题目：  DNA template strand segregation in developing zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.09.001

期刊：Cell Chemical Biology 

摘要

姐妹染色单体的不对称遗传长期以来被预测与子细胞的不一致命运相关，甚至被假设可最大限度减少干细胞中突变的积累。本研究利用（20S）-20-脱氧-20-氟-5-乙炔基尿苷（F-ara-EdU）、溴脱氧尿苷（BrdU）和光片显微镜对整条斑马鱼的胚胎DNA进行追踪。幼体发育过程中，视网膜、大脑和肠道干细胞微环境中的旧DNA模板链会快速耗竭。长期保留标记的细胞是在发育后期恢复复制的静止前体细胞。高分辨率显微镜观察未在(>100)对子细胞对中发现模板链不对称分离的证据，这表明在发育中的斑马鱼体内，不对称DNA分离不太可能根据永生链假说减少突变负荷。

图文摘要

引言

染色体DNA以半保留方式进行复制（Meselson和Stahl，1958），由此产生不同年代的DNA链。细胞分裂时，每对姐妹染色单体中最古老的DNA模板链可随机或非随机地分配到两个子细胞中。最古老模板链的不对称遗传，这一过程被称为非随机模板分离（NRTS），于1966年首次在哺乳动物细胞中被观察到（Lark等人，1966）。自那以后，关于这一现象的潜在功能、作用机制以及进一步的证据，一直存在争议。

非随机链分离（NRTS）的一个拟议作用是保护干细胞基因组免受突变影响，这一机制被称为“永生链假说”（凯恩斯，1975年）。该假说提出，在干细胞不对称分裂过程中，维持干细胞状态的子细胞会继承最古老的模板链，以最大限度减少干细胞库中DNA复制拷贝等过程产生的累积突变。近期对永生链假说的一个修正版本认为，干细胞分裂时并非必然发生非随机链分离，仅当DNA复制叉减速或停滞的复制应激出现时才会发生（查维尔与兰多，2013年）。也有假说认为，非随机链分离是维持细胞身份表观遗传记忆的一种机制（兰兹多普，2007年）。根据这一“沉默姐妹假说”认为，继承母细胞身份的子细胞同时也会获得模板链，这些模板链携带着母细胞的表观遗传特征。NRTS 所具备的潜在功能颇具吸引力，但其存在的相关证据一直存在争议。体外实验中，研究人员在多种哺乳动物细胞类型中均观察到了 NRTS 现象，这些细胞包括胚胎干细胞（Elabd 等人，2013）、乳腺上皮细胞（Bussard 等人，2010）、肌肉干细胞（Shinin 等人，2006；Conboy 等人，2007）、毛囊细胞（Huh 等人，2011）、角质形成细胞（Jia 等人，2016）、神经干细胞（Karpowicz 等人，2005）以及心脏祖细胞（Sundararaman 等人，2012）。而 NRTS 在体内是否发生、以及发生的程度如何，目前仍不明确。体外实验已证实小鼠肌肉干细胞中存在 NRTS 现象（Shinin 等人，2006；Conboy 等人，2007）。然而，研究人员并未在小鼠胚胎新皮层（Fei 和 Huttner，2009）或造血干细胞（Kiel 等人，2007）中发现 NRTS 存在的证据。与体外研究结果相悖的是，体内毛囊组织中并未观察到 NRTS 现象（Waghmare 等人，2008；Sotiropoulou 等人，2008）。关于肠道干细胞中 NRTS 的体内研究结果也相互矛盾（Potten 等人，1978，2002；Quyn 等人，2010；Escobar 等人，2011；Schepers 等人，2011）。现代测序技术实验也得出了不一致的结论，关于 NRTS 及其抑制突变的能力（Tomasetti 和 Bozic，2015；Werner 和 Sottoriva，2018）。为进一步解析 NRTS 的功能与作用机制，研究人员仍需开展深入研究。重要的是确定NRTS是否发生在体内的干细胞微环境中。细胞培养条件会显著影响NRTS的发生频率（Pine等人，2010年），这一事实凸显了这一研究需求。传统DNA标记技术的技术局限性使得长期追踪模板DNA的流动变得困难，这也加剧了这一争议（Taupin，2007年）。因此，对模板DNA进行无毒且稳定的标记，对于探究体内细胞分离模式至关重要。

本研究采用基于 Fara-EdU 与点击化学技术的 DNA 合成双色“出生年代测定”法（Neef 与 Luedtke，2011），在完整脊椎动物体内对非随机模板链分离（NRTS）进行评估。斑马鱼（斑马拟丽鱼）因与人类存在遗传相似性（Howe 等，2013），且其干细胞微室形态定义清晰、身体透明可实现全身成像与数据解读，被选为极具优势的 NRTS 模式生物。研究结果显示，在超过 100 对已鉴定的子细胞中，干细胞微室未出现标记物滞留，也未发现模板 DNA 不对称遗传的现象。幼体发育过程中，胚胎 DNA 分配到子细胞的比例符合随机分离的分布模型。这些结果为否定 NRTS 作为斑马鱼胚胎后发育阶段干细胞维持表观遗传记忆或减少突变的普遍机制提供了证据。

结果

用于成像非随机模板链分离的脉冲追踪标记

在本研究中，研究人员在0至3天的“脉冲”阶段引入DNA标记物，对所有胚胎DNA进行代谢标记，随后进入0至18天的“追踪”阶段。干细胞微环境中标记物的留存情况可反映NRTS（Bussard等人，2010）。然而，由于保留标记的细胞也可能是静息或缓慢增殖的细胞，我们在追踪阶段结束时引入第二种代谢DNA标记物，以可视化有丝分裂活跃的细胞，并探究胚胎DNA在子细胞间的分布情况。为长期追踪DNA，需要高稳定性的标记物。因此，我们研究了(20S)20-脱氧-20-氟-5-乙炔基尿苷（F-ara-EdU），因其掺入DNA后毒性低且稳定性高（Neef & Luedtke，2011）。F-ara-EdU可通过铜(I)催化的叠氮-炔烃“点击”反应与荧光叠氮化物结合实现可视化，且可与荧光素偶联抗体进行BrdU共标记。为评估F-ara为确定 EdU 还是 BrdU 更适合作为脉冲标记，我们比较了二者在斑马鱼胚胎中的标记特性。F-ara-EdU 可在显微注射至单细胞期胚胎后被检测到（图S1A），也可在4日龄胚胎经24小时浸泡后被检测到（图S1B）。经F-ara-EdU脉冲标记后，经过70天的追踪，仍可在视网膜中央的静息细胞中检测到标记保留细胞（图S2）。与未处理的对照组相比，该标记物对斑马鱼的发育和行为未产生任何影响。与F-ara-EdU不同，BrdU仅在浸泡处理后可被检测到（图S1），且当将其作为脉冲而非追踪剂使用时，标记强度显著更低（图S3）。基于这些发现，我们选择F-ara-EdU作为脉冲标记剂，BrdU作为追踪剂（图1）。我们选择将F-ara-EdU显微注射至受精卵的卵黄中（单细胞期），因为通过该途径给药可实现快速标记，在四细胞期胚胎的细胞核中即可检测到标记信号（图S4），且在胚胎发生的早期阶段，它能持续均匀地标记新合成的DNA。为确定注射的F-ara-EdU储备耗尽的时间点（即追踪开始的时间），我们选择视网膜作为指示器官，因为增殖区和分化的视网膜区域可通过其形态学特征轻松区分。受精后3天（dpf），视网膜的所有细胞均被标记，F-ara-EdU阳性细胞与DAPI阳性细胞完全重叠（图S5A）。从受精后4天起，睫状缘区（CMZ）的细胞中不再出现F-ara-EdU信号，该区域是受精后3天仍保持增殖状态的视网膜区域（图S5）。因此，我们确定F-ara-EdU脉冲标记在受精后3天左右结束。该时间点也与胚胎发育结束和孵化的时间相吻合。综上，本研究方法可实现对幼体和成体斑马鱼中胚胎来源DNA的选择性追踪。

图1. 斑马鱼模板链分离研究方法：将F-ara-EdU（绿色）以“脉冲”形式注射到斑马鱼受精卵中，以标记胚胎DNA。在可变追踪期结束前，通过孵育引入BrdU（红色）。追踪期内至少发生两次细胞分裂，才能区分干细胞分离的对称事件和不对称事件。固定斑马鱼样本，分别使用Alexa Fluor叠氮染料和抗BrdU抗体对F-ara-EdU和BrdU进行染色。

全斑马鱼中标记保留的分析

为了在完整斑马鱼体内识别标签保留区域以及由此推断的潜在神经发生敏感区域（NRTS），我们将 F-ara-EdU 显微注射到单细胞阶段的胚胎中，随后从受精后第4天至第5天通过浸泡法进行24小时的溴脱氧尿苷（BrdU）孵育（图2A）。固定后，斑马鱼整体进行 F-ara-EdU 和 BrdU 染色，并利用三维光片显微镜进行扫描（视频S1）。在受精后第5天，身体多个区域的增殖细胞（BrdU 阳性）已无 F-ara-EdU 染色信号，例如视网膜周边的细胞（图2B、2C）以及发育中的前脑细胞（图2B、2D）。我们检测到了显著的 F-ara-EdU 染色信号在视网膜、大脑、肠道、鳍和肾脏中。视网膜、大脑和肠道中观察到 F-ara-EdU 与 BrdU 共定位（图2C-2E），表明这些器官中 F-ara-EdU 阳性细胞在受精后4至5天发生增殖。相比之下，胸鳍和肾脏中未观察到 BrdU 与 F-ara-EdU 的明确共定位（图2E）。基于这些初步标记结果，我们选择形态学特征明确的视网膜、大脑和肠道干细胞微环境，在受精后5至12天进行详细研究，并在后续时间点对整个鳍和肾脏区域展开研究。

图2. 利用光片显微镜对标记保留和增殖的身体区域进行整体 mounts 分析（A）实验方法：向受精卵注射5.7皮摩尔的F-ara-EdU，随后在受精后4-5天用10毫摩尔的溴脱氧尿苷（BrdU）浸泡，固定并染色。整条斑马鱼的光片显微镜最大强度投影图：（B）由四张拼接图像组成的整体背侧视图，（C）眼部前视图，（D）前脑前视图，以及（E）体中部背侧视图。参见补充视频1，其展示了三维重建结果。箭头指示溴脱氧尿苷阳性/F-ara-EdU阴性细胞的示例。

肠道发育过程中DNA的随机分离

为评估NRTS是否发生在发育中的斑马鱼肠道干细胞微环境中，我们采用了优化的脉冲追踪策略（图3A），并探究了F-ara-EdU标记随时间的动态变化。与哺乳动物类似，斑马鱼肠道上皮细胞始终由肠道褶皱底部的干细胞不断更新。分化细胞成熟并向内迁移（图3B），最终脱落进入肠腔（Wallace等人，2005）。斑马鱼肠道的特征性褶皱在受精后3天已形成，且从受精后3天起，不同的细胞类型开始出现（Wallace等人，2005）。因此，肠道干细胞微环境的基本结构和功能在脉冲标记耗尽的大致时间内建立。若模板链发生不对称分离并保留在干细胞中，则会导致F-ara-EdU肠褶皱基部的标签保留情况。相反，如果模板分离是随机的，我们预计标签会首先在有分裂细胞的褶皱基部消失（图3C）。注射F-ara-EdU且浸泡BrdU的斑马鱼肠道横截面显示，随着发育从4天到12天龄推进，F-ara-EdU脉冲标记在基部逐渐消失（图3D）。信号强度的定量分析证实，随着时间推移，肠道基部的F-ara-EdU信号强度相较于肠道褶皱处有所降低（图3E）。这一模式与肠道干细胞中模板链的保留情况不符。

为了更直接地探究DNA分离的模式，我们对肠道上皮中形态相关且邻近的BrdU阳性细胞对所识别的子细胞对之间的F-ara-EdU信号强度比率进行了定量分析（图3F）。我们分析了来自19条斑马鱼幼鱼的共126个切片（5天龄：(n=4 ; 6)；6天龄：(n=4)；8天龄：(n=3)；10天龄：(n=4)；12天龄：(n=4)；样本量n=4），共发现37对子细胞。为了排除脉冲结束后正处于第一个细胞周期的细胞（即那些标记在两个子细胞间必然均等分布的细胞，图1），我们仅纳入联合F-ara-EdU标记强度低于同一切片内最亮细胞50%的细胞对。这将37对子细胞筛选至35对。我们分析了这些来自5至12日龄斑马鱼的35对子细胞，未发现非随机模板分离（NRTS）的案例。定量图像分析显示对35对子代细胞之间F-ara-EdU信号强度比进行简单的二项分布分析（图3G）。因此，我们未发现斑马鱼发育过程中肠道干细胞微环境存在NRTS的证据。随机模板链分离与此前的研究证据相符，即哺乳动物（Snippert等人，2010年）和鱼类（Aghaallaei等人，2016年）的肠道干细胞均主要进行对称分裂。

图3. 肠道中的模板链分离（A）向受精卵注射5.7皮摩尔F-ara-EdU；在可变追踪期结束前24小时，通过孵育施加10毫摩尔溴脱氧尿苷（BrdU）。（B）肠道示意图，以红色标注肠道褶皱基部的增殖区。（C）两种假设场景下F-ara-EdU脉冲稀释的模型：根据永生链假说的随机模板链分离和非随机模板链分离。（D）观察到的F-ara-EdU标记耗竭及其与BrdU的共定位情况。（E）基部细胞与褶皱细胞中F-ara-EdU信号衰减的定量分析（详见STAR方法）。采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验结合事后多重比较确定统计学显著性。共分析(n=100)个基部/褶皱结构，总计19条斑马鱼（每个时间点20个基部/褶皱结构，3-4条斑马鱼）。箱线图展示了中位数（箱中心线）、第一和第三四分位数（箱的上下边界）、最小值和最大值（须线）以及单个数据点（散点）。（F）F-ara-EdU/BrdU双阳性细胞对的示例（箭头所示）。（G）子代细胞中F-ara-EdU的强度比（详见STAR方法）。向数据拟合以0.5为中心的二项式曲线（品红色）（详见((R^{2}=0.99))）。蓝色曲线代表随机分离的理论正态（高斯）分布。定量分析基于原始图像进行（详见STAR方法），而（D）和（F）中展示的图像已调整亮度和对比度以获得更清晰的可视化效果。P：有丝分裂后细胞；SC：干细胞；TA：瞬时扩增细胞。**p<0.01（(^{*} p ≤0.01)）；p<0.05（(^{* *} p ≤0.001)）；无显著性差异（(cdots+p ≤0.0001)）**

视网膜干细胞的标记保留时间长于中间祖细胞，且不表现出非随机模板链分离现象

斑马鱼的视网膜在受精后5天即可发挥功能，此时幼鱼开始觅食。在鱼类以及其他一些非哺乳类脊椎动物中，由于视网膜边缘存在一个被称为晶状体缘（CMZ）的干细胞微环境，视网膜在整个生命过程中持续生长（图4B）。多能视网膜干细胞（RSCs）位于晶状体缘最边缘的区域（“晶状体缘-边缘区”，图4C）（Raymond等人，2006；Xue和Harris，2012；Wan等人，2016；Centanin等人，2011），并产生“短暂扩增”细胞，这些细胞能快速扩增占据晶状体缘中部（“晶状体缘-中区”，图4D和S5B）的分化细胞库。随着这些祖细胞发生分化，它们会离开晶状体缘并整合到功能性视网膜中。

采用我们的脉冲追踪方案（图1、图2A和图3A），我们有时会观察到F-ara-EdU信号强度存在梯度分布在受精后3天（3 dpf）的视网膜中，也就是睫状边缘区（CMZ）形成的时期，视网膜中央区域的荧光强度高于外周区域。这表明在部分动物体内，这种脉冲标记在受精后3天之前就可能已部分耗尽，此时视网膜中央会先出现增殖波，随后扩散至外周区域（He等人，2012；Hu和Easter，1999）。为确保视网膜干细胞（RSCs）的所有DNA链都能被该脉冲完全标记，除了向受精卵显微注射F-ara-EdU外，我们还增加了从受精后1天（1 dpf）到4天（4 dpf）用1毫摩尔浓度的F-ara-EdU孵育的步骤（图4A）。由于睫状边缘区细胞体积小、细胞周期进展快，很难在密集分布的区域内识别子细胞对。因此，我们将BrdU的孵育时间从24小时缩短至12小时。

图4. 视网膜CMZ中的模板链分离(A) 向受精卵注射5.7皮摩尔F-ara-EdU，随后在1至4天胚胎发育期（dpf）于1毫摩尔F-ara-EdU中孵育；在追踪结束前12小时，通过孵育施加10毫摩尔BrdU。(B) 视网膜示意图，红色标注出睫状边缘区。(C) 两种假设场景下F-ara-EdU脉冲稀释的模型：根据永生链假说的随机模板链分离和非随机模板链分离。(D) 随时间观察到睫状边缘区（CMZ）中F-ara-EdU标记的消退情况。(E) 对睫状边缘区祖细胞（干细胞，CMZ-p）与内核层（INL，有丝分裂后）细胞中F-ara-EdU信号衰减的定量分析（详见STAR方法）。采用单样本威尔科克森检验，以0.5为假设值确定统计学显著性。共分析8条斑马鱼的细胞（每个时间点取2条鱼，各10-20个细胞）。箱线图和须线图表示中位数（箱线中心的线）、第一和第三四分位数（箱线的上下边缘）、最小值和最大值（须线）以及单个数据点（球形点）。(F) F-ara-EdU/BrdU双阳性细胞对的示例（箭头所示）。(G) 子代细胞中F-ara-EdU的强度比（详见STAR方法）。对数据拟合以0.5为中心的二项式曲线（品红色），蓝色曲线代表随机分离的理论正态（高斯）分布。定量分析基于原始图像进行（详见STAR方法），而(D)和(F)中展示的图像已调整亮度和对比度以获得更好的可视化效果。CMZ：睫状边缘区；CMZ-m/c：睫状边缘区中外周中部；CMZ-p：睫状边缘区外周；GCL：神经节细胞层；INL：内核层；P：有丝分裂后细胞；Ph：光感受器层；SC：干细胞；TA：转运扩增细胞。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns：无显著性差异。

如果视网膜干细胞（RSCs）选择性保留DNA模板链，那么它们也应在发育过程中持续保留F-ara-EdU标记（图4C）。我们观察到，F-ara-EdU标记在5天龄（dpf）时就已从视网膜睫状缘（CMZ）中大量耗尽（图4D）。有趣的是，在CMZ-(cdot p)细胞（推定的视网膜干细胞）中仍能检测到该信号，但在CMZ-m细胞中信号已稀释至检测不到的水平（图S5B）。若推定的干细胞因非随机模板链分离（NRTS）而保留标记，那么与在F-ara-EdU脉冲结束前分化的细胞（即视网膜中央区细胞）相比，它们应表现出约50%的F-ara-EdU信号强度。然而，我们发现到12天龄（dpf）时，CMZ-(cdot p)细胞和CMZ-p细胞的信号强度均低于该信号强度的50%（图4E）。因此，我们得出结论，更长的标记保留外周 CMZ 的情况与 RSCs 中的 NRTS 并不一致。相反，这进一步证明 CMZ-p 细胞的增殖速度远慢于 CMZ-m 中的细胞（Raymond 等人，2006；Xue 和 Harris，2012；Wan 等人，2016）。

我们接下来通过量化被鉴定为具有相似形态的BrdU阳性细胞近端对的子细胞对中的F-ara-EdU强度，评估了CMZ-p细胞中模板链的分离模式（图4F）。由于其分裂频率较低，在外周CMZ中此类子细胞对的观察结果较为罕见。我们对20条斑马鱼的148个视网膜切片进行了研究（5 dpf: (n=2)；6 dpf: (n=5)；7 dpf: (n=7)；8 dpf: (n=2)；10 dpf: (n=2)；12 dpf: (n=2)），仅在外周CMZ中鉴定出22个子细胞对，其中21个满足对子对总强度低于同一切片中最亮细胞50%的要求。未观察到非随机模板链分离（NRTS）的案例，且对子对中F-ara-EdU分布的定量图像分析与随机分布模型高度吻合（图4G）。这些结果表明，这些干细胞在子细胞命运方面存在不对称分裂（Centanin等人，2014），但并未对其DNA模板链进行不对称分离。

端脑干细胞微环境中无标记保留

我们还研究了在大脑端脑发育过程中F-ara-EdU脉冲标记的动态变化，这是另一种神经胚胎发生过程中建立的干细胞定位明确的结构（Furlan 等人，2017）。包含干细胞的区域（室周区）在受精后4至8天不再含有F-ara-EdU（图S6），这表明在斑马鱼胚胎后发育阶段，端脑干细胞微环境中不存在NRTS过程。

鳍和肾脏中的长期标记保留但无非随机模板链分离

在5天胚胎期（dpf）进行的光片显微镜分析显示，斑马鱼的鳍和肾脏中存在强烈的F-ara-EdU保留信号，但与BrdU并未出现明显的共定位（图2）。因此，我们在F-ara-EdU显微注射后让斑马鱼发育长达21天，对其中体区域的切片展开了长期标记保留研究。5天胚胎期的共聚焦显微镜观察验证了光片显微镜的结果，F-ara-EdU标记的细胞广泛分布于大脑、肠道、肾脏和胸鳍等多种器官中（图5A）。10天胚胎期时，除胸鳍和肾脏外，这些区域的F-ara-EdU信号大多已减弱（图5）。与肾脏标志物alpha6F的共标记实验证实，中体区域的标记保留细胞为肾细胞（图5B）。10至20天胚胎期期间，这些区域强F-ara-EdU标记的细胞数量减少，提示慢周期细胞被重新激活。为验证这一可能性，我们将F-ara-EdU显微注射的斑马鱼培育至21天胚胎期，并引入BrdU标记。固定处理前24小时（图5C和图6A）。每天在10至21天胚胎期（dpf）收集斑马鱼，分析其胸鳍和肾脏中的F-ara-EdU+/BrdU+细胞。仅从17天胚胎期开始，在这些结构中发现了双标记细胞（图5C、6B和6C），这表明10至17天胚胎期的可逆静止是胸鳍和肾脏中F-ara-EdU长期标记保留的原因。接下来，我们通过量化16只动物中经BrdU追踪鉴定的子细胞对中的F-ara-EdU强度，评估了模板链分离模式。在17至20天胚胎期从胸鳍和肾脏中鉴定出的总共80对子细胞对中，未观察到非随机模板链分离（NRTS）的实例。对子细胞对中F-ara-EdU分布的定量图像分析与随机分布模型高度吻合（图6D）。

图5. 斑马鱼中体区域的标记滞留细胞（A）向受精卵显微注射5.7皮摩尔的F-ara-EdU，将斑马鱼饲养至5、10或20天龄。对固定并切片的斑马鱼进行Alexa Fluor 488叠氮化物染色，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对总DNA进行复染。（B）处理方式与（A）相同，但切片额外用肾脏标志物α6F进行染色。（C）处理方式与（A）相同，但鱼在固定前额外在10毫摩尔的5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）中孵育24小时。在放大倍数更高的图像（中、下排）中，白色方框标记出姐妹细胞对。图中展示的是体中部区域的横切片。

图6. 胸鳍和肾脏中的模板链分离(A)合子以脉冲方式注射5.7皮摩尔的F-ara-EdU；在17-21天胚胎期追踪结束前24小时，通过孵育施加10毫摩尔的溴脱氧尿苷（BrdU）。(B和C) 胸鳍(B)和肾脏(C)中经Huygens反卷积处理的F-ara-EdU/溴脱氧尿苷双阳性细胞对（箭头）的代表性最大强度投影图。在部分细胞类型中观察到溴脱氧尿苷呈部分染色，表现为核周染色，但这并不影响子细胞对的鉴定或F-ara-EdU的定量分析。(D) 子细胞间的F-ara-EdU强度比（((n = 80) 细胞对）。以0.5为中心的二项式曲线（品红色）与数据拟合（((R^{2}=0.89))）。蓝色曲线代表随机分离的理论正态（高斯）分布。定量分析在原始图像上进行（详见STAR实验方法），而(B)和(C)中展示的图像已调整亮度和对比度以获得更清晰的可视化效果。

讨论

NRTS 与永生链假说一直是研究领域中存在争议的话题，部分原因是缺乏适用于体内应用的高稳定性且无毒性的 DNA 标记（陶潘，2007）。在不干扰正常发育或组织稳态的前提下对模板链进行长期标记的新策略（尼夫与吕特克，2011）为在体内验证 NRTS 提供了新的手段。本研究采用脉冲追踪策略，探究了斑马鱼正常发育过程中多个干细胞微环境和身体区域的模板链分离情况。研究使用无毒性且代谢稳定的核苷类似物 F-araEdU 标记胚胎 DNA，并通过短时间的溴脱氧尿苷（BrdU）孵育来识别子细胞对。叠氮-炔基霍伊斯根环加成反应与免疫标记技术实现了斑马鱼胚胎 DNA 与晚期复制 DNA 流动的可视化。研究发现含 F-ara-EdU 的 DNA 具有代谢稳定性。

在分化细胞区域（例如功能性神经视网膜）中，经过长时间的培养（图S2）。当在相同的培养期内将两种标记物同时添加到同一只动物体内时，染色后观察到的分布几乎完全一致（图S3）。这些结果证明了这种间接方法适用于体内研究NRTS。

本研究在斑马鱼干细胞中提供了两项反对非随机模板链分离（NRTS）的证据：（1）随着发育进程，F-ara-EdU脉冲信号从干细胞所在区域快速稀释。这一模式与标记的模板链保留在干细胞微环境中的情况不符。（2）对100余对F-ara-EdU+/BrdU+双阳性细胞的荧光强度检测显示，干细胞微环境以及F-ara-EdU标记持续保留的身体区域均存在模板DNA的随机分离现象。综合来看，本研究数据不支持发育中的斑马鱼体内存在非随机模板链分离，且其发生速率足以如永生链假说所推测的那样阻止突变负荷的产生。

我们研究了三种干细胞微环境中胚胎DNA的流动，分别是肠道、背侧端脑和视网膜，且在其中任何一种中均未发现NRTS的相关证据。我们在背侧端脑的研究结果与一项针对胚胎小鼠皮层的研究一致，该研究未检测到神经前体细胞中存在任何标记滞留，也未发现分裂细胞中模板DNA的不对称分离（Fei和Huttner，2009）。在视网膜中未检测到可辨识的NRTS这一结果尤为有趣，因为已知后胚胎期鱼类视网膜的多能视网膜干细胞（RSCs）主要进行不对称分裂（Centanin等人，2014；Wan等人，2016），分裂后一个子细胞留在干细胞微环境中，另一个分化程度更高的子细胞则朝向中央边缘区（CMZ）中部。因此，我们的研究结果明确证实了一类干细胞的存在：它们进行不对称分裂，却不会对DNA模板链进行不对称分离。

在本研究探究的干细胞微环境中，就模板链分离模式而言，肠道是研究最多且争议最大的领域。检测非随机模板链分离（NRTS）最常用、最直接的方法是分析子细胞间的DNA标记分布，但对子细胞对的明确识别可能是一项挑战。此前有两项关于肠道中存在非随机模板链分离的研究（Potten等人，2002；Quyn等人，2010）采用了基于形态学的子细胞对分配方法。本研究中，我们将子细胞对鉴定为具有相似BrdU标记强度和形态的近端BrdU阳性细胞。本研究及另一项研究（Schepers等人，2011）均未在肠道中检测到任何非随机模板链分离事件。Schepers及其团队（2011）使用膜不透性染料直接识别有丝分裂对，以辅助验证基于位置和形态学的假设。另一个有助于解释肠道中非随机模板链分离研究结论矛盾的因素是，部分研究是在辐射损伤后的再生过程中开展的，而非正常发育或组织稳态期间（Potten等人，2002；Quyn等人，2010）。

在明确的干细胞微环境之外，我们发现鳍和肾脏中存在F-ara-EdU标记的长期滞留现象，因此将这些细胞评估为非增殖性慢循环细胞的潜在候选者。这些标记滞留细胞在受精后约4至17天处于暂时静止状态，此时鳍和肾脏中首次检测到F-ara-EdU+/BrdU+双阳性细胞。有趣的是，中肾（鱼类的成体肾脏）约在受精后12至14天开始发育（Diep等人，2011；Zhou等人，2010）。这一过程涉及肾小囊的形成与增大，肾小囊随后会分化为肾单位——肾脏的功能单位。我们的数据表明，在中肾发育的初期阶段，增殖并不能解释肾小囊的生长。更有可能的是，如同哺乳动物肾脏发育过程（Lindström等人，2018），发育为中肾的中间中胚层细胞被招募至发育中的肾小管以实现其生长。基于受精后17天起BrdU阳性肾脏细胞的研究结果，增殖仅在肾单位发育开始数天后启动，其作用可能是延长发育中的肾小管。同样与我们的研究结果相符的是，此前已有研究指出，在幼体发育的大部分阶段直至第三周，骨骼细胞的非增殖性扩张推动胸鳍生长，此后鳍骨骼开始经历包括细胞分裂在内的广泛重塑与扩张（Grandel和Schulte-Merker，1998）。综上，鳍和肾脏中F-ara-EdU脉冲标记的长期滞留并非源于非增殖性慢循环细胞，而是由暂时静止的祖细胞导致，这些祖细胞在幼体阶段相应身体区域的重构过程中被激活。

我们用于检测模板链分离模式的方法，使我们能够测量间期内>100对子代细胞之间模板链的分布情况。子代细胞中F-ara-EdU染色的荧光强度可作为模板链含量的替代指标。我们在鳍和肾脏中以球体（((r =) 2毫米）为单位测量了这些强度，而在视网膜和肠道中更细长的细胞中，则以细胞核单个共聚焦平面的面积为测量单位（详见STAR实验方法）。未来的实验可利用点击化学和超分辨率显微镜，更直接地观察单个中期染色体如何分配到子代细胞中。（Triemer 等人，2018）。我们目前的方法在检测仅标记一条或两条染色体方面也存在局限性。由于斑马鱼有25对染色体，单个染色单体的信号强度仅约为所有染色体均被标记的细胞的2%。如此低的信号与本文中进行的背景强度校正处于同一范围。因此，我们的研究结果并未排除少数甚至单个染色体在子细胞间非随机分离的可能性。

已有少数研究报道仅少数染色体亚群存在非随机分离现象（Armakolas 和 Klar，2006；Barker 等人，2007；Falconer 等人，2010；Yadlapalli 和 Yamashita，2013）。这一可能性在“沉默姐妹假说”（Lansdorp，2007）的背景下尤为引人注目，该假说提出非随机染色体分离与控制基因表达及细胞命运的表观遗传标记的不对称遗传相关联。我们采用的脉冲追踪等方法需与荧光原位杂交技术结合，以检测特定染色体的非随机分离。未来研究还可采用基于测序的技术（如链测序技术，Falconer 等人，2012），来确定细胞中每条染色体的遗传模式。

尽管我们的方法存在局限性，但我们的数据表明，在不受干扰的斑马鱼发育过程中，多个器官中不存在非随机模板链分离（NRTS）或其发生频率极低。根据永生链假说，若非随机模板链分离（NRTS）要保护生物体免受突变负担，那么它必须是一种频繁发生的事件，理想情况下每次干细胞分裂都会发生。如果非随机模板链分离（NRTS）的发生频率低于本研究的检测阈值，那么它可能发挥的生物学功能与干细胞谱系中预防突变负担不同。一个有趣的可能性是“短命链假说”（查维尔和兰多，2013）。根据该假说，非随机模板链分离（NRTS）发生在与DNA损伤相关的复制应激过程中。复制应激可由外部因素引起，例如不理想的细胞培养条件、紫外线照射和/或活性氧。我们的研究结果并未排除以下可能性：干细胞或其他祖细胞在特定情况下，当DNA损伤发生时会切换至非随机模板链分离（NRTS）模式。未来的研究可通过探究辐照后再生过程中模板链分离的模式等方式，验证这一可能性。

总而言之，无论是F-ara-EdU标记的消耗动态，还是子细胞间F-ara-EdU的强度比值，都没有为发育中斑马鱼体内存在非随机链分离（NRTS）提供任何证据。在幼虫干细胞微环境中，我们在长达5年的研究中观察了数千对子细胞以寻找非随机链分离（NRTS）的迹象，却连一个明确的实例都未发现。受研究方法灵敏度的限制，我们无法完全排除非随机链分离（NRTS）罕见发生的可能性；但即便存在此类罕见事件，如此低频率的非随机链分离（NRTS）也不太可能成为阻止干细胞微环境中突变负荷的有效机制。因此，斑马鱼发育过程中不太可能存在永生链假说。

研究意义

以往利用体外模型研究神经再支配与组织修复（NRTS）的结果表明，细胞培养条件会影响模板链的分离模式。还有其他研究采用损伤模型来激活成体干细胞以促进DNA标记。尽管这些报告无疑具有重要价值，但它们并未涉及正常组织发育过程中的DNA分离问题。本研究采用化学生物学方法，对一个长期存在且颇具争议的假说展开评估，该假说认为姐妹染色单体会根据自身的年龄和表观遗传特征，差异化地分离进入子细胞。我们的研究对脊椎动物全身的DNA模板链分离情况进行了分析，全面呈现了多个器官和身体结构的相关特征。我们在斑马鱼单细胞阶段引入了一种无毒且稳定的代谢性DNA标记物（F-ara-EdU），以此标记发育前4天内新合成的所有DNA。研究发现，F-ara-EdU标记对斑马鱼的发育没有任何影响，且在早期分化细胞中可被检测数月之久。通过光片照明显微镜技术，我们发现肠道、视网膜、前脑、鳍和肾脏等身体结构中仍保留着F-ara-EdU。在形态学特征已被充分解析的干细胞微环境中，含干细胞区域的F-ara-EdU被快速消耗。对100多对子细胞的详细分析未发现任何一例不对称DNA分离的情况。因此，我们的研究结果表明，在未受干扰的斑马鱼胚胎后发育阶段，突变负荷的积累并非如永生链假说所推测的那样，通常能被非随机模板链分离（NRTS）所阻止。同样，在视网膜的不对称干细胞分裂过程中，模板DNA的不对称遗传也不太可能导致子细胞出现不一致的命运。除这些基础研究发现外，我们的研究还建立了一种有效的标记方法，可用于解答发育后期相关的问题，例如静息干细胞在损伤后的激活机制。

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