题目： Highly Efficient CRISPR-Cas9-Based Methods for Generating Deletion Mutations and F0 Embryos that Lack Gene Function in Zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.10.004

期刊：Developmental Cell

摘要

活性不一致限制了CRISPR-Cas9在斑马鱼中的应用。我们发现单导向RNA（sgRNAs）5'端多余的鸟嘌呤核苷酸是导致斑马鱼胚胎中CRISPR-Cas9活性降低的原因。使用包含与原间隔子靶位点完美匹配的sgRNA分子或合成crRNA:tracrRNA双链的Cas9核糖核蛋白（RNPs），可以以极高的效率稳定靶向基因组序列。向斑马鱼卵中注射此类RNPs后，靶基因座的几乎每个拷贝都会发生诱导的插入缺失突变。基因功能的缺失通常是完全的，因为F0胚胎与真正的无效突变体高度相似，且未检测到非特异性效应。F0胚胎的镶嵌性足够低，能够有效探究细胞非自主性基因功能，同时靶向两个基因时还能发现基因的冗余功能。最后，使用靶向同一条染色体的双链导向RNPs对，可轻松诱导至少50千碱基对的可遗传缺失突变。

引言

对与基因功能完全丧失相关的表型进行鉴定和理解，是深入了解其正常功能的关键。因此，无效突变体的分离与表征已成为分析基因活性的核心手段（穆勒，1932年）。本文介绍了斑马鱼中的相关方法，这些方法不仅能显著优化在F0胚胎中重现基因功能初始筛选所需的无效状态，还能助力生成可遗传的基因缺失片段，以培育出无效突变体。

在没有真实突变体的情况下，能够有效对基因的空型条件进行采样的方法具有极高的实用价值：(1) 可作为评估基因功能的第一步（Klatt Shaw 等人，2018年）；（2）在大量候选基因中进行筛选，以鉴定出对目标生物学过程有贡献的基因（Boutros和Ahringer，2008；Housden等人，2017）；或（3）检测潜在的基因相互作用并分析基因的联合功能（Arduini等人，2009；Dorsky等人，2003）。遗憾的是，RNA干扰、反义技术和基因沉默方法的效果不一致，限制了它们在许多模式生物中用于筛选的价值（Boutros和Ahringer，2008；Dorsett和Tuschl，2004；Housden等人，2017）。此外，基因表达敲低方法（如使用反义吗啉代寡核苷酸）通常会引发不必要的整体生理和发育扰动，有时还会伴随基因特异性脱靶效应（Gentsch等人，2018；Kok等人，2015；Robu等人，2007；Stainier等人，2017；Tsai等人，2015）。当前方法难以完全干扰F0胚胎中的基因表达，加之其脱靶效应，不仅影响结果解读，还使得在严格对照的实验中应用这些方法变得繁琐（Stainier等人，2017）。

CRISPR-Cas 系统几乎可在任意基因座诱导突变的便捷性，使其成为斑马鱼基因功能筛选工具的理想之选（Varshney 等人，2015）。RNA 引导的 CRISPR-Cas9 核酸酶可精准靶向基因组中的特定位点，诱导产生双链断裂（DSB），进而触发修复机制，最终在断裂位点引发插入缺失（indel）突变（Doudna 和 Charpentier，2014；Hsu 等人，2014；Sander 和 Joung，2014）。在斑马鱼中通过双链断裂修复产生的突变通常会减弱或消除基因功能（Bedell 等人，2012；Burger 等人，2016；Dahlem 等人，2012；Doyon 等人，2008；Gagnon 等人，2014；Jao 等人，2013；Meng 等人，2008）。因此，将 CRISPR-Cas9 靶向活性导入斑马鱼卵已被用于发育胚胎的基因功能筛选（Shah 等人，2015）。就目前的应用情况而言，CRISPR-Cas9 复合物对靶位点的诱变效率极少达到 100%，因此在生长中的斑马鱼胚胎细胞中，突变细胞往往以嵌合形式产生（Burger 等人，2016；Gagnon 等人，2014；Jao 等人，2013）。因此，用于检测基因功能丧失后果的 CRISPR-Cas 筛选大多被设计为检测细胞自主表型的筛选方法。在诱变细胞的异质群体中可以被检测到，例如组织培养中细胞生长特性的改变（Shalem 等人，2014；Wang 等人，2014、2015）或斑马鱼胚胎中特定突触连接的缺失（Shah 等人，2015）。

为了有效筛选斑马鱼中基因功能缺失可能导致复杂或细微发育表型的基因，需要一种能在生长胚胎的几乎所有细胞中稳定产生双等位基因突变的方法。提高标准单向导RNA（sgRNA）-Cas9复合物诱变效率的一种方法，是使用多种单向导核糖核蛋白（sgRNPs）的混合物，每种混合物靶向基因内的不同位点（Wu 等人，2018）。然而，核酸酶活性不足仍然限制了其在诸多场景中的适用性，例如在F0胚胎中同时灭活两个基因或诱导缺失突变。

事实上，缺失突变是定义无效状态的必要资源，越来越多的研究结果也强调了这一点——这些研究表明，概念上导致提前终止密码子的突变有时并不会产生无效突变。对哺乳动物细胞和斑马鱼的研究显示，改变编码序列的突变可促进突变外显子的跳跃（Anderson 等人，2017；Lalonde 等人，2017；Mou 等人，2017；Prykhozhij 等人，2017），有时还会生成部分具有功能的蛋白质（Flanigan 等人，2011）。对基因组中存在大片自动合子区域的人群进行筛查，发现了一些健康个体，他们在已知与疾病相关的基因中携带明显的提前终止突变纯合子（Narasimhan 等人，2016）。此外，部分产生转录本并发生无义介导的mRNA降解的突变等位基因，可触发相关基因的代偿性转录，从而有效掩盖突变基因缺失所带来的后果（El-Brolosy 等人，2019；Ma 等人，2019；Rossi 等人，2015）。而缺失转录序列的缺失等位基因，则能避开由可变剪接或代偿性转录实现的功能拯救。正如果蝇研究人员长期以来所认识到的，缺失突变是揭示无效状态的有效工具（Muller，1932）。

在此，我们证明了通过使用CRISPR系统的双RNA组分（crRNA:tracrRNA）版本，斑马鱼中CRISPR-Cas9介导的诱变的通用性和一致性得到了极大提升（Jacobi等人，2017）。在该系统中，化学合成的crRNA和tracrRNA分子形成的RNA双链体与Cas9蛋白结合，形成“双链向导核糖蛋白复合物”（dgRNPs）。此前已有研究表明dgRNPs可有效诱导斑马鱼发生突变，但其显著的应用价值尚未得到深入探究（Kotani等人，2015）。

我们发现，双链向导RNA（dgRNA）-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）在斑马鱼中能高效诱导双链断裂（DSB）修复引发的突变，即便是在那些对经典单链向导RNA（sgRNA）-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）活性表现出较强抗性的靶位点上也是如此。将dgRNPs注入斑马鱼卵后，发育胚胎中的几乎所有细胞都携带有双等位基因插入缺失（indel）突变，而胚胎自身通常能正常发育，不会出现无关的异常或细胞死亡水平升高的情况。因此，经诱变处理的F0胚胎往往在细节上与真正的蛋白无效突变体高度相似。此外，利用靶至少50千碱基对的缺失突变可在后续世代中轻松产生并稳定遗传。向单条染色体上不同位点的成对dgRNPs，可实现生殖系可遗传的突变。

设计

由于CRISPR-Cas9技术有时会在斑马鱼胚胎中诱导高水平的双链断裂修复介导的诱变（Burger等人，2016；Gagnon等人，2014；Hwang等人，2013；Jao等人，2013；Varshney等人，2015），我们推断提高CRISPR-Cas9介导诱变的一致性，既能实现对F0胚胎无效表型的常规筛选，也能获得可遗传的缺失突变。目前，向斑马鱼卵中注射由sgRNA与Cas9蛋白复合形成的体外组装核糖核蛋白（sgRNPs），可实现最高水平的诱变（Burger等人，2016；Gagnon等人，2014）。我们探究了使用不同形式的向导RNA是否能提高Cas9核糖核蛋白在体内的活性一致性。

图1A展示了双RNA组分（crRNA:tracrRNA）导向RNA（dgRNA）与更常见的单链向导RNA（sgRNA）组成的CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物之间的差异。crRNA:tracrRNA RNP复合物由Cas9蛋白和两种独立化学合成的RNA组成，这些RNA经设计可模拟化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）CRISPR-Cas9系统天然形式中的crRNA和tracrRNA分子（Jinek等人，2012）。合成的RNA可进行化学修饰（例如IDT公司的Alt-R技术），以增强其对核酸酶降解的抵抗力，并避免在部分细胞中触发先天免疫反应（Hendel等人，2015；Schubert等人，2018）。在化脓链球菌系统和合成crRNA:tracrRNA系统中，短链crRNA均与靶位点完美互补，从而提供靶向特异性；而tracrRNA则与crRNA形成双链结构，为Cas9参与RNP复合物的形成提供支架（Jiang和Doudna，2017）。Jinek等人（2012）开发的常用sgRNA源自crRNA与tracrRNA序列的融合。由于可制备由Cas9和sgRNA或crRNA:tracrRNA双链组成的RNP复合物来靶向相同的基因组序列，我们对比了这两种RNP复合物在斑马鱼基因组中诱导突变的能力。此外，由于sgRNA分子通常通过体外转录反应生成，且转录产物的5'端必须带有鸟嘌呤核苷酸，我们还检测了部分sgRNA中多余的鸟嘌呤（Gs）是否会影响Cas9 RNP的活性。

结果

测定sgRNA和dgRNA-Cas9 RNP复合物的诱变效率

首先，通过靶向 zp3b 基因的第一个外显子（图1B），比较了 Alt-R 修饰的 dgRNA 构建的 RNP 与体外转录的 sgRNA 构建的 RNP 诱导突变的效率；我们曾在该基因组位点发现 sgRNPs 诱导的突变水平处于中等程度。向受精卵的细胞质中注射靶向 zp3b 位点1的 5 mM sgRNP 或 5 mM dgRNP 复合物（zp3b_1，表S1列出了本研究中所有靶向位点的序列）。由于 zp3b 仅在发育中的卵母细胞中特异性表达（Onichtchouk 等人，2003），因此新诱导的突变预计不会影响胚胎发育。在在受精后24小时（hpf）确定zp3b基因座。为估算每个胚胎中发生突变的靶向基因座比例，从单个24小时受精期胚胎中分离基因组DNA；使用荧光标记引物扩增靶向位点；通过毛细管电泳对扩增子进行分离（图1C）；并确定大于或小于野生型（WT）的扩增子比例，该比例反映了基因组中靶向位点存在插入缺失（indel）突变的情况（Carrington等人，2015）。该测定结果可能会低估诱变效率，因为插入缺失突变可能不会改变基因座的核苷酸数量，且部分插入缺失突变可能会去除引物结合位点，从而无法被扩增。图1D和图1E展示了注射sgRNPs或dgRNPs的单个胚胎中，携带插入缺失突变的zp3b基因座百分比。这些结果表明：（1）对于每种gRNP类型，独立注射的胚胎发生诱变的程度具有显著的一致性；（2）dgRNPs可在注射胚胎的靶向基因座的几乎所有拷贝上诱导突变；（3）dgRNPs的效果优于sgRNPs。

图1. 斑马鱼中比较sgRNP和dgRNP复合物诱变活性的实验方法。（A）本研究中使用的CRISPR-Cas9复合物示意图。dgRNP旨在模拟酿脓链球菌中天然存在的CRISPR-Cas9复合物形式，由Cas9蛋白（橙色）和两条形成双链RNA的RNA分子（crRNA，红色；tracrRNA，绿色）组成。crRNA提供靶位点特异性。crRNA和tracrRNA分子为化学合成，通常经过Alt-R（IDT）修饰以增强对宿主细胞降解的抵抗力。sgRNP由Cas9蛋白（橙色）和sgRNA（品红色）组成，sgRNA是crRNA与tracrRNA序列的融合体。除非另有说明，本研究中使用的sgRNA均通过体外转录制备。两种gRNP均需要靶位点旁侧的PAM序列（蓝色），且切割靶序列的方式相似（箭头所示），因此可直接比较二者的活性。（B）目标zpb3b_1（闪电符号）位于外显子1中，靠近基因的翻译起始位点（方框表示外显子；填充区域表示编码序列）。用于扩增目标序列的引物对位置已标出（红色箭头）。（C）从24小时 post-fertilization（hpf）未注射的野生型（WT）胚胎，或注射了靶向zpb3b_1的基因编辑核糖核蛋白（gRNPs）的胚胎的基因组中扩增子群体的毛细管电泳图谱示例。垂直虚线表示主要野生型峰的迁移率。（D和E）将sgRNPs或dgRNPs注射到野生型（WT）卵中后，计算每个胚胎中存在插入缺失（indel）突变的位点百分比（D）并绘制图表（E）。独立注射实验获得了高度可重复的结果。采用非配对Student's t检验计算统计学差异 ((^{* * *} p<0.001))(F)dgRNPs 始终具有高致突变性，且在许多位点的活性超过 sgRNPs。向受精卵中注射 1 纳升 5 毫摩尔/升的 sgRNP（实心圆）或 5 毫摩尔/升的 dgRNP（空心圆）（针对 gfp 靶点注射了 2.5 毫摩尔/升的 gRNP），并如(C)中所述通过毛细管电泳技术检测插入缺失突变的诱导情况。采用非配对 Student t 检验计算统计差异（(p 0.05) (^{* *} p<0.001)；n.s.，无显著差异）。

sgRNPs 或双链 RNP 诱变的优化条件

通过将 Cas9 蛋白与等摩尔量的 sgRNA 或 crRNA:tracrRNA 双链体孵育，生成了具有功能的 CRISPR-Cas9 RNP 复合物。由于 sgRNA 源自体外转录反应，若对 sgRNA 浓度估算错误或 sgRNA-Cas9 RNP 复合物形成效率低下，特定的 sgRNP 可能会表现出活性降低的情况。我们在实验中检测了 RNA 不足是否会限制 sgRNP 的活性。将 sgRNA 或 dgRNA 与 Cas9 蛋白以 0.4:1、1:1 或 2:1 的摩尔比孵育，生成了靶向 (gfo) 序列的 RNP 复合物。将复合物注射到单拷贝 gfp 报告基因杂合的卵中（详见 STAR 方法），并测定了单个胚胎基因组中诱变靶点的百分比（图 S1A）。由 sgRNA 或 dgRNA 与 Cas9 蛋白以 1:1 摩尔比混合生成的 RNP 复合物表现出最大活性；而摩尔过量的 RNA 孵育并不会增强或降低 RNP 的活性。因此，在我们的实验中，Cas9 是限制 gRNP 活性的关键因素，这使得我们能够对靶向相同基因组序列的等量 sgRNP 和 dgRNP 的活性进行有效比较。

针对(gfp)报告基因的实验表明，突变的诱导取决于递送至斑马鱼卵的活性CRISPR-Cas9 RNP的量：注射2.5 mM sgRNP或dgRNP复合物产生的插入缺失突变显著多于1 mM gRNPs溶液（图S1A）。为确定获得最大诱变效率所需的注射gRNP量，向胚胎注射约1纳升含2.5、5或10 mM靶向kcnh6a或白化基因位点的gRNP溶液（图S1B和S1C）。各浓度下获得的诱变程度几乎无差异。我们采用注射5 mM gRNP的标准条件。

我们检测了注射5 mM sgRNP或dgRNP的胚胎是否出现CRISPR-Cas9复合物的脱靶毒性效应。靶向zp3b基因的两个不同编码序列或kcnh6a基因座内含子1的RNPs注射，并未影响胚胎发育至自由游动的鳔阶段（图S2）。此外，通过活化Caspase 3的免疫组织化学染色检测结果显示，靶向kcnh6a的sgRNPs或dgRNPs注射并未诱导细胞凋亡水平升高（图S2B–S2E）。总之，在标准注射条件下，gRNPs可在靶基因座的几乎所有拷贝上诱导突变产生，且不会引起异常细胞死亡或影响胚胎存活率。除特别说明外，下述所有实验均采用了该条件。

dgRNPs 始终具有高效致突变性；50额外的鸟嘌呤可能会干扰 sgRNP 的活性

由于 zp3b 基因中的 dgRNP 靶向位点 1 在诱导插入缺失突变方面明显比其对应的 sgRNP 更有效（图1E），我们检测了这两种 gRNP 类型在额外基因位点上的相对诱变活性（图1F）。利用体外转录的 sgRNA 构建的 sgRNP，在斑马鱼基因组的许多（但并非全部）位点上能高效诱导插入缺失突变（Burger 等人，2016；Gagnon 等人，2014；Jao 等人，2013；Varshney 等人，2015）。向受精卵中注射 sgRNP 后，发育胚胎中约 90% 的 smo_1、alb_1 或 gfp 靶序列拷贝携带插入缺失突变。靶向这些位点的 dgRNP 诱导突变的效果与之相当。然而，在其他位点，dgRNP 的诱变效果远优于 sgRNP。与此前关于体外转录的 sgRNA 无法有效诱变斑马鱼部分靶标（Thyme 等人，2016）的报道一致，我们发现靶向多个靶序列（rtf_1、xrcc6、zp3b_2、smo_2 和 kcnh6a）的 sgRNP 仅能低效（突变拷贝数＜20%）或中等程度（突变拷贝数＜70%）诱导插入缺失突变。在每个这些靶标位点上，dgRNP 的诱变效果均显著更高，除 xrcc6 位点外，在其余所有位点均能使 90% 的靶序列拷贝发生突变。

sgRNPs 的低效性并非源于设计或制备过程中的错误：zp3b_2 和 kcnh6a 基因组靶点以及 sgRNA 转录模板的序列均通过桑格测序得到重新确认，且为独立制备所得sgRNPs 再次表现出较低的活性（数据未展示）。此外，增加 kcnh6a sgRNP 的注射量并未显著提高突变的诱导效率（图 S1B）。

我们考虑了可能导致两种类型RNPs不同行为的几个差异，注意到（1）我们使用的dgRNPs采用了sgRNA中不存在的Alt-R修饰，以及（2）一些sgRNAs含有额外的50末端鸟嘌呤核苷酸，这与基因组目标不匹配，这是使用T7启动子启动其转录所必需的。gRNA的化学修饰已被证明可以增强某些系统中的CRISPR-Cas9活性（Hendel等人，2015年；Schubert等人，2018年），并且在sgRNAs的50末端存在额外的鸟嘌呤核苷酸显然与斑马鱼的诱变活性降低相关（Varshney等人，2015年）。因此，我们比较了由（1）标准(in)体外转录的sgRNAs组成的RNPs的诱变效率，（2）化学合成的sgRNAs与in-vitro-synthesizedsgRNAs序列相同，有或没有Alt-R修饰，（3）化学合成的“理想”（没有额外的G）sgRNAs，有或没有Alt-R修饰，以及（4）有或没有Alt-R修饰的dgRNAs。三个不同靶点的结果完全一致（图2）：gRNAs 50端额外鸟嘌呤的存在是降低RNP诱变活性的单一主要因素。所有(5')端与原间隔靶序列完全互补的sgRNAs和dgRNNPs在诱导突变方面均有效。相比之下，化学合成或(in)体外转录的sgRNAs中额外50G的存在对活性有害。在这里使用的条件下，gRNA的化学修饰不能显著增强斑马鱼中CRISPR-Cas9的致突变性。

因为较短的RNA更容易合成保真度，我们在实验中采用Alt-R dgRNPs作为标准，除非明确指出。

图2：额外的鸟嘌呤可降低 sgRNP 活性为了明确影响gRNP活性的gRNA设计与组成特征，本研究对比了一系列靶向（A）zp3b_1、（B）zp3b_2或（C）kcnh6a的gRNPs的诱变活性。通过核苷酸合成了化学合成的dgRNAs。体外转录产生的sgRNAs（体外转录）在转录本的5'端含有两个额外的鸟嘌呤核苷酸（5'-GG），这些核苷酸与靶位点不互补。本研究还制备了与原间隔区靶序列完全匹配的化学合成sgRNAs，或在其5'端含有两个额外鸟嘌呤核苷酸（5'-GG）的化学合成sgRNAs，这些sgRNAs采用未修饰（未修饰）或Alt-R修饰的核苷酸合成。向单细胞胚胎中注射约1纳升的5 mM gRNPs，并如图1所示检测插入缺失突变的诱导情况。由5'端与靶位点完全互补的gRNA组成的“理想”gRNPs均表现出极高的诱变活性。而每一种含有额外5'端鸟嘌呤核苷酸gRNA的gRNPs，其活性均显著低于“理想”gRNPs组（单因素方差分析检验）。未修饰（未修饰）或Alt-R修饰的核苷酸

用双链RNPs诱变产生F0胚胎中空突变体的表观

由于dgRNP注入的胚胎似乎不表现出非特异性发育缺陷，即使几乎所有靶向基因座的拷贝都发生突变，我们分析了注入的F0胚胎与真正突变体相似的程度。rx3编码成对样的homeodomain-containing转录因子，该因子在发育中的前脑中自主发挥细胞功能，以指定眼睛命运（Stigloher等人，2006年）。dgRNPs被设计为靶向编码同源结构域的外显子2中的序列（图3A）。2天受精后（dpf）空突变体胚胎表现出非常正常的身体计划，但缺乏眼睛（图3B和3D）。所有注射了靶向rx3_1的dgRNPs的可烧焦卵子，98%注射了靶向dgRNPs的卵子rx3_2在没有眼睛的情况下发育（图3C和3E）。靶向其他基因座也产生突变体的phocopies。例如，80%的胚胎注射了dgRNP靶向外显子1的白化/slc45a2（alb_1）缺乏2 dpf色素沉着的所有证据（图S3）。

与一些发育突变体相关的模式缺陷可以被掩盖，如果基因功能的损失在马赛克时尚。为了确定dgRNPs是否可以用于生成复杂发育突变体的准确phocopy，我们以平滑（smo）为目标，其产品是Sonic hedgehog（Shh）信号的细胞自主激活剂（Lee等人，2016年）（图3）。三种类型的体细胞，慢肌肉先锋细胞，浅表慢纤维和内侧快纤维的规范和发育依赖于不同水平的Shh信号（图3G和3K）（Wolff等人，2003年）；smo null突变体缺乏所有三种类型的细胞（图3J）。smo功能的马赛克损失可以很容易地检测到，如注射了针对smo外显子3（站点2）的sgRNPs的F0胚胎中存在的三种细胞类型的不完全损失所示（图3H和3K）。相比之下，靶向smo_2站点与dgRNPs产生的胚胎统一类似于真正的null smo突变体和几乎没有Shh依赖的肌肉细胞（图3I和3K）。

图3. dgRNPs可产生敲除突变体的准确表型模拟体靶向rx3_1或rx3_2位点的复合物（A-E）由野生型（WT）卵子发育而来的F0胚胎，经注射rx3 dgRNPs后，表型与rx3突变体缺失型相似。（A）设计了两种dgRNPs，靶向rx3外显子2内编码Rx3转录因子DNA结合结构域的区域（外显子序列以红色阴影标注）中的位点（闪电标识）。（B）野生型、（C）注射rx3 dgRNP的或（D）纯合突变型rx3胚胎在受精后2天（2 dpf）的表型。（E）几乎所有注射dgRNP的胚胎均表现出眼部缺陷，与纯合缺失型突变体无明显差异。（F-K）靶向平滑基因（smo）的dgRNP复合物注射后，F0胚胎的表型与smo缺失型突变体相似。（F）设计gRNPs靶向编码Smoothened蛋白“Frizzled结构域”区域5'端的smo_2位点（闪电标识，外显子序列以红色阴影标注）。（G-K）三种可区分的肌纤维的发育依赖于音猬因子（Shh）信号通路和平滑基因的活性。慢肌前体细胞（MPs）的细胞核同时表达Prox1和Engrailed（En）转录因子，而内侧快肌纤维（MFFs）仅表达En，表层慢肌纤维（SSFs）仅表达Prox1。通过免疫染色可观察到依赖于Shh的肌纤维细胞核（以Prox1[品红色]和/或En[绿色]表达为标记），样本包括（G）未注射、（H）注射smo_2 sgRNP的或（I）注射smo_2 dgRNP的野生型胚胎，以及（J）(smohi640)缺失型突变胚胎。（K）通过分析每个胚胎中标准五个体干节的细胞核染色情况，确定依赖于Shh的肌纤维的存在情况。图中绘制了每个胚胎每个体节中依赖于Shh的肌纤维细胞核的平均数量（未注射：([n=6])；注射smo_2 sgRNP：([n = 5])；注射smo_2 dgRNP：([n=6]])）。另见图S3。

检测到细胞非自主性模式形成表型在因弥散性信号因子缺失而呈嵌合状态的胚胎中尤其具有挑战性。骨形态发生蛋白（骨形态发生蛋白，BMPs）是可扩散因子，在斑马鱼早期胚胎中指导背腹侧组织的发育模式形成（Hammerschmidt 和 Mullins, 2002；Kondo, 2007；Zinski 等人, 2017）。由于即使是配体暴露的中等水平也能促进组织分化（Schumacher 等人, 2011），胚胎中BMP产生的部分耗竭会导致胚胎出现中等程度的模式形成缺陷。本研究使用dgRNPs靶向编码BMP7a的N端信号序列（bmp7a_1）或可扩散配体区域（bmp7a_2）的序列（图4A），这些区域的功能缺失会导致胚胎严重背化（Dick 等人, 2000；Schmid 等人, 2000）。注射任意一种RNP的尾芽期胚胎均表现出BMP信号突变体特有的异常卵圆形形态（Mullins 等人, 1996；Schmid 等人, 2000）（图4B、4C）。在存活至24小时胚胎期（hpf）的胚胎中，绝大多数表现出极强的背化表型（图4D–4J），与真实的bmp7a突变体高度相似（Dick 等人, 2000；Schmid 等人, 2000）。背化的严重程度表明F0胚胎中几乎没有野生型（WT）BMP分泌细胞残留。

dgRNPs 作为在 F0 胚胎中筛选基因功能试剂的实用性，要求其注射对胚胎正常发育造成的干扰最小。研究人员对注射 dgRNPs 的胚胎进行了观察，以排查与靶基因功能无关的发育异常迹象。他们对注射了靶向 13 个不同位点、不同浓度 dgRNPs 的胚胎，在受精后 24 小时（24 hpf）分别观察其野生型（WT）或预期突变表型的表达情况，同时也检查是否存在其他无关异常发育的迹象。坏死或失活（表S2）。在目标基因的几乎所有拷贝都发生诱变、且绝大多数注射胚胎表现出预期突变表型的条件下，平均仅有7%的注射胚胎在24小时pf时无法发育或出现某种意外的形态缺陷。研究中从未观察到一致的缺陷模式。由此可见，dgRNPs在斑马鱼中极少产生具有表型影响的脱靶效应，且本研究中使用的任何dgRNPs，仅因注射dgRNPs这一操作，均可作为未来筛选背景发育影响的对照。

图4. 细胞非自主性表型可在F0胚胎中准确重现。(A)设计dgRNP复合物以靶向bmp7a中的序列，这些序列分别编码Bmp7a的N端信号序列（bmp7a_1）或成熟配体结构域（红色序列，bmp7a_2）。(B和C) 在尾芽期，所有注射了靶向配体结构域的bmp7a_2 dgRNP的胚胎均表现出严重背化胚胎典型的独特卵圆形形态（C），而野生型胚胎（B）则无此形态。（D-J）靶向bmp7a基因可使24小时受精后（hpf）的F0胚胎出现背化表型。参照（Mullins等人，1996）的方法对胚胎的背化表型进行评分，其中C3代表中度背化，C4和C5被归为重度背化表型。靶向编码Bmp7a N端的序列会产生不同严重程度背化表型的胚胎（D-F及J）。而靶向编码配体结构域的序列，或同时靶向上述两种序列（bmp7a_1/bmp7a_2），则仅会产生重度背化的胚胎（G、H及J）。

F0胚胎中冗余基因相互作用的检测

鉴于dgRNPs在无明显非特异性效应的情况下具有极高的诱变活性，我们推断其可有效用于靶向胚胎中的多个基因。由于注射dgRNPs的胚胎中大多数细胞的诱导突变为双等位基因，我们测试了这些试剂是否可用于同时灭活两个基因，从而使我们能在F0胚胎中发现仅由两个基因共同缺失导致的发育表型。foxd3和tfap2a编码参与神经嵴特化过程的转录因子（Simo˜nes-Costa 和 Bronner，2015）。任一基因的缺失都会部分损害神经嵴的发育；只有当两个基因的功能同时丧失时，神经嵴来源的色素黑素细胞才会被完全消除（Arduini 等人，2009）。正如之前的功能缺失研究所报道的，我们发现敲除 foxd3 对色素细胞的发育没有明显影响，而敲除 tfap2a 仅会导致黑素细胞轻微减少（图5A-5C和5E）。与之形成鲜明对比的是，78% 注射了同时靶向这两个基因的dgRNPs的F0胚胎完全发育为无色素黑素细胞的状态（图5D和5E）。由于黑素细胞源自大量神经嵴祖细胞（Pavan 和 Raible，2012），双基因靶向胚胎中色素的完全缺失表明，F0胚胎中的绝大多数细胞都发生了使 foxd3 和 tfap2a 双双失活的双等位基因突变。

图5. 利用dgRNPs同时靶向两个基因可揭示冗余基因功能。(A)设计dgRNPs以靶向编码foxd3和tfap2a基因转录因子产物的DNA结合结构域（红色阴影外显子序列）的序列（闪电符号）。(B–E) 用foxd3 dgRNPs或tfap2a dgRNPs靶向的胚胎与单突变体相似：(B) 用foxd3 dgRNPs靶向的胚胎在2天胚胎期（dpf）形态上接近正常，且(C) 用tfap2a dgRNPs靶向的胚胎色素沉着适度减少，头部和卵黄处的色素减少最为明显（箭头所示）。(D) 大多数双注射胚胎在2天胚胎期无黑色素细胞，与真实的foxd3;tfap2a双突变体相似（Arduini等人，2009）。(E) 四分之三的双注射胚胎无色素；其余胚胎色素沉着显著减少，这与靶基因功能未完全丧失的情况一致。

利用dgRNPs高效产生缺失突变

此前已有研究表明，利用 TALENs 或 CRISPR/Cas9 复合物靶向两个相连位点能够诱导缺失突变，但此类损伤的恢复效率效率低下（古普塔等人，2013；林等人，2013；太田等人，2014；瓦尔什尼等人，2015）。鉴于dgRNPs诱导突变的频率极高，我们推断靶向单条染色体的dgRNPs对可能同时产生双链断裂（DSBs），这些断裂经修复后会形成缺失突变。我们设计了一项实验，以探究能否在体细胞组织中高效诱导缺失突变。我们靶向了白化基因内含子的组合区域（图6A），预期单个RNP活性引发的小插入缺失（indel）突变可能仅局限于单个内含子，既不会影响基因功能，也不会使细胞呈现无色素表型。相比之下，移除外显子的缺失突变会使基因功能丧失。在受精后2天（2 dpf）的胚胎中，视网膜色素上皮（RPE）中缺乏色素的突变型白化细胞可被轻易识别。但由于功能缺失型白化突变为隐性突变，只有双等位基因发生缺失的细胞才能在表型上被鉴定出来。约2%的胚胎注射了靶向内含子2（位点2）、内含子3（位点3）或内含子6（位点4）的单个dgRNP，这些胚胎似乎出现了小克隆无色素细胞，这表明靶向单个位点通常不会导致大片缺失突变的产生（图6B）。相比之下，在注射靶向内含子2和3中相距1千碱基对位点的双dgRNP对的约40%胚胎，以及注射靶向内含子2和6中相距21千碱基对位点的dgRNP对的25%胚胎中，观察到了视网膜色素上皮（RPE）中的突变克隆（图6B）。这些双靶向胚胎中的绝大多数含有占视网膜色素上皮一半以上的无色素组织斑块（图6C–6E），这一结果与早期卵裂阶段诱导突变的情况最为一致。使用位于靶向位点两侧的引物对，只有在注射了双dgRNP对的胚胎基因组中才能检测到预期大小的缺失突变（图6A和6F；数据未显示）。对注射靶向内含子的双dgRNP对的4天龄（dpf）胚胎体细胞中存在的缺失突变进行序列分析发现，突变是靶向位点远端序列的近乎完美连接（图S4）。每个突变都含有一个独特的缺失连接点，这与小插入缺失突变的产生伴随诱导双链断裂（DSB）侧翼染色体区域连接的解释相符。

可在多个基因座轻松诱导出0.5至50千碱基对的缺失突变，包括alb、smo、bmp7a、egfl7、zp3b和megf6b（图6、图7及图S5至图S7）。对注射了靶向两个连锁位点的dgRNPs的胚胎的DNA进行分析后发现，存在连接片段，该片段将每个靶位点远端的序列拼接在一起，且在连接位点处还存在小的插入缺失突变（图S5）。只要使用的RNP中含有与原间隔区靶序列完全匹配的gRNA序列，就能诱导产生缺失突变（图S6）。为确定是否可诱导大片段缺失并通过种系稳定传递，我们靶向了megf6b基因外显子2和31中相距52千碱基对的位点（图S7）。对注射dgRNP组合的胚胎的基因组DNA分析显示，每个胚胎均存在连接外显子2和31的缺失突变。将注射后的胚胎培育至成年，对16名随机选取的F0代雄性成体的种系进行分析，以检测新诱导的megf6b缺失突变的传递情况。其中4只F0代成体共传递了5种不同的突变。可遗传的缺失突变似乎是靶向位点远端序列简单连接的结果，同时伴随影响5至33个碱基的小片段插入缺失序列变化。我们随机选取其中2种缺失突变进行进一步传代研究，发现每种突变均以单基因座简单功能丧失突变的方式分离，表明简单缺失突变可轻松获得。

图6. 同时靶向染色体上两个位点可高效产生缺失突变。(A)设计dgRNPs以靶向内含子2（alb_2）、内含子3（alb_3）或内含子6（alb_4）中的位点（闪电标识）。图中标注了目标位点之间的大致距离，以及用于检测导致目标位点连接的缺失突变的引物对位置（红色箭头）。(B) 对未注射的胚胎（）或注射了靶向alb基因座内含子的单个dgRNP或dgRNP对的胚胎，在2-3天胚胎期（dpf）对其视网膜色素上皮（RPE）的无色素组织斑块进行观察。(C–E) 注射了dgRNP对alb_2和alb_3（D）或alb_2和alb_4（E）的胚胎，通常会出现大片无色素的突变组织克隆，而未注射的胚胎眼睛（C）中则未观察到此类现象。(F) 通过用靶向位点侧翼的引物对进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，在注射了dgRNP对的F0代胚胎基因组中检测到了缺失突变。在同时注射了alb_2和alb_3 dgRNPs的8个4天胚胎期胚胎中，均检测到了预期大小的连接片段扩增子（括号所示）；在注射了alb_2和alb_4 dgRNPs的8个4天胚胎期胚胎中，有5个检测到了该扩增子，相关结果见图S4。从标星胚胎中回收的连接片段已进行测序，具体结果见图S4–S7。图中还绘制了出现alb突变组织的胚胎发生率（标注了被统计胚胎的数量）。

基因内缺失突变在揭示基因功能方面具有重要价值

在某些情况下，通过检测____细胞能最好地揭示与基因功能丧失相关的表型对于敲除该基因的缺失突变呈双等位基因状态。某些基因中存在的提前终止密码子（PTC）突变（可能在双链断裂修复过程中产生），可引发相关基因的无义介导的降解依赖性代偿性转录（El-Brolosy 等人，2019；Ma 等人，2019）。相关基因的表达上调可能掩盖突变基因缺失的功能后果。由于突变mRNA的RNA降解产物会刺激代偿性转录，因此阻断转录本生成的突变无法促进代偿性反应。

未能产生egfl7转录本的胚胎存在血管系统缺陷，而egfl7基因中存在无义突变（PTC）的胚胎则因emilin基因表达上调而拥有野生型（WT）的血管系统（Rossi等人，2015）。我们探究了在F0胚胎中诱导缺失突变是否可用于揭示egfl7基因缺失相关的表型。为检测其对血管发育的影响，我们靶向了表达fli1a:EGFP报告基因的转基因胚胎（Lawson和Weinstein，2002），并在受精后2天（2 dpf）对其节间血管进行分析。我们使用dgRNPs靶向egfl7基因座内的三个位点：外显子3中的关键编码序列（egfl7_1）、位于转录起始位点（TSS）正上游的推测启动子序列（egfl7_2），或非编码3'非翻译区（3' UTR）中的序列（egfl7_3）（图7）。每种dgRNPs均能在体内有效诱变其靶标（数据未显示）。与此前研究结果一致——外显子3中的移码突变会触发转录补偿，使携带此类突变的纯合胚胎表现出野生型表型（Rossi等人，2015），我们发现用dgRNPs靶向外显子3未观察到明显的表型效应（图7C和7H）。靶向转录起始位点上游区域偶尔会导致胚胎出现血管异常（图7D和7H），而靶向3'非翻译区序列似乎并未影响血管系统（图7E以及7H）。相比之下，同时靶向基因的50端和30端在发育中的胚胎中产生了egfl7缺失突变体（图7I），其中超过一半的胚胎出现血管缺失或异常分支的情况（图7F-7H和S5）。我们得出结论，利用dgRNPs产生缺失突变体的效率足够高，因此有时可以在F0胚胎中探究与补偿性网络相关基因的细胞自主功能。诱导产生的缺失突变体在F0胚胎中用于筛选基因功能的效率，将取决于携带双等位基因缺失突变的组织比例，以及在细胞亚群中检测相关突变体表型的难易程度。

图7 缺失突变揭示基因F0 胚胎中的功能 。(A)图示为egfl7基因的结构。红色区域编码EGFL7的保守结构域，包括EMI（弹性蛋白样微纤维原蛋白）结构域、表皮生长因子结构域以及钙结合表皮生长因子样结构域。设计的dgRNPs靶向egfl7的外显子3中的位点（闪电符号，egfl7_1）、转录起始位点上游（egfl7_2）或3'非编码区（egfl7_3）。(B–H) 向携带fli1a:EGFP报告基因转基因品系的胚胎分别注射单个egfl7 dgRNP或egfl7_2与egfl7_3 dgRNP组合后，对节间血管的形态进行评分。注射单个dgRNP的胚胎（C–E）表现出与野生型（B）一致的形态，仅靶向启动子区域的单个胚胎出现异常（H）。同时靶向egfl7 5'端和3'端的胚胎常出现血管系统缺陷（F–H）。(I) 采用侧翼于egfl7_2和egfl7_3位点的引物（A，红色箭头）对同时靶向egfl7 5'端和3'端的胚胎的基因组DNA进行扩增，得到连接片段，其大小（括号）与诱导产生的缺失突变的存在相符。从标记星号的胚胎中回收的连接片段经测序后结果见图S5。

讨论

本文所述研究显著拓展了CRISPR-Cas9系统在斑马鱼基因功能分析中的通用性。以往研究表明，由Cas9蛋白和体外转录产生的经典单导向RNA（sgRNA）构成的核糖核蛋白复合物（RNPs），通常能有效诱导斑马鱼发生基因突变，但其效率存在较大波动，且部分单导向核糖核蛋白复合物（sgRNPs）已被发现缺乏致突变活性（Burger 等人，2016；Gagnon 等人，2014；Thyme 等人，2016）。这些特性限制了其作为工具的应用，无法用于在F0胚胎中快速初步筛选基因功能，也难以用于产生确定基因敲除状态所需的可遗传缺失突变（Wu 等人，2018）。相比之下，由Cas9蛋白与化学合成的crRNA和tracrRNA分子生成的dgRNA复合形成的RNPs，能够以极高的效率和一致性启动靶向双链断裂（DSB）及后续的修复过程。dgRNPs均具有强致突变性，将dgRNPs注射到受精卵细胞质后，发育中胚胎的几乎每个细胞都会对新诱导的插入缺失（indel）突变呈现双等位基因状态。我们推测，在斑马鱼发育的早期卵裂阶段，没有任何基因位点能抵抗dgRNPs的作用。

我们的研究表明，在斑马鱼中生成有效 gRNP 的关键在于其 gRNA 的 5' 端必须与原间隔子靶序列精确匹配。此前一项分析了大量 sgRNA 效率的研究指出，额外的 5' 端鸟嘌呤的存在与诱变效率降低之间存在高度显著的相关性效率（Varshney 等人，2015）。在本研究中，体外转录制备sgRNA时常会在其5'端引入一个或两个未配对的多余鸟嘌呤，这一情况在所有实验中均显著降低了gRNP的活性（图1和图2；表S1）。我们发现，设计理想的合成sgRNA或dgRNA，无论是否经过AltR化学修饰以增强其抗核糖核酸酶能力，在诱导突变方面均具有极高活性。由于合成dgRNA所需的短crRNA操作更为简便，我们采用AltR dgRNPs作为标准实验条件。在所有检测位点上，dgRNPs的活性均达到或超过了体外转录sgRNPs的标准水平，且对于那些同源sgRNPs仅能低效靶向的位点，dgRNPs仍能有效诱导突变。dgRNPs的高效性使其成为极具价值的工具，可满足斑马鱼研究领域两大新兴需求：（1）对RNA测序分析中可能发现的候选基因进行快速功能验证；（2）确定基因的完全敲除状态。

转录组分析的最新进展已鉴定出一些基因，其表达模式与细胞分化事件存在有趣的相关性，因此有必要对其进行功能分析（Lukoseviciute 等人，2018；Lush 等人，2019；Raj 等人，2018）。本文呈现的研究表明，dgRNPs可用于快速、准确地进行筛选，并揭示基因功能完全敲除所产生的效应。总体而言，我们靶向编码蛋白质已知功能域或高度保守结构域的序列，基于这样的预期：即使是框内突变也可能频繁干扰野生型（WT）的功能。向野生型受精卵中注射靶向目标基因的dgRNPs，常规可获得F0代胚胎，其发育过程能以极高的保真度重现真正的无效突变体的发育表型。对于反映大量前体细胞中基因累积功能的复杂模式形成表型（例如在平滑突变体中观察到的表型），利用F0代胚胎中的dgRNPs即可轻松模拟。嵌合度足够低，使得靶向编码调控早期胚胎模式形成的信号配体的bmp7a基因时，所获得的F0代胚胎出现严重表型，且能以极高的保真度模拟真正的bmp7a无效突变体。突变细胞在发育早期就被诱导产生，因此即使在原肠胚阶段的胚胎中也能检测到功能缺失缺陷。诱变效率足以支持在F0代胚胎中对基因互作进行有价值的探究，我们对同时靶向tfap2a和foxd3基因所产生的结果进行的分析也证实了这一点。

最后，迫切需要通过缺失突变来确定目标基因功能简单丧失所带来的后果。对人类群体的基因组序列分析（Amorim 等人，2017；Flanigan 等人，2011；Narasimhan 等人，2016）以及对可编程核酸酶诱导的序列变异效应的研究（Amorim 等人，2017；Anderson 等人，2017；El-Brolosy 与 Stainier，2017；Lalonde 等人，2017；Rossi 等人，2015）的研究共同表明，我们对导致基因敲除表型的基因组序列变化的理解尚不完整。在预期会产生简单功能缺失等位基因的编码序列中，看似是翻译提前终止的信号（Popp 与 Maquat，2016），反而可能触发新的转录本剪接事件，或使相关基因发生代偿性表达，从而掩盖基因敲除表型（Anderson 等人，2017；El-Brolosy 等人，2019；Lalonde 等人，2017；Ma 等人，2019；Mou 等人，2017）。缺失等位基因或许能规避简单点突变偶尔引发的相关问题。

本文所述方法为诱导缺失突变提供了一种简便高效的途径。向斑马鱼受精卵中注射成对的dgRNPs，可培育出F0胚胎，其大量组织由新诱导缺失的双等位基因细胞构成。这些遗传嵌合的F0胚胎具有重要应用价值，尤其可作为初步筛选的组成部分，用于探究在无转录补偿情况下基因功能完全丧失所产生的表型效应。从经诱变处理的斑马鱼生殖系中，可轻松获得至少50千碱基对的可遗传缺失突变。我们推测，单个dgRNPs的活性足够高，往往能同时切割同一条染色体上的两个位点，进而触发修复过程，将靶向位点远端的区域连接起来。我们预测（但尚未证实），染色体的其他重排类型如倒位和易位，也可通过类似方式被诱导产生。

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