题目： Stat3 Controls Cell Movements during Zebrafish Gastrulation

原文链接：https://doi.org/10.1016/s15345807(02)001260

期刊：Developmental Cell

摘要

脊椎动物的体轴形成既需要精准的细胞命运特化，也离不开原肠运动的协同调控。本文研究发现，斑马鱼的信号转导及转录激活蛋白3（Stat3）可被母源 Wnt/β连环蛋白通路在胚胎背侧激活。Stat3 活性缺失的斑马鱼胚胎会出现原肠期细胞运动异常，造成头部位置错位、前后轴缩短，但早期细胞命运特化并未发生缺陷。时序分析、细胞示踪以及移植实验表明：Stat3 以细胞自主方式调控背侧中内胚层细胞的向前迁移；同时以非细胞自主的方式调控邻近旁轴细胞的会聚运动。上述结果证明，Stat3 具备调控原肠胚阶段细胞运动的功能。

引言

脊椎动物原肠胚形成，包含细胞命运特化以及大量细胞群体的协同运动；这些细胞会分化产生外胚层、中胚层和内胚层三个胚层。在进行原肠运动的斑马鱼胚胎中，可以划分出三种形态发生运动：外包、内化与会聚延伸（Warga 和 Kimmel，1990；SolnicaKrezel 等人，1995；CarmanyRampey 和 Schier，2001）。这些运动协同作用，在原肠胚形成末期完成胚胎体轴的构建。目前，调控这类组织重排的分子机制在很大程度上仍不清楚。

背侧组织者在体轴形成过程中发挥关键作用。将组织者进行移植，能够招募周围细胞形成次级体轴（Spemann 和 Mangold，1924；Oppenheimer，1936；De Robertis 等，2000；Saude 等，2000；Schier，2001）。因此，组织者既可以改变邻近细胞的命运，也能够改变其形态发生行为。斑马鱼的组织者由母源 Wnt/β连环蛋白通路诱导产生：该通路一方面通过同源结构域蛋白 Dharma (Dha)/Bozozok (Boz) 介导背化信号；另一方面通过 Nodal 家族蛋白 Squint (Sqt) 介导中内胚层诱导信号（Hirano 等，2001；Schier，2001；Schier 和 Talbot，2001；SolnicaKrezel 和 Driever，2001）。来源于组织者的背侧中胚层细胞，在胚胎后部分化形成脊索，在前部分化为脊索前板（Gritsman 等，2000）。斑马鱼原肠胚中，前部背侧中胚层细胞运动能力极强，被认为会发生活跃的细胞迁移（SolnicaKrezel 等，1995）。整合素信号参与这一过程。在两栖类与小鼠中，中胚层细胞沿着含有纤连蛋白的细胞外基质向前迁移；纤连蛋白由外胚层细胞分泌，中胚层细胞依靠整合素与纤连蛋白发生黏附（Boucaut 等，1984；Darribere 等，1990；George 等，1993；Yang 等，1993）。介导整合素信号的黏着斑激酶（FAK）同样参与原肠期中胚层细胞的迁移过程（Ilic 等，1995）。

虽然脊索前板前体似乎在主动迁移，但将形成体节中胚层的脊索祖细胞及其近轴邻细胞似乎会发生汇聚和延伸运动。在斑马鱼和两栖动物中，轴旁和近轴中胚层组织的细胞在中外侧维度变窄（汇聚），并沿前后方向伸长（延伸）。汇聚和延伸部分是通过中外侧细胞插入实现的。细胞沿中外侧轴的这种重排形成了在该轴上更窄、在前后轴上更长的阵列（Warga 和 Kimmel，1990）。在青蛙组织外植体中，中胚层细胞插入由双极的、朝向中外侧的突起活动驱动，这种活动似乎对相邻细胞施加牵引力，并将细胞彼此拉拽（Keller 等人，2000）。

多项证据表明，非经典 Wnt 信号通路参与调控细胞的极性形态，以及介导 convergent extension 运动的中外侧细胞重排过程。斑马鱼的 silberblick（slb，wnt11）和 knypek（kny，糖蛋白，作为 Wnt 信号的正向调节因子）突变体表现出胚胎轴缩短的表型（Heisenberg 等人，1996；Solnica-Krezel 等人，1996）。重要的是，这些基因对于介导延伸的中外侧细胞重排是必需的，但它们不会改变细胞命运（Heisenberg 等人，2000；Topczewski 等人，2001）。促进 convergent extension 的 Wnt 信号通路并非通过涉及β-连环蛋白的经典通路发挥作用。相反，它遵循一条非经典通路，该通路可能与果蝇中描述的平面细胞极性信号通路相似，其中包含小 GTP 酶 RhoA 和 Rac，以及在 Dsh 下游发挥作用的 Jun 氨基末端激酶级联反应（Mlodzik，1999）。

JAK/STAT通路介导细胞因子相关的生物学作用。STAT家族成员Stat3可被白细胞介素6等多种细胞因子和生长因子激活，并参与细胞在免疫反应、造血作用、神经发生及其他生物过程中，STAT3 参与细胞的增殖、分化与存活（Darnell, 1997; Hirano 等人, 2000）。在皮肤伤口愈合过程中，STAT3 对角质形成细胞的迁移是必需的，但对其增殖并非必需（Sano 等人, 1999），这表明 STAT3 在成体细胞迁移中发挥关键作用。STAT3 基因敲除（((stat3 ^{-1-} ))）小鼠在交配后8.5天前死亡（Takeda 等人, 1997），说明 STAT3 不仅对成体细胞至关重要，对小鼠胚胎的早期发育也不可或缺。STAT 信号通路的发育功能在果蝇和盘基网柄菌中也已有相关报道。果蝇的 JAK/STAT 通路参与体节形成、翅脉形成和性别决定的确定，并且是果蝇眼睛发育过程中平面极性建立的核心（Zeidler 等人, 2000）。盘基网柄菌的 STAT 对于早期发育过程中正常的趋化作用、终末分化期间前柄细胞的正确移动是必需的，同时它还作为抑制子调控柄特异性基因的表达（Williams, 2000）。这些研究结果提示，脊椎动物的 STAT 蛋白可能也在发育过程中的形态发生运动中发挥作用。在斑马鱼胚胎中，stat3、jak1 和 jak2b 在原肠胚形成前表达；相比之下，stat1、stat5 和 jak2a 则在原肠胚形成后表达（Conway 等人, 1997; Oates 等人, 1999; S.Y. 和 T.H.，未发表数据）。

本研究报道，斑马鱼Stat3在中囊胚过渡后不久即发生磷酸化，并定位于背侧细胞核中。该激活由母体Wnt/-catenin通路介导，但不依赖于Dharma/Bozozok或Nodal信号通路。Stat3活性并非细胞命运特化所必需，但对于前向迁移以及会聚和延伸过程至关重要。这些结果证实了Stat3在原肠胚形成过程中调控细胞运动的作用。

结果

Stat3 在背侧被母体 Wnt/-连环蛋白通路激活

斑马鱼 stat3 基因在囊胚期呈全身性表达，随后在原肠胚期定位于轴中内胚层的最前端区域（Oates 等人，1999）。由于 Stat3 的活性受细胞外信号的翻译后调控，stat3 RNA 的表达并不能反映 Stat3 的活性位点。既往研究表明，Jak 酪氨酸激酶会磷酸化 Stat3 C 端区域的一个保守酪氨酸残基（斑马鱼 Stat3 中的酪氨酸 708），这一过程可激活 Stat3。激活后的 Stat3 通过 SH2 结构域与磷酸化酪氨酸的相互作用形成二聚体，随后进入细胞核诱导靶基因表达（Darnell，1997）。

为检测 Stat3 的活性形式，我们制备了针对斑马鱼 Stat3 中含磷酸化酪氨酸 708 肽段的单克隆抗体。在中囊胚过渡（MBT）后不久，我们首先在囊胚层细胞和一侧卵黄合胞体层（YSL）的细胞核中检测到了酪氨酸磷酸化 Stat3（pStat3；图 1A-C）。此后，在原肠胚早期，pStat3 仅局限于背侧下胚层（中内胚层）细胞和卵黄合胞体层（图 1D-F）；在原肠胚晚期和分节早期，轴前中内胚层中 Stat3 的酪氨酸磷酸化信号仍保持微弱表达（图 1G-I）。

图1. 斑马鱼胚胎中Stat3的激活(A–I) 采用抗磷酸化信号转导与转录激活因子3（pStat3）抗体进行整体免疫染色，分析了球体期（A–C）、盾状期（D–F）、芽基期（G）和六体节期（H–I）的胚胎。(A、D和I) 动物极视角；背部朝右。(B、E、G和H) 侧面视角；动物极朝上，背部朝右。(C和F) 矢状切片。(J–L) 对注射10纳克四碱基错配Stat3反义吗啉代寡核苷酸（Stat3D4-MO [J]）、10纳克Stat3反义吗啉代寡核苷酸（Stat3-MO [K]）、10纳克Stat3-MO与100皮克stat3信使核糖核酸（mRNA）共注射的球体期胚胎，使用抗pStat3抗体分析Stat3的激活情况。动物极视角；背部朝右。每个实验均对至少十枚胚胎进行，图中展示典型结果。

为验证抗 pStat3 单克隆抗体的特异性，我们通过注射 Stat3 反义吗啉代寡核苷酸（Stat3-MO，一种特异性翻译抑制剂；Nasevicius 和 Ekker，2000）后，采用整体免疫染色法检测 pStat3 的表达情况。结果显示，注射 Stat3-MO 的胚胎在囊胚期和原肠胚期均无法检测到 pStat3（图 1K）。相反，注射四碱基错配的 Stat3 反义吗啉代寡核苷酸（Stat3D4-MO）对 Stat3 的酪氨酸磷酸化无影响（图 1J）；而同时注射 Stat3-MO 与仅含 5 个碱基与 Stat3-MO 重叠的野生型 stat3 RNA 可恢复 pStat3 信号，但注射野生型 stat5 RNA 则无法恢复（图 1L，数据未展示）。上述数据表明，Stat3 在中囊胚过渡后不久即于背侧被激活。背侧命运的形成（Moon 和 Kimelman, 1998; De Robertis 等人, 2000; Schier, 2001）。为了检测 Stat3 的激活是否位于母源 Wnt/β-连环蛋白信号通路的下游，我们在母源 Wnt/β-连环蛋白信号通路被上调或下调的胚胎中，使用抗磷酸化 Stat3 抗体进行了整体免疫染色。紫外线（UV）处理（Kao 和 Elinson, 1988）会抑制母源 Wnt/β-连环蛋白通路的激活（Jesuthasan 和 Stahle, 1997），它完全抑制了 Stat3 的酪氨酸磷酸化；而氯化锂（LiCl）处理（Kao 和 Elinson, 1988）通过抑制 GSK3 的活性激活母源 Wnt/β-连环蛋白通路，却诱导了 Stat3 的异位酪氨酸磷酸化（图 2A–2C）。此外，Wnt8 的过表达（Smith 和 Harland, 1991; Sokol 等人等人，1991年）以及β-连环蛋白的激活形式N-β-连环蛋白（Pai等人，1997年）会导致Stat3发生异位酪氨酸磷酸化，而Tcf-3显性负相形式N-Tcf3（Molenaar等人，1996年）则抑制了Stat3的酪氨酸磷酸化（图2D-2F）。这些结果表明，母体Wnt/β-连环蛋白通路通过依赖Tcf转录因子的基因表达方式调控Stat3的激活。同源盒蛋白Dha/Boz和Nodal相关蛋白Sqt均被鉴定为母体Wnt/β-连环蛋白信号通路的靶基因，且参与组织者的形成（Yamanaka等人，1998年；Fekany等人，1999年；Kelly等人，2000年；Shimizu等人，2000年；Sirotkin等人，2000年；Ryu等人，2001年）。EGF-CFC蛋白Oep是脊椎动物发育过程中Nodal信号通路必不可少的细胞外辅因子，同样参与组织者的形成（Gritsman等人，1999年）。为阐明囊胚晚期Stat3激活与其他背侧事件的关系，我们检测了boz、sqt和MZoep突变胚胎，以及注射sqt、活性形式的Activin受体IB（ActRIB）或活性形式smad2 mRNA的胚胎中Stat3的激活情况。所有这些胚胎在囊胚晚期均表现出正常的Stat3酪氨酸磷酸化（图2G-2L）。原肠胚期背侧另一条活跃的通路是Slb/Wnt11介导的非经典Wnt信号通路。slb突变胚胎和注射wnt11 mRNA的胚胎在囊胚晚期也均表现出正常的Stat3酪氨酸磷酸化（图2M和2N）。这些结果表明，Stat3的激活不依赖于Dharma/Bozozok、Nodal和Wnt11信号通路，提示母体Wnt/β-连环蛋白通路中尚未被鉴定的靶基因参与了背侧区域Stat3信号通路的激活。

图2. 斑马鱼胚胎中Stat3激活的调控（A-L）对照组（A）、经氯化锂处理（75%，(n=28)：[B]）、经紫外线处理（83%，(n=36)；[C]）、注射100 pg wnt8（86%，(n =) 29；[D]）、注射100 pg N-β-连环蛋白（81%，(n=27)；[E]）、注射100 pg N-Tcf3（75%，(n=28)；[F]）、bozozok突变体（70%，n=30；[G]）、squint突变体（63%，(n=32)；[H]）、MZoep突变体（84%，(n =) 37；[I]）、注射100 pg squint mRNA（87%，(n=30)；[J]）、注射100 pg 激活型ActRIB mRNA（81%，(n=27)；[K]）、注射100 pg 激活型smad2 mRNA（81%，(n=32 ;[L])；[L]）、slb突变体（92%，(n=12)；[I]）以及注射100 pg wnt11 mRNA（93%，(n=30)；[I]）的胚胎中Stat3的激活情况；采用抗pStat3抗体对囊胚期胚胎进行分析。（A-N）动物极视角；背侧朝右。免疫染色后对突变体进行基因型鉴定。

缺乏Stat3活性的胚胎中头部定位异常与前后轴缩短

为探究Stat3在斑马鱼胚胎早期发育中的作用，我们利用Stat3-MO分析了Stat3活性缺失的胚胎。注射Stat3-MO的胚胎在原肠胚形成末期出现头部位置异常、前后轴缩短的表型（图3B、3C）。在正常胚胎中，位于动物极附近的最前端轴中内胚层——原结，在注射Stat3-MO的胚胎中定位于背赤道位置（图3B、3C，箭头）。注射Stat3-MO的胚胎背赤道区域出现异常增厚（图3B、3C，星号），标记基因表达分析显示该区域发育为脑组织（图5A-5C）。因此，注射Stat3-MO的斑马鱼胚胎中，最前端区域相对于其在动物极的正常位置发生了90°的植物极位移。注射Stat3-MO的斑马鱼胚胎中仍可见下胚层，但该层出现缩短与增厚现象（图3B、3C，箭头）。注射Stat3-MO的斑马鱼胚胎中，脊索与体节在形态上无明显区分（图3F），但标记基因表达与细胞示踪分析表明，其轴旁中胚层区域更宽在原肠胚形成末期沿中外侧轴（图5H、5I、5K、5L、6D、6H、6L和6P）。相比之下，注射Stat3D4-MO未产生任何明显表型（图3A）。此外，Stat3-MO注射引起的异常表型可通过共注射野生型stat3 RNA挽救，而野生型stat5 RNA则无法挽救（图3D及未显示数据）。结合Stat3-MO胚胎中不存在磷酸化Stat3（图1J-1L）的结果，这些研究表明Stat3-MO特异性影响Stat3的翻译，并证实Stat3活性参与原肠胚形成过程中的细胞命运特化和/或细胞运动。

图3. Stat3介导的信号通路在早期胚胎发生中的作用处于1体节阶段的活胚胎；动物极朝上，背侧朝右（A-D）或背侧视图（E-F）。（A和E）注射10纳克Stat3D4MO的正常对照胚胎（86%，(n=42))）；（B、C和F）通过注射10纳克Stat3-MO敲低Stat3的胚胎（严重表型[B]和[F]占67%，中度表型[C]占33%，(n=36)）；（D）在单细胞阶段注射100皮克编码Stat3的mRNA后，再注射10纳克Stat3-MO的胚胎表型。共注射stat3 mRNA的Stat3-MO注射胚胎在1体节阶段表现出完全挽救（79%，(n=33)，3）。头部、原结（下胚层最前端部分）和脊索中胚层的位置分别用星号、箭头头和箭头标出。

Stat3 对原肠胚形成过程中的细胞运动至关重要，但对内胚层中胚层复合物或组织者的形成并非必需

为了更详细地分析Stat3敲低胚胎的形态发生，我们在原肠胚形成期间进行了时间进程分析。该表型在原肠胚晚期表现明显，此时注射Stat3-MO的胚胎中，原结形成的位置更靠后（图）4E和4J图中的箭头所示），这表明轴中内胚层的向前移动受到严重抑制，而内化运动则正常。与此相符的是，在盾状期，注射Stat3-MO的胚胎中，胚环（由边缘细胞内化形成的中内胚层下胚层）和胚盾（背侧边缘的增厚结构，即原肠胚组织者）均清晰可见（图4A和4F）。此外，在原肠胚晚期，注射Stat3-MO的胚胎中出现了明显的植物极-腹侧增厚（图4E和4J图中的箭头），这说明注射Stat3-MO的胚胎中，腹侧-外侧下胚层细胞的背侧汇聚运动有所减弱。在注射Stat3-MO的胚胎中，推动细胞向植物极移动的外包运动正常进行。综上，这些结果表明，Stat3敲低的斑马鱼胚胎保留了在原肠胚形成过程中形成中内胚层、组织者以及背腹轴和前后轴极性的能力，同时也能启动内化和外包运动。相比之下，在Stat3-MO处理的胚胎中，轴中内胚层细胞无法向前移动，非轴中胚层细胞的背侧汇聚运动也受到抑制，最终导致头部定位和前后轴延伸出现严重缺陷。

图4. 原肠胚形成期Stat3缺失胚胎的形态发生(A-E) 注射了Stat3D4- (MO;)的正常对照胚胎，同一胚胎在各发育阶段均有展示。(F–J) 注射了Stat3-MO的Stat3敲低胚胎，同一胚胎在各发育阶段均有展示。动物极朝上，背侧朝右。65%、75%和90%分别代表65%、75%和90%外包期。箭头头指示背侧下胚层的前缘。注意胚胎盾的形成（[A]和[F]中的箭头头）、下胚层和原基（[E]和[J]中的箭头头）。在正常对照胚胎中，尾芽于外包期末在植物极形成（[E]中的箭头）。在Stat3敲低胚胎中，植物极-腹侧增厚现象（[J]中的箭头）十分明显。

多个标记基因的表达情况也凸显出与Stat3功能丧失相关的形态学异常。在原肠胚晚期注射了Stat3-MO的胚胎中，表达goosecoid（gsc）的区域（由前脊索中胚层（潜在的前脊索板组成））位于背内侧位置，而非正常胚胎中的动物极（图5D，箭头头）。原肠胚期背中线处ntl/brachyury的表达区域代表脊索中胚层（潜在的脊索），在注射Stat3-MO的胚胎中该区域更短更宽（图5E和5H，箭头头）。类似地，在Stat3-MO注射的胚胎中，轴旁中胚层中axial（axl）/foxA2（图5F和5I，箭头头）和cyclops（图5K）的表达区域沿中外侧方向扩张，且沿前后轴方向缩短。此外，原肠胚晚期表达axl/foxA2的内胚层前体细胞在注射Stat3-MO的胚胎中位置异常（图5F和5I，箭头）。

与原肠胚晚期阶段Stat3缺陷胚胎中正常的命运特化和区域化一致，这些基因在发育早期阶段的表达也正常。在Stat3缺陷的斑马鱼胚胎中，囊胚晚期的中胚层诱导信号sqt（图5P）、原肠胚早期的全中胚层标记基因ntl/ brachyury（图5M）以及slb/wnt11均正常表达（图5J），背侧化因子Chordin和腹侧化因子Bmp2的编码基因也是如此（图5N和图5O）。与此一致，在Stat3-MO注射的胚胎中，背侧化信号dha/ boz以及抗背侧化因子vega1/ vox在囊胚晚期也正常表达（图5Q和图5R）。这些结果表明，Stat3通过影响细胞运动在原肠胚形成过程中发挥关键作用，而未显著改变中胚层内胚层细胞的早期命运特化。值得注意的是，在Stat3缺陷胚胎中观察到的这些形态和基因表达模式异常，与突变体所表现出的异常相似存在会聚延伸运动缺陷（Heisenberg 等，2000；Sepich 等，2000；Topczewski 等，2001）。

图5. Stat3敲低胚胎中的标记基因表达通过整体原位杂交技术检测mRNA的表达。(A–F、N–O和Q–R) 为侧视图，动物极朝上，背侧向右侧。(G–I、K和L) 为背视图，动物极朝上。(J、M和P) 为动物极视图，背侧向右侧。单体节阶段前脑的anf (A)和six3 (B)以及中脑-后脑边界的pax2 (C)的表达情况。胚盾期原索前中内胚层中goosecoid (D和G，箭头所示)的表达。胚盾期脊索中胚层和边缘区no tail/brachyury (E和H，箭头所示)的表达。胚盾期轴中胚层和内胚层前体细胞中axial/foxA2 (F和I，箭头和箭头所示)的表达。盾期中胚层中silberblick/wnt11 (J)的表达。90%外包期轴中胚层中cyclops (K)的表达。单体节期体节前中胚层中papc (L)的表达。盾期中胚层中no tail/brachyury (M)的表达。盾期背侧区域中chordin (N)的表达。盾期腹侧区域中bmp2 (O)的表达。30%外包期中内胚层前体细胞中squint (P)的表达。30%外包期背侧卵黄合胞体层中dharma (Q)的表达。30%外包期与dharma表达细胞互补的区域中vega1 (R)的表达。每个实验均使用至少十枚胚胎进行，图中展示典型结果。

Stat3 是轴性中胚层向前迁移运动以及非轴性中胚层向背侧迁移运动所必需的分子

为进一步阐明Stat3 如何调控原肠胚形成过程中的细胞运动，本研究利用4,5二甲氧基2硝基苄基（DMNB）笼锁荧光素葡聚糖，在斑马鱼胚胎中开展细胞示踪实验（Kozlowski 等，1997；Sepich 等，2000；Topczewski 等，2001；图 6）。将笼锁荧光素分别与 Stat3D4MO（错配对照吗啉代）或 Stat3MO（Stat3 敲降吗啉代）共同注射至一细胞期胚胎。在盾片期，通过紫外光介导的脱笼反应标记胚胎盾区细胞，并追踪这些细胞在原肠运动过程中的位置变化。

在注射对照Stat3D4MO 的胚胎中，原肠运动结束后，被标记细胞分布于背侧轴性下胚层，沿前后轴（AP 轴）全长排布（图 6A6C、6Q；121±12°，n=10），该结果与以往报道一致（Topczewski 等，2001）。与之相反，在注射 Stat3MO 的胚胎中，标记细胞的向前迁移运动受到严重干扰，造成轴性中内胚层缩短（图 6E6G、6Q；56±5°，n=10）。共注射野生型stat3 mRNA，能够挽救由 Stat3MO 注射引发的向前迁移能力缺陷（图 6Q；131±18°，n=10）。

我监测背面的融合运动，细胞在胚盘边缘，90“从背面的胚胎盾，在盾阶段被标记。在胚层形成过程中，Stat3D4-M0注射的胚胎中的标记细胞向背部和前部移动（图6I-6K和6R；62 + 8”，n - 10），并在胚期的末端沿前后轴延伸（见下文），如先前报道（Sepichet al.，2000；Topczewski et al.，2001）。在Stat3-MO-注入的胚胎中，前部运动（见下文）和侧中胚层细胞向背侧的汇聚严重受损（图6M-60和6R；14 + 8“, n - 10).迁徙减少由Stat3-MO注射引起的侧向中胚层细胞活性通过与野生型stat3RNA的共注射被挽救(图6R;60+9"，n=10)

接下来，我们检测了细胞运动缺陷由细胞命运决定改变导致的可能性（Sepich 等人，2000；Topczewski 等人，2001）。尽管背侧运动受损，注射 Stat3-MO 的胚胎中标记的侧细胞仍能正常进行细胞特化，这一点可由其表达的体节旁原钙粘蛋白（papc；Yamamoto 等人，1998；图6L和6P）得到证实。此外，形成中的体节中 papc 的表达范围更广，反映出汇聚过程减弱（图5L）。值得注意的是，注射 Stat3-MO 的胚胎中标记的细胞阵列更短（图6M-6O；38±3微米至464±53微米，(n=10)，变化幅度为12倍），短于注射对照 Stat3D4-MO 的胚胎（图6I–6K；389微米至6264微米，(n=10)，变化幅度为16倍），这表明侧部组织的伸展运动也受到了影响。这些数据表明，与表型和基因表达分析结果（图3-5）一致，Stat3 对于轴中胚层内胚层的前部运动、非轴中胚层内胚层的汇聚和伸展是必需的，且不会影响细胞命运的特化。

图6. 原肠形成过程中Stat3对细胞协同运动的必要性

Stat3在原索前板前体细胞迁移中发挥细胞自主性作用，在体旁细胞汇聚过程中发挥非细胞自主性作用

为了探究 Stat3 在这些细胞运动中是通过细胞自主性还是非细胞自主性方式发挥作用，我们将从 Stat3 敲低胚胎中获取的卵裂球移植到正常胚胎中，反之亦然（Ho 和 Kane，1990；图7）。将来自注射了 Stat3-MO 的供体胚胎和注射了 Stat3D4-MO 的对照供体胚胎的胚盾处的前脊索中胚层（PCME）细胞，共移植到注射了 Stat3D4-MO 的正常宿主胚胎的胚盾深层。来自对照供体的 PCME 细胞向前迁移至动物极（图7A，绿色；图7I，泳道1；656 (n=10)）。在相比之下，被移植的Stat3缺陷细胞未能迁移（图7A，红色部分；图7I，泳道2；(5 pm 4^{circ})、(n=) 10）。原肠胚形成结束时，来自对照组胚胎和Stat3缺陷胚胎的细胞在正常宿主胚胎中被分离到不同位置（图7A）。此外，当实验当使用Stat3 敲降的宿主胚胎开展该移植实验时，来自对照供体的细胞依旧能够向前迁移，脊索前垫（polster）与头部在动物极附近形成（图 7B，绿色；图 7I，第 4 泳道；58±8°，n=10）。在正常对照宿主胚胎中，共注射野生型stat3 mRNA 可以挽救 Stat3MO 处理细胞受损的向前迁移能力（图 7C，红色；图 7I，第 3 泳道；66±3°，n=10）；在 Stat3 敲降宿主胚胎中同样可以实现表型回救（图 7D，红色；图 7I，第 6 泳道；62±3°，n=10）。以上结果表明：Stat3 以细胞自主的方式调控脊索前中内胚层的向前迁移。此外，当移植的野生型脊索前中内胚层（PCME）细胞迁移正常时，Stat3 敲降宿主胚胎的前脑区域位置也变得更接近正常（更靠前）（图 7B、7D）。该结果提示：移植的野生型脊索前细胞，能够对前脑等邻近组织的定位产生非细胞自主效应。

随后，我们将来自Stat3-MO注射供体胚胎和Stat3D4-MO注射对照供体胚胎的侧方原肠胚边缘(LME)细胞，共移植到已注射Stat3D4-MO的正常盾状期胚胎的侧方原肠胚边缘。来自对照供体和Stat3耗竭供体的LME细胞以相似的方式向背侧聚集(对照供体:图7E，绿色和图7J，第1条;68+3"，n=10;Stat3耗竭供体:图7E，红色和图7J，第2条;70+4"n=10)。相比之下，当将这些细胞移植到已注射Stat3-MO的盾胚期胚胎的外侧原肠胚边缘时，它们未能向背侧聚集(对照组:图7F，绿色和图7J，第3条;25+4"，n=10;Stat3耗竭组:图7F，红色和图7J，第4条;25+4"，n=10)。在注射Stat3-MO时观察到的聚集减少现象.将上述细胞移植至 Stat3 敲降的宿主胚胎后，把来源于 Stat3D4MO 注射供体胚胎的脊索前中内胚层（PCME）细胞移植到宿主的盾区，能够回救该会聚运动缺陷（图 7G，红色；图 7J，第 5 泳道；67±4°，n=10）。原肠运动结束时，来自 Stat3D4MO 注射供体胚胎盾区的脊索前中内胚层（PCME）细胞，可在 Stat3 敲降宿主胚胎中迁移至脊索前中内胚层的最前端位置（图 7G，绿色）。与之相比，若将 Stat3D4MO 注射供体的外侧中内胚层（LME）细胞移植到 Stat3MO 处理宿主胚胎的盾区，则无法挽救外侧中内胚层细胞的会聚缺陷（图 7H，红色；图 7J，第 6 泳道；25±4°，n=10）。以上结果表明：Stat3 以非细胞自主的方式调控旁轴中胚层的会聚运动，且该功能依赖迁移中的脊索前中内胚层细胞所具备的 Stat3 活性。综合上述实验证据说明：来源于组织者的细胞需要 Stat3，通过细胞自主与非细胞自主两种机制协同调控原肠胚阶段的各类细胞运动。

图7. Stat3在原肠胚形成过程中的细胞自主性与非自主性作用

讨论

依赖Wnt/β-连环蛋白的Stat3活性调控原肠运动期间的细胞运动

我们的研究证实，背侧中内胚层中Stat3的活性对于原肠胚形成过程中的正常细胞运动至关重要。Stat3的活性是前脊板细胞向前迁移所自主必需的；同时，在这些细胞中，Stat3的活性对于旁轴中胚层汇聚的非自主效应也是必不可少的。有五条证据支持这样的观点，即Stat3的活性在原肠胚形成过程中控制细胞运动，而不影响早期细胞命运特化。首先，所有检测的标记基因在Stat3-吗啉代寡核苷酸（Stat3-MO）处理的胚胎中仍有表达。其次，在 Stat3 敲降的胚胎中，前部背侧中内胚层的形态特征在整个原肠胚形成阶段均可观察到，但在原肠胚晚期，该组织的位置发生偏移（图 3、图 4）。第三，Stat3 敲降胚胎中，原肠胚早期的中内胚层特异性基因表达正常，并且该表达状态可维持至原肠胚晚期；然而在原肠胚晚期，这些基因的表达区域发生错位（图 5D5F）。第四，在 Stat3 敲降的斑马鱼胚胎内，晚囊胚期与原肠胚早期的中内胚层诱导信号、背化因子和腹化因子的表达均无异常（图 5M5R）。最后，尽管向背侧的迁移运动受损，但注射 Stat3MO 胚胎的外侧细胞依旧可以完成正常的细胞命运特化（图 6L、6P）。

我们发现，包括未来组织者区域在内的胚胎背侧的Stat3 激活，由母源 Wnt/β连环蛋白通路介导，并且需要 Tcf 转录因子参与，但该激活过程不依赖 Dharma/Bozozok 信号或者 Nodal 信号通路（图 1、图 2）。与此一致，boz突变体并不会出现与会聚延伸运动缺陷相关的形态异常（SolnicaKrezel 等，1996；SolnicaKrezel 和 Driever，2001）。但 Stat3 敲降胚胎的头部位置错位表型，与 Nodal 信号通路突变体（例如 MZoep 或者cyc;sqt双突变体）的缺陷十分相似（Feldman 等，1998；Gritsman 等，1999）。由于人为调控 Nodal 活性并不会影响 STAT 信号，反之亦然；本研究结果表明 Nodal 信号通路与 Stat3 呈平行作用模式。可以推测，这两条通路会汇聚作用于某些共同的下游基因，而这些基因是头部正常定位所必需的。有意思的是，已有研究报道 Smad 通路与 Stat 通路之间存在相互作用：在胎儿大脑的协同信号传导中，p300 作为桥梁介导 Stat3Smad1 复合物的形成（Nakashima 等，1999）。

我们的结果表明，早期胚胎发生过程中能够激活 Stat3 的上游分子是母源 Wnt/β连环蛋白通路的下游靶基因，该分子并非 Squint 或者 Dharma/Bozozok（图 2）。现已报道多种受体可以激活 Stat3；敲除 gp130、LIFR、CNTFR、PDGFR、EGFR 以及 HGFR 的小鼠均会发生胚胎致死。但是，stat3⁻/⁻基因敲除小鼠的胚胎死亡时间要早得多（Takeda 等，1997）。因此，在早期胚胎发生阶段，Stat3 的激活可能依赖某种尚未被鉴定的细胞因子或生长因子；该因子属于母源 Wnt/β连环蛋白通路的靶分子（图 7K）。

Stat3 在脊索前板祖细胞迁移过程中的细胞自主性需求

在弦板前原基迁移中，Stat3如何自主调节弦板前原基的前向迁移?在非洲爪蟾胚胎中，Gsc启动了弦板前细胞的主动迁移(Niehrs等人，1993)。然而，gsc在Stat3缺陷的斑马鱼胚胎中正常表达(图5D和5G及未显示的数据)。在小鼠、两栖动物和果蝇胚胎中，整合素、FAK、细胞骨架重组调节因子(小GTP酶)及其激活因子已被证实参与原肠胚形成期间中胚层细胞的迁移(Yang等人，1993;llic等人，1995;Barrett等人,1997;Hacker和Perrimon,1998)。最近的一份报告表明Stat3与....·.直接结合RaclGTP酶(Simon等人，2000)表明，这种相互作用是Stat3在轴状中内胚层前向迁移中细胞自主性需求的可能机制之一。或者，Stat3可能通过趋化因子信号调节粘附分子的激活，该信号整合了造血和胚胎发生中的定向细胞运动。在小鼠原肠胚形成期间，趋化因子受体CXCR4及其配体基质细胞衍生因子-1(SDF-1)分别表达于迁移的细胞(中胚层和终末内胚层)以及胚胎外胚层细胞中(McGrath等人，1999)。此外，SDF-1/CXCR4信号通路可激活人类T细胞系中的JAKs/STATs通路 (Vila-Coro等人，1999)。

Stat3在体节中胚层汇聚延伸中的非细胞自主性需求

斑马鱼 Slb/Wnt11 此前已被证实可通过非经典 Wnt 通路调控斑马鱼原肠胚形成过程中的会聚延伸运动（Heisenberg 等人，2000）。这些及其他研究结果表明，控制果蝇平面细胞极性的 Wnt/fz/dsh 信号级联的脊椎动物同源物，同样是原肠胚形成过程中会聚延伸运动所必需的。我们现在发现，Stat3 也参与了体节中胚层的会聚延伸过程。在 Stat3 敲低的胚胎中，wnt11 的表达正常；而在 slb/wnt11 突变体中，Stat3 的激活也正常（图 2M、2N 和 5J）。此外，Stat3 是轴中胚层细胞所必需的（图 1A-1I、图 7G 和 7H），而 Slb/Wnt11 则在更外侧的细胞中发挥作用（Heisenberg 等人，2000）。这些结果表明，Slb/Wnt11 和 Stat3 在调控会聚延伸过程中平行发挥作用。在果蝇眼睛形态发生过程中，通过调控第二个信号分子，JAK/STAT 信号通路以非细胞自主性的方式决定小眼极性（Strutt 和 Strutt，1999）。小眼似乎能感知第二个信号的局部梯度并相应地发生旋转。我们的研究结果提示，不仅保守的 Wnt/fz/dsh 相互作用，而且 JAK/STAT 信号通路，都同时调控果蝇的小眼极性和脊椎动物的会聚延伸过程（图 7L）。

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