点，最终在受精后36小时发生退化。次级运动神经元（sMNs）在初级运动神经元生成后产生，并在初级运动神经元形成8小时后开始支配肌节。

运动轴突在选择点的发散对于完整的肌神经支配至关重要。pMN的轴突自主导航，彼此独立，但它们的引导取决于与局部细胞外信号的相互作用。发育中的运动轴突由吸引和排斥的引导线索引导，这些线索可以是来自局部微环境的化学或机械信号。化学信号包括沿着运动轴突路径固定的众所周知的扩散分子或蛋白质，也就是接触介导的线索。在生长锥处，受体使MN能够检测和响应细胞外信号。在斑马鱼中，由于它们在未来生长的运动轴突轨迹中的位置，已知慢肌肉前体（也称为近轴细胞）是细胞外引导分子的主要生产者。

在脊椎动物和无脊椎动物中进行的几项研究表明，MN被逐步确定为不同的亚型，每个亚型对轴突引导线索的反应不同。这些亚型由特定的基因表达模式决定，特别是TF，包括LIM同源域蛋白的差异表达。在斑马鱼中，pMN身份的规范还涉及编码LIM同源域TF的基因的调节表达。每个pMN亚型暂时表达LIM基因的特定组合，包括islet1和islet2。LIM基因表达的启动先于pMN分化，这可以通过几个小时后发生的轴突发生来证明。所有pMN在细胞周期退出的同时，轴突发生开始，CaP轴突主要表达islet2，而MiP和RoP轴突则主要表达islet1。有趣的是，哈钦森和艾森 研究发现，尽管islet1和islet2的表达模式受到严格调控，但这两个基因具有冗余功能。这表明可能存在其他因子并行或在上游发挥作用，为pMN亚型赋予特异性。Nkx6.1调控islet1表达的第二阶段，而近轴中胚层衍生的信号也塑造了pMN亚型的身份。然而，在斑马鱼中，我们对pMN身份形成的机制以及运动轴突在选择点发生分化的驱动机制的理解仍然有限。

为填补这一研究空白，我们采用单细胞RNA测序（scRNAseq）技术，对从发育中的Tg(mnx1:gfp)斑马鱼胚胎中分离的运动神经元（MNs）亚型细胞的基因表达谱进行了表征。在该斑马鱼模型中，mnx1启动子可驱动绿色荧光蛋白（GFP）在运动神经元中特异性表达。对测序数据的生物信息学分析揭示了运动神经元前体细胞（pMN）分化过程中获得的亚型特异性基因表达特征，这些特征富含编码转录因子（TFs）以及细胞外信号分子受体的基因。本研究结果为深入全面地理解这些特异性表达特征提供了依据，为阐明运动神经元前体细胞分化的分子机制以及运动轴突导向的调控机制提供了新的见解。

结果

单细胞RNA测序鉴定出转录组特征独特的细胞簇，可重现斑马鱼胚胎中运动神经元的分化阶段

在选择节点，pMN 细胞发生分化，沿着追踪清晰的亚型特异性定型轨迹行进，并支配亚型特异性肌节区域（图1A）。为解析 pMN 亚型的基因表达特征，我们决定对分离的 pMN 细胞进行单细胞 RNA 测序（scRNAseq）。由于 pMN 细胞仅占躯干所有细胞的一小部分（每个胚胎含180个 pMN 细胞），我们在开展 scRNAseq 前，利用 24 小时后肢期（hpf）Tg(mnx1:gfp) 胚胎躯干的异质细胞悬液，对 (GFP+) 运动神经元（MN）群体进行了富集分选（图1B）。对 scRNAseq 数据的无偏聚类分析显示，共得到14个聚类，总计4040个细胞（表S1）；除运动神经元外，这些聚类还包含已知内源性表达 mnx1 的细胞类型，如中间神经元、胰腺细胞和脊索细胞（图1C）。聚类1、2、3和5中富集了 olig2+/sox19a+/pcna+ 细胞，表明它们属于神经元前体细胞（图1D）。在 24 小时后肢期斑马鱼胚胎中，存在处于不同分化阶段的细胞是意料之中的。体节以每30分钟一个的速度沿吻尾方向形成，直至24小时后肢期体节发生完成，这使得同一胚胎中同时存在吻侧成熟体节和尾侧未成熟体节。在斑马鱼中，pMN 细胞和腹侧纵向中间神经元（VeLD）均由 olig2+ 前体细胞分化而来，但后者在退出细胞周期后不表达 islet1。17 我们以 elavl4 作为退出细胞周期神经元的标志物，鉴定出聚类5和8，二者均富集 elavl4+/islet1− 细胞，极有可能对应 VeLD 中间神经元（图1D）。基于 elavl4、islet1 的基因表达水平，以及mnx1，这些是24小时受精后运动神经元前体细胞（pMNs）的已知特征，因此聚类3被归为运动神经元前体细胞（图1D）。据此，我们的数据涵盖了从olig2阳性祖细胞到成熟中间神经元和运动神经元前体细胞的分化阶段。

图1. 斑马鱼运动神经元的单细胞RNA测序分析(A) 24小时受精后斑马鱼胚胎单个半体节中pMN发育的示意图。虚线代表水平肌隔。标注出了RoP（吻侧）、MiP（中间）和CaP（尾侧）初级运动神经元的位置。(B) 单细胞RNA测序分析的分步方案。红色箭头显示解剖方案。散点图展示绿色荧光蛋白荧光强度（x轴）与粒度（y轴）。框选区域指示了分选所选的门控绿色荧光蛋白阳性((GFP+)) pMN群体。(C) 将读数比对至斑马鱼基因组并对荧光激活细胞分选分离的(GFP+)细胞进行聚类后得到的均匀流形逼近和投影（UMAP）图。每个簇用不同颜色突出显示。(D) 展示分离的绿色荧光蛋白阳性细胞中olig2、sox19a、pcna、elavl4、islet1和mnx1表达情况的UMAP特征图。另见表S1。

独特的基因表达特征描绘pMN亚型及分化轨迹

为探究所鉴定的运动神经元前体细胞（pMNs）能否基于其亚身份进行聚类，我们在整个数据集里选取了表达(levels >2)的mnx1阳性细胞（对数归一化表达值），以仅分离出pMNs，并开展了新的聚类分析。该分析得到了7个亚簇，共包含390个细胞（图2A；表S1）。对不同亚簇间重叠的基因标志物分析显示，不同细胞亚型间存在统计学上显著的相似性，这与预期相符，但同时也存在明显差异，表明存在独特的亚型特异性基因特征（图S1A）。对亚簇的拟时序分析揭示了pMNs的成熟进程，其中1号亚簇代表低分化状态，3、6和7号亚簇代表高分化状态。2、4和5号亚簇则包含处于中间分化状态的细胞（图2B）。为进一步阐明运动神经元（MN）分化过程背后的分子机制，我们对参与拟时序轨迹构建的前1000个基因进行了基因本体论（GO）分析。富集程度最高的GO术语包括“轴突发育”“神经元投射形态发生”和“神经元分化”，凸显了与pMNs成熟相关的关键生物学过程（图2C）。截至目前，已鉴定的pMN分化基因标志物仅有少数几种。3,13 原位杂交实验显示，在pMNs分化和特化过程中存在LIM基因表达的连续波次，13,17 这使得在分化细胞中鉴定特定亚型成为一项具有挑战性的工作。因此，我们首先检测了islet1和islet2a在高分化细胞富集的亚簇（3、6和7号亚簇）中的表达情况。结合islet2a在6号亚簇中的高表达与单分子荧光原位杂交（smiFISH）实验结果（图2D和图S1B）——该实验显示第三种运动神经元（MN）中islet2a呈高表达——我们确定6号亚簇为尾侧运动神经元前体细胞（CaPs）。腹侧运动神经元前体细胞（RoP）和内侧运动神经元前体细胞（MiP）亚型在islet1和islet2a的表达谱上表现出高度相似性；不过，基于RoP亚型相较于7号亚簇（我们将其定义为MiP亚型）具有更高的islet1表达水平，我们将3号亚簇归为RoP亚型（图2D）。随后，我们对7个亚簇进行了轨迹分析，结果显示4号亚簇处存在一个分支点。其中一个分支指向7号亚簇（已鉴定为MiP亚型），另一个分支则指向5号亚簇，该亚簇在拟时序分析中直接位于3号亚簇（对应RoP亚型）之前（图2B和图2E）。相比之下，CaP亚型（6号亚簇）似乎遵循一条独特的分化轨迹（图2E）。这些研究结果表明，存在一个共同的前体细胞群（1号亚簇），其后续分化为两种中间前体细胞：一种是CaP亚型的前体细胞（2号亚簇），另一种是RoP和MiP亚型的前体细胞（4号亚簇）。该分析使我们能够追踪关键标志物（包括islet1、islet2a以及此前被鉴定为分化型MiPs标志物的mnx2b）17 在每种pMNs亚型拟时序中的表达模式，如今已能清晰区分RoP与MiP谱系（图2F）。然而，我们的数据并未识别出一个 VaP 亚簇，这可能是因为它们在脊髓中的丰度较低，也可能是因为其基因表达谱与另一个亚型（极有可能是 CaPs）过于相似。

图2. 分化中的pMN神经元展现出独特的基因表达特征

独特的转录因子组定义了运动神经元前体细胞亚型

我们预期，对我们的单细胞RNA测序（scRNAseq）数据集进行整体分析，能更好地反映特定运动神经元前体（pMN）亚型的身份，因为转录因子（TFs）会协同作用以抑制或增强靶基因的表达。因此，我们分析了每种pMN亚型相较于另外两种亚型的前50个差异表达基因（DEGs），以明确pMN亚型之间最显著的特征。这些基因中有许多编码的蛋白质属于转录因子家族、膜受体家族、细胞骨架蛋白家族和离子通道家族nels（图3A；表S3-S5）。我们鉴定出的大量差异表达转录因子基因与神经元细胞命运特化相关，包括Hox蛋白、 Mnx蛋白、Islet蛋白和Sox蛋白。 此外，鉴定出的受体如神经纤毛蛋白和丛蛋白、Robo蛋白、 整合素、 以及神经营养因子受体均与轴突导向有关。离子通道还通过整合机械信号支持轴突生长和导向。例如，我们鉴定为CaP亚型标志物的TRPC3已被证实参与特化神经元网络的发育。此外，多种离子通道对于整合突触信号和产生动作电位至关重要。离子通道的特异性每个pMN亚型中的离子通道差异表明其电生理特性存在变化。值得注意的是，转录因子（TF）基因家族是所有pMN亚型中差异表达最显著的类别，在RoP、MiP和CaP亚型中，前50个基因里分别有10%、28%和14%呈现差异表达（图3A）。部分转录因子在多个pMN亚型中共同表达（表S2）。其中检测到了已被鉴定的转录因子基因标记物，例如CaP簇中的islet2a和MiP簇中的mnx2b。然而，差异表达转录因子的点图分析清晰显示，分化后的RoP、MiP和CaP亚型表达组合特异性的转录因子基因库（图3B）：RoP亚型富含lmo1、mafaa、maff、nfe2l1b、nfe2l3、ebf3b；MiP亚型以cdx4、ddit3、hoxd9a和Jun的表达为特征；而CaP亚型则特异性表达isl2a、mafa、pbx3b、tbx3b和pdrm14。我们基于lmo1（一种共转录因子）以及cdx4和mafa（转录因子）在pMN亚型间的高度显著差异表达，且在可能干扰pMN信号的邻近组织（如肌细胞）中无已知表达，选择这三个基因进行单分子低成本荧光原位杂交（smiFISH）验证。使用靶向所选基因的特异性初级探针进行单分子低成本荧光原位杂交（表S6），结果证实了单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据：lmo1的染色信号主要出现在RoP亚型，cdx4信号集中于MiP亚型，mafa信号则在CaP/VaP亚型中显著表达（定量结果见图3C和3D）。这一发现支持了我们的亚聚类分析和细胞轨迹分析结果（图2E），表明脊髓内这两个相邻亚型即便基因表达谱并非完全相同，也具有高度相似性。对阳性pMN亚型（RoP、MiP、CaP）占比相对于另外两个亚型的定量分析也印证了上述观察（图3D）。此外，在与mafa探针杂交的pMN细胞中，与CaP相邻的四个观察到的VaP细胞均呈阳性。总体而言，这些研究结果表明，pMN亚型表达特异性的转录因子组合，这对确立其细胞身份至关重要，同时也支持了VaP是CaP亚群发生进一步自发性退化和退变的亚群这一假说。

图3. 亚型特异性基因的特征及差异表达 (A) 饼图展示了每种pMN亚型前50个差异表达基因（DEGs）中包含的转录因子（TF）、膜受体、离子通道和细胞骨架相关基因的数量。包括吻侧初级运动神经元（RoP）、中侧初级运动神经元（MiP）和尾侧初级运动神经元（CaP）。(B) 点图展示了三种pMN亚型中差异最显著的转录因子。点的颜色代表基因的平均表达量（对数归一化表达值），点的大小对应每个簇中表达该基因的细胞百分比。(C) 24小时受精期（hpf）Tg(mnx1:gfp)胚胎的全胚原位杂交（FISH），靶向lmo1、cdx4或mafa基因（呈白色）。箭头指示pMN亚型内的染色富集情况。包括吻侧初级运动神经元（RoP）、中侧初级运动神经元（MiP）、尾侧初级运动神经元（CaP）和可变型初级运动神经元（VaP）。比例尺为10微米。(D) 不同亚型（吻侧、中侧或尾侧）中，每种标记物（lmo1、cdx4和mafa）阳性的pMN占其他亚型阳性pMN的百分比。lmo1：(n_pMN=) 6，胚胎数（n_embryos）= 4；cdx4：(n_pMN = 9)，胚胎数= 6；mafa：(n_pMN =7)、(n_embryos = 5)，费希尔精确检验；(^{* * *} p value <0.001)、(^{* * *} p value <0.0001)。另见表S2-S6。

细胞外信号与运动神经元受体的配对决定了选择点处亚型的分化

我们接下来的研究重点是分析膜受体的特异性表达，以及这些受体在向肌肉靶标移动过程中，于所处微环境中可能遇到的细胞外信号与其潜在的相互作用。pMN 亚型细胞会沿着共同的路径行进，直至抵达分支点，随后它们会分化并支配整个肌节。目前，关于这一分支决策的形成机制，相关研究记载仍较为匮乏。因此，我们推测，对 RNA 测序数据进行生物信息学分析，以此预测配体-受体相互作用，或许能为阐明这一机制提供线索。在我们的在单细胞RNA测序（scRNAseq）数据集中，我们鉴定出了几种已知参与运动轴突导向并与细胞外信号分子相互作用的受体，包括 Ephrin、神经纤毛蛋白（neuropilin）、丛蛋白（plexin）、Robo、骨形态发生蛋白（BMP）受体、钙粘蛋白（cadherin）、整合素（integrin）、成纤维细胞生长因子（FGF）以及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）受体。其中，部分受体在所有运动神经元前体细胞（pMN）亚型中均有表达，而另一些则表现出亚型特异性表达（图4A）。我们近期研究表明，分化中的慢肌前体细胞（SMPs）是发育中运动轴突的细胞外导向分子的主要来源。为进一步探究pMN表达的受体与SMP产生的细胞外信号分子之间潜在的相互作用（二者可共同调控运动轴突导向），我们利用此前从分化中的SMPs中获得的单细胞RNA测序数据（SRA：PRJNA973246）。我们借助STRING数据库对每种pMN亚型开展了预测性蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，将本研究中鉴定的pMN受体表达情况（青色标注）与SMP表达的已知结构性导向信号（品红色标注）进行整合（图4B-4D）。内侧运动神经元前体细胞（MiPs）和尾部运动神经元前体细胞（CaPs）均表达itgb1a和itga6b，二者形成整合素α6β1受体，可与基底膜蛋白相互作用：层粘连蛋白γ1（lamc1）、层粘连蛋白α5（lama5）、Ⅳ型胶原α1（col4a1）以及Ⅳ型胶原α2（col4a2）（图4C和4D）。MiPs特异性表达ephb2b和robo1，其已知结合伴侣分别为ⅩⅨ型胶原α1（col19a1）、Netrin 5（Ntn5）和Netrin 1a（Ntn1a）（红色圆圈，图4C），这提示它们在引导MiP轴突向背侧生长并越过选择点抵达肌肉靶标过程中发挥核心作用。我们还分析了预测的受体-配体相互作用与运动轴突路径中存在的可扩散导向信号之间的关联（图S2A-S2C）。例如，尾部运动神经元前体细胞（RoPs）特异性表达bmpr2a，其蛋白产物可与可扩散蛋白Inhbb和Fsta相互作用（图S2A）。CaPs表达ntrk2a，该基因编码Ntrk2a蛋白，已知该蛋白可与Fgf17、神经生长因子B（Ngfb）和血小板衍生生长因子AB（Pdgfab）相互作用（图S2B），而MiPs未表现出亚型特异性的相互作用（图S2C）。这些预测性分析表明，亚型特异性受体与导向信号共同塑造了pMN轴突的导向过程，并为未来的验证研究提供了框架。

图4. 运动神经元前体细胞（pMNs）表达的膜受体与细胞外信号之间的相互作用网络揭示了运动神经元（MN）亚型特异性（A）点图展示了三种pMN亚型中差异表达最显著的膜受体及类受体蛋白。点的颜色代表基因的平均表达水平（对数标准化表达值），点的大小对应每个簇中表达该基因的细胞百分比。（B-D）基于STRING数据库构建的蛋白-蛋白相互作用网络，分别展示了嘴侧初级运动神经元（RoP）（B）、中间初级运动神经元（MiP）（C）和尾侧初级运动神经元（CaP）（D）的受体（青色，ArrayExpress数据库编号：E-MTAB-15160）与慢肌前体细胞表达的结构型细胞外蛋白（品红色，SRA数据库编号：PRJNA973246）之间的相互作用。网络基于富集度(p-value <10^{-16})构建。亚型特异性相互作用以红色圆圈标注，共有相互作用以黑色圆圈标注。RoP（嘴侧）、MiP（中间）和CaP（尾侧）初级运动神经元。参见图S2。

讨论

传统上，三个pMN亚型是根据其在脊髓中的位置进行分类的，但其分子身份仍知之甚少。本研究发现，RoP、MiP和CaP既具有共同的基因表达模式，也存在差异表达模式，这定义了它们独特的分子特征，从而明确证实它们是不同的pMN亚型。pMN亚型的基因表达特征主要包括转录因子和受体。针对细胞外信号分子，这不仅为驱动pMN亚型多样化和运动轴突导向的机制提供了新的见解。

我们的单细胞RNA测序（scRNAseq）数据揭示了运动神经元前体细胞（pMN）亚型内独特的基因表达模式。近期针对小鼠的单细胞RNA测序研究发现，轴突运动神经元（axial MNs）存在三种分子特征不同的亚型。 将这些数据与我们的研究结果对比后，我们发现，在小鼠和斑马鱼的运动神经元亚型之间，MAF、ETS、FOX和EBF家族转录因子（TFs）以及斑马鱼中Pbx3（小鼠Pbx3的同源基因）的同源物Pbx3b等转录因子均存在差异表达（本研究）。同样，包括Nrp1a/Nrp1、Nrp2b/Nrp2、Epha4b/Epha4以及Robo家族在内的轴突导向受体，在不同运动神经元亚型间也表现出显著的差异表达。LIM基因已在多个物种中被证实，是通过调控亚型特化关键转录因子的差异表达来塑造运动神经元身份的关键因子。在斑马鱼中，对LIM基因的研究可追溯至1995年，当时通过常规原位杂交技术完成了相关验证。该研究证实，斑马鱼LIM同源框基因在运动神经元前体细胞中呈组合式表达，不同的运动神经元前体细胞表达这些基因的组合模式各不相同。我们的单细胞RNA测序数据不仅证实了上述发现，还精准揭示了isl1、isl2a以及mnx2b等LIM基因的表达模式。

先前的移植实验表明，pMN 细胞在完成最终分裂后、轴突发生前就已确定了特定的命运。29 对我们单细胞RNA测序数据的生物信息学分析与这些发现相符，证明存在共同的pMN前体细胞，因此pMN亚型的身份并非预先确定，而是在其分化的后期阶段获得的。细胞移植实验显示，LIM同源框基因的表达会影响pMN在脊髓内的位置。13 这些发现早期就表明，pMN细胞表面表达的受体使其能够响应分化信号，而后续研究证实这些信号源自体节中胚层。

对pMN亚型基因表达谱的分析揭示了其在转录因子、膜受体和离子通道上的富集特征。与其他物种的相关研究报道一致，30种转录因子的组合表达指导着运动神经元（MN）的分化与特化：RoP亚型富含lmo1、mafaa、maff、nfe2l1b、nfe2l3、ebf3b基因，MiP亚型以cdx4、ddit3、hoxd9a和Jun基因的表达为特征，而CaP亚型则特异性表达isl2a、mafa、pbx3b、tbx3b和pdrm14基因。单分子荧光原位杂交（Smi-FISH）实验证实，新鉴定出的候选基因可可靠地作为各亚型的标记基因。

膜受体是运动神经元前体细胞在选择点进行轴突寻路和决策的重要参与者。我们之前的研究表明，分化中的脊髓前体细胞是基质组基因的主要来源，这些基因为生长的运动轴突提供及时且空间调控的局部信号，引导其向肌肉靶标延伸。本研究的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析进一步揭示了运动神经元前体细胞表达的受体与分化中脊髓前体细胞产生、且存在于运动轴突路径中的细胞外信号分子之间潜在的体内相互作用。这些分子包括XV型、XVIII型和XIX型胶原蛋白、层粘连蛋白及腱生蛋白C，还包括可扩散的导向因子，凸显了这些相互作用在运动神经元前体细胞轴突导向过程中的复杂性和动态性。最重要的是，我们的配体-受体受体分析揭示了pMN亚型的特异性，这表明尽管所有pMN都遵循共同的路径，但其轨迹在后续阶段出现分化。

虽然膜受体和转录因子（TFs）通常分别与轴突导向31和细胞命运特化12,13相关，但在pMN亚型中差异表达的离子通道基因的发现却出乎意料。此前研究表明，在斑马鱼中，运动神经元（MN）亚型在轴突生长之前以及轴突延伸直至受精后48小时（hpf）期间表现出电生理差异，这提示pMN亚型内离子通道的亚型特异性表达或表达水平存在差异，这与我们的研究结果一致。此外，Kelly等人证实，与次级运动神经元相比，一组在受精后4天（dpf）初级运动神经元中特异性富集的电压门控离子通道基因，能够促进驱动游泳反应的快速放电26。然而，从功能角度来看，目前仍不清楚pMN亚型为何表现出不同的电生理特性。还需要进一步的研究，而本研究对pMN亚型特异性离子通道的鉴定将为这些研究提供助力。

近期的单细胞RNA测序研究揭示了斑马鱼运动神经元（MNs）中广泛的分子多样性。D’Elia及其团队33利用标记运动神经元、中间神经元和少突胶质细胞的olig2转基因品系，对2天胚胎（dpf）的轴性运动神经元进行了图谱分析，鉴定出15种运动神经元亚型，其中多种经验证的标志物（如nrp1a和gfra1b）与本研究中发现的标志物存在重叠。他们还鉴定出mecom和prdm16作为背侧快速运动神经元的标志物，这些基因被证实对快速运动神经元的发育至关重要，不过本研究的数据集未检测到这两个基因。早期研究通过分析olig2:EGFP阳性细胞的转录谱，确定了24小时胚胎（hpf）时期运动神经元前体细胞（pMN）的转录特征34，这与本研究的发现互为补充——本研究中我们借助sox19a1将簇1、2、4和6归为神经元前体细胞（图1D）。此外，针对成年斑马鱼的研究表明，运动神经元亚型的分子多样性会延续至成年期35。总体而言，这些研究为我们结果的对比与验证提供了丰富的框架，同时也凸显了运动神经元亚型特化过程中既保守又具有发育阶段特异性的特征。

总之，我们的单细胞RNA测序分析全面呈现了斑马鱼运动神经系统发育过程中pMN亚型的全貌，研究表明pMN亚型是通过多步过程获得其身份的。我们已鉴定出亚型特异性的基因表达特征，包括转录因子和细胞外信号分子受体，这些特征可能在塑造斑马鱼pMN命运和引导运动轴突轨迹方面发挥关键作用。本研究为进一步探究斑马鱼中运动神经元发育、轴突导向及命运决定的精确机制提供了宝贵资源，也为其他脊椎动物的相关研究提供了重要参考。

本研究的局限性

本研究绘制了斑马鱼pMN亚型的全面转录组图谱，但仍存在一些局限性。分离得到的pMN数量较少，可能导致VaPs等稀有细胞群的代表性不足，以及亲缘关系较近的细胞簇之间出现部分重叠。尽管smFISH验证了选定的基因标志物，但各亚型细胞的鉴定与轨迹重建主要依赖转录组学推断，而非功能验证。同样，预测的配体-受体相互作用基于mRNA表达和数据库驱动的分析，这些方法可能无法反映转录后调控、信号传导动态变化或其他组织来源信号的潜在影响。此外，本研究以斑马鱼为模型，该模型为活体成像和发育分析提供了极佳的可操作性，但可能无法完全涵盖哺乳动物中运动神经元多样化的所有方面。不过，脊椎动物中关键转录程序和导向机制的保守性，支撑了本研究发现的转化意义。

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