题目：Telomerase Is Essential for Zebrafish Heart Regeneration

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26321646/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 端粒酶过度激活是斑马鱼心脏再生过程中的早期事件

l d 端粒酶功能丧失会损害心脏再生

l (tert ^{-1-})斑马鱼的心肌细胞增殖反应受到抑制

l 端粒酶可保护心肌细胞免受DNA损伤并限制细胞衰老

摘要

人类发生心肌梗死后，丢失的心肌细胞会被不可逆的纤维化瘢痕所替代。相比之下，斑马鱼的心脏在受损后能够高效再生。斑马鱼心脏的完全再生依赖于其心肌细胞对损伤的强烈增殖反应。本研究发现，斑马鱼心脏受损后，端粒酶会被过度激活，端粒出现短暂延长，这一过程发生在心肌细胞增殖峰值和器官完全恢复之前。通过端粒酶突变斑马鱼模型，我们发现端粒酶缺失会大幅降低冷冻损伤后心肌细胞的增殖能力和纤维化组织的消退速度，且心脏功能无法恢复。心肌细胞增殖反应受损的同时，长端粒心肌细胞消失，且表现出DNA损伤和衰老特征的心肌细胞比例增加。这些研究结果证实了端粒酶功能在心脏再生中的重要性，并揭示了端粒酶疗法有望成为促进心肌梗死后细胞增殖的潜在手段。 

图形摘要

引言

心脏病是全球人类死亡的首要原因。目前，针对心肌梗死后或心力衰竭导致的心肌细胞损失，唯一有效的治疗手段是心脏移植。干细胞疗法被寄予了巨大希望，尽管临床试验数据显示前景良好，但该疗法远未达到预期效果。这使得许多研究人员考虑在继续推进研究之前，先从“临床回归到实验室基础研究”。随着临床试验的增多。了解在具有强大心脏修复能力的脊椎动物中发挥作用的修复机制，可能有助于发现可用于促进人类心脏再生的新分子和通路。

斑马鱼已成为研究再生过程的强大模型，这是因为它在受损后能够完全修复包括心脏在内的多个器官。斑马鱼心脏在心室切除、心肌细胞基因消融、缺氧-复氧损伤以及心室冷冻损伤后均可实现再生。冷冻损伤会对所有心肌细胞类型造成局部损伤，并导致短暂的纤维化组织沉积，这让人联想到哺乳动物心肌梗死后形成的纤维化瘢痕。在斑马鱼体内，死亡的心肌细胞并非由干细胞替代，而是由预先存在的心肌细胞完成替代——这些细胞先去分化，随后增殖，用新形成的心肌组织替换受损部位。这种心肌细胞的增殖和重塑需要心腔心内膜衬里和心外膜（覆盖心肌的外层间皮层）提供旁分泌样支持。心脏损伤早期，心内膜和心外膜会重新表达发育相关基因。其中一个基因编码视黄醛脱氢酶 aldh1a2，该酶参与视黄酸的合成，被认为对心肌细胞增殖至关重要。心内膜还会激活 il11a 的表达，后者可触发心肌细胞中的 jak1/stat3 信号通路。与此同时，心外膜开始释放纤连蛋白等细胞外基质成分，有研究表明，纤连蛋白可通过与整合素β3（itgb3）相互作用促进心肌细胞再生。

新生小鼠的心肌细胞也具有类似的损伤后增殖能力，且有研究报道人类心肌细胞也存在一定程度的更新。这些发现为基于增强心肌细胞内源性增殖能力的心力衰竭治疗提供了新方向。

成功的DNA复制和广泛的细胞增殖需要有功能的端粒存在，端粒是染色体末端的帽状结构。由于末端复制问题及其他降解活动，端粒会逐渐缩短。因此，细胞的增殖能力与其维持健康端粒、避免DNA损伤的能力紧密相关。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，可通过向染色体末端添加DNA重复序列来维持端粒长度。凭借其抵消端粒缩短的能力，端粒酶与细胞和组织的增殖潜能相关，且与小鼠肝脏再生过程相关。所有年龄段的斑马鱼体内均可检测到端粒酶，其表达水平与心脏和鳍组织的终身再生能力相关。相比之下，人类和小鼠组织在出生后端粒酶的表达会迅速受到抑制，高更新率的组织除外，这进一步强化了端粒酶活性与修复潜能之间的关联。值得注意的是，人类和斑马鱼的端粒大小相近，这使斑马鱼成为研究端粒生物学对再生作用的理想模型。近期有研究报道了编码端粒酶逆转录酶（tert）——端粒酶的催化亚基——的基因发生斑马鱼无效突变的情况。tert基因的缺失会导致斑马鱼肝脏、肠道、胰腺等多个器官出现早衰现象。然而，tert基因缺失对斑马鱼器官再生的影响尚未得到研究。

本研究分析了tert在斑马鱼心脏再生过程中的作用。研究发现，心室冷冻损伤会上调心脏细胞中tert基因的表达及端粒酶活性。在tert基因敲除的斑马鱼中，心脏再生受到抑制，且纤维化瘢痕持续存在。这种再生能力的丧失主要是由于与心脏细胞增殖反应被强烈抑制相关，同时这些细胞还出现了DNA损伤及衰老特征的积累。这些研究结果表明，恢复端粒长度有望成为心脏损伤后唤醒休眠心肌的一种新方法。

结果

斑马鱼心肌细胞能够在整个生命过程中增殖，但在损伤后其增殖指数会显著提高。端粒酶活性与细胞和组织的增殖能力相关。因此，我们首先比较了斑马鱼心脏在稳态条件下和再生过程中的端粒酶活性。基于PCR的端粒酶活性检测结果显示，6至9个月大斑马鱼未损伤的心脏组织中出现扩增条带，证实成年斑马鱼在稳态条件下具有端粒酶活性（图1A）。6月龄和10月龄斑马鱼心脏的端粒酶活性无显著差异（图1B、图1C）。心室顶端冷冻损伤（损伤心室的四分之一）后3天，扩增条带的持续合成能力和强度出现暂时性升高，表明端粒酶活性会响应损伤进一步增强（图1A）。损伤相关的端粒酶过度激活伴随损伤后3天（dpi）tert基因表达上调2.2倍，提示转录激活可能是其调控机制（图1D）。

为了确定端粒酶过度激活与心脏再生之间的关系，我们分析了一个最近被报道的斑马鱼突变品系的再生能力，该品系的tert基因第二个外显子中携带一个终止密码子。该突变体在心脏中完全缺乏端粒酶活性，可被视为tert基因敲除型（图1E）。尽管缺乏端粒酶活性，但6至9月龄的(tert ^{-1-})斑马鱼的心脏大小正常，通过超声心动图检测显示组织学结构和心脏功能均正常（图1F-1H）。6至9月龄的(tert ^{-1-})心脏未出现明显表型，这与低更新率的tert/组织在年轻阶段无表型改变的情况一致。

图1. 心脏冷冻损伤增强端粒酶活性及tert表达水平。(A) 未损伤（UI）心脏及冷冻损伤后1、3、4、7和30天（dpi）心脏的端粒重复扩增方案（TRAP）代表性活性（每个条件和时间点n=3）。阳性对照（C+）：诱导多能干细胞（iPSCs）；阴性对照（C）：(tert ^{-1-})斑马鱼心脏；反应特异性对照：未损伤心脏+核糖核酸酶（RNase）。LB：裂解缓冲液。(B和C) 6月龄和10月龄斑马鱼心脏的端粒酶TRAP活性测定（((n=4 / time)点）。数据为平均值±标准误（SEM）。ns：无显著差异（非配对t检验）。(D) 稳态下及再生过程中（3 dpi）斑马鱼端粒酶逆转录酶（tert）mRNA表达水平（每个条件((n = 4)个心脏）。CPMs：每百万计数。数值为平均值±标准误（SEM）。(^{* *} p<0.001)（Benjamini-Hochberg校正p值）。(E) TRAP测定代表性结果，显示(tert ^{-1-})心脏中端粒酶活性缺失（每个基因型((n =)个，n=3/基因型）。(F) 端粒酶缺失不影响心脏发育和功能。(tert ^{-i-})斑马鱼心脏解剖结构和功能正常。展示的是野生型（WT）和(tert ^{-1-})未损伤斑马鱼成体心脏解剖后的整体观（左图）以及马松-高德纳三色染色的矢状切片（中图）。每个基因型分析5只动物。V：心室；At：心房；BA：动脉球。比例尺：100毫米。(G和H) 超声心动图评估未损伤野生型（WT）和(tert ^{-1-})动物的心脏大小（舒张期心室容积（VV））(G) 和心功能（心室分数缩短率（FVS））(H)。两个参数的数值在不同基因型间均无差异。圆形和方形代表单个动物的数据。水平条表示平均值（非配对t检验）。每个基因型共分析17-20只动物。

我们接下来比较了野生型（WT）和带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼同胞在心脏冷冻损伤后的再生反应。在两种基因型的斑马鱼中，我们在分析的最早时间点（损伤后3天，3 dpi）均观察到明显的伤口（图2A）。野生型心脏的损伤区域占心室总面积的20%±5%，而带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼心脏则为21%±6%。野生型心脏的伤口面积逐渐缩小，而带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼心脏在损伤后60天（60 dpi）仍存在较大伤口（图2A-2C）。两种基因型的组织学分析均证实了冷冻损伤触发了特征性的瘢痕样纤维化组织沉积，但仅野生型斑马鱼心脏发生了后续的愈合过程（图2B和2C）。野生型斑马鱼心脏在损伤后60天，损伤区域占心室面积的比例不足5%（2.5%±0.8%），而带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼心脏，其损伤区域面积与损伤后3天时相当（18%±2%；图2C）。为进一步证实带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼心脏再生反应受损，我们通过二维超声心动图评估了其心脏功能。冷冻损伤导致野生型斑马鱼在损伤后7天收缩功能下降，分数体积缩短率（FVS）降低了47%±8%，而带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼则降低了35%±4%（图2D和2E；视频S1、S2、S3、S4、S5、S6）。野生型个体在再生过程中，分数体积缩短率逐渐恢复，表明心室功能得以重建。相比之下，带有(tert ^{-1-})标记的斑马鱼，即使在损伤后60天，其心室功能也未恢复（图2D和2E；视频S1、S2、S3、S4、S5、S6）。这些结果表明，端粒酶是斑马鱼心脏再生所必需的。

心肌损伤会触发快速的炎症反应，导致中性粒细胞、巨噬细胞和其他循环细胞浸润到损伤部位。这种炎症反应，尤其是巨噬细胞的浸润，在促进新生小鼠心脏的心脏再生过程中发挥关键作用。鉴于基因研究表明，沉默tert会损害造血功能，因此我们评估了(tert ^{-1-})斑马鱼在冷冻损伤引发的炎症反应中是否存在变化。全心脏RNA测序（RNA-seq）分析未检测到(tert ^{-1-})斑马鱼与野生型心脏在3天注射（dpi）时中性粒细胞、巨噬细胞及其他炎症细胞标志物上调之间存在显著差异（图S1A；表S1）。此外，3天和60天注射时的L-质体免疫组化分析显示，巨噬细胞浸润情况无显著差异（图S1B–S1G）。

斑马鱼心脏再生过程中，预先存在的心肌细胞会发生去分化和增殖，而这一过程发生之前，心内膜和心外膜会迅速且全器官水平地被激活。为了确定端粒酶活性的缺失是否会改变为分析心内膜和心外膜的激活情况，我们检测了aldh1a2（raldh2）的表达情况。野生型（WT）和(tert ^{-1-})个体在损伤后6小时（hpi），心内膜细胞中aldh1a2的RNA和蛋白水平均出现显著上调；在损伤后3天（dpi），心内膜和心外膜细胞中该基因的表达也呈现出相似的强上调趋势（图S2A）。RNA测序（RNA-seq）（图S2B）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证了这一结果（数据未展示）。我们还检测了心脏损伤后上调的另一种心内膜基因（il11a）以及心外膜基因（wt1b、tbx18和纤连蛋白fibronectin）的表达，发现损伤的(tert ^{-1-})个体心脏中这些基因的表达未发生改变（图S2B）。由此可见，端粒酶缺失时，心外膜和心内膜的早期损伤反应并未受到影响。

受到损伤刺激时，心肌细胞的肌节发生解聚，线粒体出现肿胀，细胞间连接也随之松弛。为了探究端粒酶缺失是否会影响心肌细胞去分化的这些特征，我们对心肌细胞的超微结构进行了分析通过透射电子显微镜观察3 dpi时的特征。在损伤部位附近的野生型（WT）和(tert ^{-1-})心肌细胞中，检测到了类似程度的肌节解体以及线粒体肿胀和形态异常（图S3），这表明在端粒酶缺失的情况下，心肌细胞去分化过程正常进行。

图2. 端粒酶逆转录酶突变体动物的心脏再生受到强烈抑制。(A)未受伤和冷冻受伤的野生型（WT）以及 (tert ^{-1-}) 斑马鱼心脏在受伤后指定时间解剖后的整体观。虚线勾勒出受伤区域。星号标记初始受伤部位。（B）冷冻损伤后指定天数，未受伤的野生型（WT）和 tert/ 心脏矢状切片的 Masson-Goldner 三色染色。黑色虚线勾勒出损伤区域。箭头标记初始损伤部位。比例尺为 100 微米。(C) 损伤后指定时间点矢状心脏切片上心室损伤的面积（损伤区域[IA]），以心室总面积的百分比表示。数据为每个时间点3-8个心脏中至少4个切片/心脏的平均值，野生型30天损伤点除外，仅分析了1个心脏。数据为平均值±标准误。(p 0.05)（Mann-Whitney检验）。(D) 基础条件下（假手术组）及损伤后指定时间点，野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 斑马鱼心脏的相对纤维体积分数（RFVS）。野生型心脏的心室功能随时间恢复，但 (tert ^{-1-}) 型心脏则无法恢复。数据为每种条件下 10 只实验动物的平均值±标准误（SEM）。(^{*} p<0.01)（单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行图基诚实显著差异检验）。（E）野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 心脏在未损伤及损伤后指定时间点的心内血流代表性多普勒超声心动图图像。星号标记初始损伤部位。另参见影片 S1、S2、S3、S4、S5 和 S6。

去分化后，心肌细胞发生增殖。为研究野生型（WT）和带有(tert ^{-1-})标记的动物的增殖反应，我们检测了增殖细胞核抗原（PCNA）阳性心肌细胞的百分比，PCNA是S期细胞的标志物（图3A-3C）。野生型心脏在损伤后3天（3 dpi）出现增殖高峰，占总心肌细胞的11%。而带有(tert ^{-1-})标记的心脏，增殖高峰延迟至损伤后14天（14 dpi），增殖细胞占比最高仅为6%（图3A）。心肌细胞库的增殖反应受损更为显著，带有tert (-1-)标记的心脏在损伤后7天（7 dpi）的增殖高峰较野生型降低了3倍（图3B）。野生型心脏中，增殖的心肌细胞主要分布于损伤边缘区域，同时在外周区域也可检测到（图3C）。而带有(tert ^{-1-})标记的心脏，在所有检测阶段，损伤边缘区和外周区域的增殖反应均明显减弱（图3C）。值得注意的是，带有(tert ^{-1-})标记的心脏中，少数增殖的心肌细胞在损伤后60天（60 dpi）主要定位于心外膜附近（图3C）。为进一步表征受损的增殖能力，我们用溴脱氧尿苷（BrdU）标记心脏以评估DNA合成，并使用抗BrdU抗体和有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）对切片进行染色。对于这两种标志物，带有(tert ^{-1-})标记的心脏中，阳性细胞数量均出现大幅相对减少（图3D、3E；图S4A）。这些结果表明，端粒酶缺失导致心脏再生失败，是由于心肌细胞及其他心肌细胞的增殖反应受损所致。基因集富集分析（GSEA）证实，与野生型相比，带有(tert ^{-1-})标记的心脏中，细胞增殖相关通路显著受损（表S1；图S4B）。

图3. 端粒酶的缺失严重影响心肌细胞的增殖。(A、B) 未损伤野生型（WT）和 *tert⁻/⁻* 斑马鱼心脏，以及冷冻损伤后指定天数心脏中，PCNA 阳性的心脏细胞。(A) PCNA 阳性的全部心脏细胞；(B) PCNA 阳性的心肌细胞。数据为 PCNA 阳性细胞百分比 (A)，或每个心室切片中 PCNA 阳性心肌细胞数量 (B) 的平均值 ± 标准误（每只动物至少 3 张切片，动物数量见标注）。*p＜0.05，与野生型样本对比（MannWhitney 检验）。(C) 野生型与*tert⁻/⁻*心脏切片免疫荧光染色：抗MHC 标记心肌细胞（红色），抗PCNA 标记 S 期细胞（绿色）；DAPI 复染细胞核（蓝色）。下方图行显示再生过程中 PCNA 阳性心肌细胞的位置（黄色圆圈）；核区域用洋红色显示。虚线勾勒心室与损伤区域；星号标记初始损伤位点。插图为方框区域内代表性 PCNA 阳性心肌细胞的高倍放大视图。比例尺：全心脏视图 100 μm；放大视图 10 μm。(D、E) 损伤后 7 天、14 天（dpi），pH3 阳性、BrdU 标记的心脏细胞 (D) 与心肌细胞 (E) 的定量统计。数据为平均值 ± 标准误。*p＜0.05，**p＜0.01（非配对 Student’s t 检验）。另见图 S4 与图 S5。

为了探究端粒酶逆转录酶（TERT）在心肌细胞增殖过程中的时空作用，我们对离体心脏进行了损伤处理，并检测了靶向TERT的体内吗啉代反义寡核苷酸（vivoMO）的作用效果。离体培养3天后，未处理的损伤心脏心室边缘区域可见增殖细胞核抗原（PCNA）阳性的心肌细胞，其中包括心肌细胞。在离体培养过程中加入TERT vivoMO孵育，端粒酶活性和PCNA阳性细胞的数量均显著降低（图S5A-S5C）。增殖标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）也得到了类似结果（数据未展示）。这些数据支持以下结论该Tert基因对于心脏再生过程中成体心脏的心肌细胞增殖是必需的。

我们接下来研究了端粒酶如何影响细胞增殖。由于端粒酶的经典功能是延长端粒，而长端粒赋予细胞增殖潜能，因此我们开展了端粒定位分析，以探究心脏再生过程中端粒酶过度激活是否会导致端粒长度发生变化。对野生型（WT）完整心脏切片中每个细胞的平均端粒长度进行测量后发现，心脏再生期间心肌端粒会发生短暂延长，在损伤后3天（dpi）达到延长峰值（图4A和图4B）。在心肌细胞以及心内膜细胞等其他细胞类型中均检测到了端粒延长现象（图S6）。相比之下，(tert ^{-1-}) 型心脏在冷冻损伤后，端粒长度逐渐缩短，在损伤后60天（dpi）仅为初始长度的一半（图4B）。

图4 心脏低温损伤诱导端粒酶依赖性端粒储备增加。(A)野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 心脏的代表性端粒图谱，分别为未损伤（UI）或损伤后不同天数（dpi）固定的样本。根据细胞核的平均端粒荧光强度（任意单位）为其分配四色编码：端粒最长的细胞以红色显示，端粒最短的细胞以绿色显示。虚线标记损伤区域。第二行和第四行为全心脏切片图像中框选区域的高倍放大图。比例尺：低倍图像为100微米，高倍图像为10微米。(B) 未损伤心脏以及冷冻损伤后3、7、14、30、60天的心脏中，野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 心肌细胞的端粒荧光频率直方图。端粒平均荧光强度以任意单位表示。分析中排除了损伤部位。可见野生型（WT）心脏在损伤后3天，长端粒细胞数量增加，随后恢复初始分布特征。而 (tert ^{-1-}) 细胞缺乏该反应，且在后续阶段，细胞端粒长度较初始状态更短。参见图S6。

鉴于端粒长度与多个器官的增殖潜能相关，我们接下来比较了增殖性和非增殖性心肌细胞的端粒长度。对端粒长度的单细胞分析以及对PCNA表达的检测结果显示，野生型（WT）心肌细胞中，增殖性细胞的端粒长于非增殖性细胞，这表明在野生型斑马鱼中，端粒长度界定了一类具有增殖潜能的心肌细胞亚群（图5A）。在再生过程中，不仅活跃增殖的细胞，非增殖细胞的端粒也出现了延长，这说明端粒延长是再生心脏中的一个普遍过程（图5A）。

为确定增殖性心肌细胞的位置及其端粒长度，我们对心肌切片进行了肌球蛋白重链（MHC）、PCNA和端粒的联合免疫染色。在未损伤的野生型心脏中，心肌细胞的端粒长度存在异质性，增殖细胞的端粒更长（图5B；图S6）。损伤后，具有长端粒的增殖性心肌细胞数量在损伤后7天（dpi）达到峰值，随后逐渐减少。因此，尽管冷冻损伤后端粒酶过度激活，但其活性水平不足以维持心肌细胞的端粒储备（图5B）。再生过程中连续进行的细胞分裂可能是导致端粒缩短的原因。

图5. 长端粒标记增殖心肌细胞的一个亚群，包括增殖型心肌细胞。（A和B）未损伤心脏以及冷冻损伤后3、7、14、30、60天的心脏中，(PCNA)、(PCNA)野生型和(tert ^{-1-})细胞的端粒荧光频率直方图。直方图分别展示了（A）总心肌细胞和（B）心肌细胞的频率。端粒荧光平均值以任意单位（a.u.）标注。需注意，在两种情况下，(tert ^{-1-})心脏中均不存在具有长端粒的增殖细胞亚群。CM代表心肌细胞。另见图S6。

这一观点与实验结果相符，在增殖率最高的损伤区域附近，细胞的端粒出现了急剧缩短（图S6）。在心外膜和心内膜靠近损伤位点的区域，也观察到了类似的端粒快速缩短模式（图S6）。

短且功能异常的端粒通过引发DNA损伤反应来限制细胞增殖能力。为评估野生型（WT）和(tert ^{-1-})小鼠在损伤前后的DNA损伤水平在心脏中，我们检测了DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H2A.X的蛋白水平（(( gamma H 2 AX))）。冷冻损伤使野生型（WT）和(tert ^{-1-})心脏中的γH2AX信号增强，但这种增强仅在(tert ^{-1-})心脏中具有显著性（图6A和6B）。未损伤的野生型心脏心室中，心肌细胞的DNA损伤呈广泛分布，且损伤后受损细胞数量未显著增加（图6C和6E）。相比之下，(tert ^{-1-})心脏的γH2AX阳性细胞基础数量更高，且损伤后损伤水平显著上升（图6C和6E）。仅检测心肌细胞时也观察到了相同模式（图6F）。DNA损伤反应会限制细胞增殖能力。与这一观点一致，对γH2AX和BrdU进行的免疫共染色结果显示，在野生型和(tert ^{-1-})心脏中，绝大多数BrdU阳性细胞均为γH2AX阴性（图S7）。这些结果表明，端粒酶的缺失是DNA损伤的重要诱因，可能对心脏再生产生影响。 

图6. 端粒酶缺失时，心室冷冻损伤后DNA损伤显著增强线条。比例尺，100 微米。（A）未损伤及损伤后3天（3 dpi）野生型（WT）和(tert ^{-1-})心脏中r-H2AX表达的代表性蛋白质免疫印迹结果。（B）蛋白质免疫印迹信号强度定量分析((n=9)（每个条件n=9个心脏样本）。数据为平均值±标准误。(p <0.05)（曼-惠特尼检验）。（C）未损伤及损伤后3天野生型（WT）和(tert ^{-1-})心脏中心肌细胞中γ-H2AX焦点（绿色）的代表性染色结果。心肌细胞用抗肌球蛋白重链（MHC，红色）免疫染色，细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）复染。(Y-H2AX+)示例心肌细胞用绿色圆圈标出。框选区域为高倍放大视图。比例尺，20 微米。（D）未损伤及损伤后3天野生型（WT）和(tert ^{-1-})心脏中γ-H2AX阳性心肌细胞（绿色圆圈）的分布。核区呈品红色。心室和损伤区域用虚线标出。（E和F）未损伤及损伤后3天野生型（WT）和(tert ^{-1-})心脏中（E）γ-H2AX阳性心肌细胞及（F）γ-H2AX阳性心肌细胞的百分比。数据为四个心脏样本中每个样本至少3个切片计数的细胞的平均值±标准误。(p<0.05)、(because p<0.01)、(^{* * *} p<0.001)（学生t检验）。另见图S7。

端粒功能障碍引发的DNA损伤和细胞周期阻滞可导致细胞衰老（d’Adda di Fagagna等人，2003）。因此，我们采用衰老相关β-半乳糖苷酶检测法，在(tert ^{-1-})心脏组织中检测衰老情况（图7）。野生型（WT）或(tert ^{-1-})动物的未损伤心脏未出现衰老特异性染色，但冷冻损伤后可诱导产生衰老相关β-半乳糖苷酶信号。在损伤后3天（3 dpi）的野生型心脏中，衰老细胞几乎仅局限于损伤区域；而在(tert ^{-1-})损伤心脏中，该信号分布更为广泛，不仅覆盖损伤区域和边界区，还延伸至心室远端区域，这与增殖的(tert ^{-1-})心肌细胞全器官性缺失的情况一致（图7）。在再生的后期（损伤后7天，7 dpi），这一趋势依然保持（图7）。

图7. (tert ^{-1-}) 心脏在心室冷冻损伤后获得衰老表型。(A) 未受伤及伤后3天的野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 心脏的整体标本，经 SA β-半乳糖苷酶染色。比例尺：100 微米。(B) 未受伤、伤后3天及伤后7天的野生型（WT）和 (tert ^{-1-}) 心脏的冷冻切片，经 SA β-半乳糖苷酶染色。图中展示了受伤区域、损伤边缘（B）和远端区域（R）的放大视图。比例尺：100 微米（整体心脏），50 微米（放大视图）。

讨论

我们的研究结果表明，在心脏损伤带来的高需求下，没有端粒酶的参与，端粒储备无法维持。端粒酶的缺失使去分化与解耦联，严重损害增殖能力，并导致DNA损伤的积累。(tert ^{-1-}) 心脏并未实现心肌再生和心脏纤维化消退，反而获得了衰老表型。端粒酶的端粒延长作用与DNA保护作用可能存在关联，而衰老可能是DNA损伤不断积累的最终结果。在未受损伤的组织中检测到DNA损伤出现轻度升高(tert ^{-1-}) 这种心脏情况或许表明，tert 也能在体内平衡状态下维持 DNA 稳定，这可能是通过抵御氧化应激或机械应激实现的（Oh 等人，2003）。尽管这似乎不会影响基础心脏功能，但它可能是 (tert ^{-1-}) 突变体心脏再生能力受损的原因之一。

在人类体内，端粒酶在出生后迅速下调。有趣的是，发生缺血事件后，心肌细胞可进入冬眠状态，在此状态下细胞活性得以维持，但心肌失去功能。这种冬眠心肌被认为代表了一种部分去分化状态。鉴于端粒酶在去分化后心肌细胞扩增中的关键作用，我们的研究结果凸显了端粒恢复作为心梗后心脏中唤醒冬眠心肌策略的潜力。 

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。