题目：Minichromosome maintenance protein 10 (mcm10) regulates hematopoietic stem cell emergence in the zebrafish embryo

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37437546/

期刊：Stem Cell Reports

摘要

造血干细胞（HSCs）确保一生中所有血液谱系的持续供应。在应激状态下，造血干细胞具有广泛的增殖扩增能力，而在稳态状态下，造血干细胞主要保持静止状态以防止其耗竭。DNA复制是一个极为复杂的过程，众多因子需以完美协同的方式发挥功能。微小染色体维持蛋白10（Mcm10）是一种重要的复制因子，是真核复制叉正确组装所必需的。本研究利用斑马鱼研究mcm10在胚胎发育过程中的作用，发现mcm10特异性调控造血内皮细胞向造血干细胞的分化 emergence。研究表明，mcm10缺陷型胚胎在新生造血干细胞中出现DNA损伤积累，诱导其发生凋亡。敲低p53可挽救该表型。综上，本研究结果表明mcm10在确定性造血发生过程中发挥重要作用。

引言

在所有脊椎动物中，造血干细胞（HSC）从主动脉生血内皮中产生是一个高度保守的过程，涉及内皮向造血的转化。生血内皮的特化需要多种内在和外在信号，并产生数量有限的造血干细胞，这些细胞必须完成成熟与扩增过程。在胚胎/胎儿生命阶段完成一段时间的扩增后，造血干细胞在成年期会处于静息状态，定位于哺乳动物的成年骨髓（成年造血微环境）以及斑马鱼的肾脏中。多项研究表明，造血干细胞从生血内皮中产生后会迅速进入细胞周期，此时它们尚未到达哺乳动物的胎儿肝脏或斑马鱼胚胎的尾部造血组织（CHT）。

在所有真核生物中，DNA复制始终始于前复制复合物（pre-RC）的招募，该复合物由复制起始识别复合物、细胞分裂周期6（Cdc6）蛋白、Cdc10依赖性转录本1（Cdt1）组成，最终还会加载复制解旋酶的催化核心，该核心由微染色体维持复合物蛋白2-7（Mcm2-7）构成。这一过程发生在有丝分裂后期以及G1期。细胞分裂周期蛋白45（Cdc45）和五三四一（GINS）的额外招募形成CMG解旋酶。Mcm10参与这一激活过程，并在整个DNA复制过程中与Mcm2-7复合物保持物理结合。

此前针对小鼠开展的功能研究表明，Mcm2–7 复合物中仅有一种组分的水平下降，就会激活经典的 DNA 损伤反应——该复合物在年轻和成年造血干细胞中通常过量存在——进而引发大量与复制相关的 gH2AX 焦点、增多的细胞周期缺陷、改变的 DNA 复制叉动态以及染色体缺口/断裂。

如前所述，虽然Mcm2–7复合物在造血过程中的作用已被广泛研究，但文献中关于Mcm10在造血背景下的作用却鲜有记载。近期使用人类细胞系开展的体外研究表明，MCM10对人类端粒复制至关重要，且由MCM10异常导致的端粒维持缺陷会引发与MCM10相关的自然杀伤（NK）细胞缺乏症，以及伴有脾脏和胸腺发育不全的限制性心肌病。不过，仍需进一步研究来阐明其在造血过程中的具体作用。

在本项体内研究中，我们利用斑马鱼探究了mcm10在胚胎发育过程中造血作用中的功能。研究发现，mcm10在生血内皮层面调控造血干细胞的产生，同时我们证实，mcm10基因敲除的胚胎表现出新生成的造血干细胞中DNA损伤的积累，以p53依赖性方式诱导其凋亡。我们的研究结果表明，mcm10在确定性造血作用的形成过程中至关重要。

结果

Mcm10 在造血干细胞中特异性表达

为探究 mcm10 在斑马鱼造血发育过程中的作用，我们首先通过整体原位杂交技术（WISH）检测了其表达模式。结果显示，mcm10 在受精后4-8小时（hpf）最初呈广泛表达。在受精后12小时和16小时的后续发育阶段，其表达仍广泛维持（图S1A）。受精后24-26小时，mcm10 在背主动脉及整个头部均有表达（图1A）。通过双重整体原位杂交实验，我们发现 mcm10 特异性表达于造血内皮细胞中，该细胞可通过 runx1 探针进行标记（图1B）。对受精后26小时的样本进一步分析表明，从解剖的 flk1:GFP 转基因胚胎中分离的内皮细胞中 mcm10 表达富集（图1C及图S1B-S1D为门控和分选策略），尤其在从头部和躯干区域分选的 (GFP ^{+}) 细胞中富集。这些数据表明 mcm10 与胚胎定型造血作用之间存在潜在关联。

图1. mcm10在生血内皮中表达。(A)斑马鱼胚胎发育不同阶段（24–36 小时受精后）mcm10 的整体原位杂交。(B) 26 小时受精后 mcm10/runx1 的双重整体原位杂交。(C) 从 26 小时受精后 flk1:GFP 转基因动物（约 50 个胚胎）中分离头部、躯干和尾部后进行定量聚合酶链式反应分析的实验框架，并与完整胚胎进行比较。数据为技术重复的生物学三次重复。采用单因素方差分析进行多重比较检验，完成统计分析。(^{*} p<0.01)；(^{* * *} p<0.001)；(* * * * p<0.0001)。比例尺：(A) 200 微米，(B) 100 微米。

Mcm10 缺陷影响背主动脉中造血干细胞的产生

为探究 mcm10 在造血发育过程中的作用，我们检测了 mcm10 缺陷对造血干细胞（HSC）发育的影响。未鉴定的 (mcm 10^{sa16502 }) 突变株包含一个点突变，该突变会在外显子8中诱导提前终止（图S2A-S2C）。在这些 (mcm 10^{-/-}) 突变胚胎中，mcm10 信使核糖核酸（mRNA）无法被检测到（图S2D），表明该突变诱导产生了无效等位基因。通过整体原位杂交（WISH）技术，我们发现 mcm10 缺陷胚胎存在确定性造血缺陷，与野生型或杂合突变的同窝胚胎相比，mcm (10^{-1-}) 突变胚胎在28小时胚胎期（hpf）的 runx1 表达水平降低（图2A左图）。这与受精后5天（dpf）在尾造血组织（CHT）中观察到的 cmyb 表达缺失一致（图S3A）。同样，(mcm 10^{-1-}) 胚胎的胸腺中 rag1 表达也有所降低（图S3B、S3C）。我们未检测到 gata1、pu.1 或 flk1 表达的变化，这证实 mcm10 不参与原始造血和血管生成过程（图S4A-S4C）。我们还检测了 gata2b 的表达，该基因是生血内皮细胞中比 runx1 更早的标志物，在 (mcm 10^{-1-}) 突变体中未发现表达差异（图S4D）。

图2 出现：mcm10的缺失会影响造血干细胞。(A)对(mcm 10^{-/-})胚胎及其野生型同胞胚胎，以及通过吗啉代敲低mcm10后的胚胎，在28小时胚胎期（hpf）进行runx1表达的全胚胎原位杂交（WISH）检测。(B) 在36小时胚胎期（hpf），对对照组和mcm10吗啉代敲低胚胎的主动脉区域进行cmyb表达的全胚胎原位杂交（WISH）检测。(C) 采用费希尔精确检验完成统计分析，(^{* * * *} p<0.0001) ((n =) 数据来自三次独立实验的胚胎总数。(D) 在48小时胚胎期（hpf），对对照组和mcm10吗啉代敲低胚胎的尾鳍造血组织（CHT）区域进行cmyb表达的全胚胎原位杂交（WISH）检测。(E) 采用非配对双尾t检验完成统计分析，(^{* * *} p<0.001)（n=三次独立实验的胚胎总数）。比例尺：100微米（A、B和D）。

研究表明，Mcm10 并不参与生血内皮细胞的特化过程，而是参与其向造血干祖细胞（HSCs）的成熟过程。针对外显子5设计的吗啉代寡核苷酸介导的Mcm10敲低会导致外显子5跳跃（图S2E）。这些吗啉代敲低胚胎的表型与(mcm 10^{-1-})突变体胚胎一致，在28小时pf（图2A右图）和36小时pf（图2B和2C）时，它们在主动脉底板处的runx1和cmyb表达量均显著下降。在尾造血组织（CHT）中，最早在48小时pf（图2D和2E）和5天pf（图S3D）时也能观察到以cmyb表达为标志的造血干祖细胞缺失。因此，Mcm10吗啉代敲低胚胎在5天pf时的rag1表达量也有所降低（图S3E和S3F）。与突变体情况一致，Mcm10吗啉代敲低胚胎未表现出任何涉及原始红系造血、髓系造血或血管生成的表型，我们未发现pu.1、mfap4、mpx、gata1、flk1、efnb2a（动脉标志物）以及gata2b的表达发生变化（图S5A和S5B）。为验证此前的观察结果，我们在kdrl:mCherry;cmyb:GFP双转基因胚胎中注射对照吗啉代寡核苷酸和Mcm10吗啉代寡核苷酸，并在32小时pf时计数从背主动脉产生的造血干祖细胞数量（图3A）。与对照组相比，Mcm10吗啉代敲低胚胎的双阳性细胞数量显著减少（图3B）。由于这些结果提示Mcm10缺乏可能诱导造血干祖细胞的细胞死亡，我们在32小时pf的cmyb:GFP胚胎中进行了TUNEL检测。Mcm10吗啉代敲低胚胎的背主动脉区域细胞死亡数量显著增加，与GFP阳性细胞缺失相关（图3C和3D），这表明凋亡性细胞死亡发生在造血干祖细胞发育的早期阶段。

图3：mcm10基因缺陷诱导造血干祖细胞发育过程中的细胞凋亡。(A)注射对照吗啉寡核苷酸或mcm10吗啉寡核苷酸（mcm10-MOs）后，flk1:mCherry;cmyb:GFP胚胎背主动脉的荧光成像。(B) 造血干细胞（HSCs）的定量分析。统计分析：未配对双尾t检验，(^{* * *} p<0.001)（n = 三次独立实验的胚胎总数）。(C) 注射对照吗啉寡核苷酸或mcm10吗啉寡核苷酸（mcm10-MO）后，32小时受精后（hpf）的cmyb:GFP胚胎进行抗GFP和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。(D) 对照组和mcm10敲低胚胎中GFP阳性和TUNEL阳性细胞数量的定量分析。中心值代表平均值，误差值代表均值标准误（SEM），统计分析采用未配对双尾t检验完成。(^{* * *} p<0.001)（n = 三次独立实验的胚胎总数）。比例尺：(A) 50微米，(C) 100微米。

Mcm10 过表达促进生血内皮细胞产生造血干细胞

我们接下来研究了mcm10过表达对胚胎造血作用的影响。我们通过在单细胞阶段注射全长mRNA诱导mcm10过表达，并分析其对发育中造血作用的影响。在24小时受精后（hpf），Mcm10过表达并未改变原始造血作用（以pu.1和gata1为标记）或血管发育（使用flk1:GFP转基因品系）（图S6A-S6C）。我们发现gata2b的表达不受mcm10过表达的影响（图S6D）；然而，mcm10过表达分别在28和36 hpf时增加了runx1和cmyb的表达，表明mcm10在造血干细胞（HSC）发育过程中对gata2b向runx1的转化至关重要（图4A-4D）。这导致在48 hpf和4.5天受精后（dpf），尾造血组织（CHT）中的造血干细胞数量增加（图4E-4H），以cmyb为标记。这种造血干细胞的增加在胸腺中也同样存在（图4I-4L），以rag1染色为标记。为了进一步分析cmyb阳性细胞的增加情况，我们对kdrl:mCherry;cmyb:GFP双阳性细胞进行了成像，我们利用胚胎来研究生血内皮细胞中造血干细胞的产生过程。在受精后32小时，Mcm10过表达显著增加了背主动脉中双阳性的新生造血干细胞数量（图5A和图5B）。相应地，受精后42小时，尾造血微环境中的造血干细胞数量也显著增加（图S7A和图S7B）。事实上，此前的体外功能研究表明，Mcm10过表达能促进细胞周期进程，而通过RNA干扰敲低Mcm10则会降低细胞增殖。为了在我们的体内模型中验证这一假设，我们向Mcm10缺陷型flk1:GFP转基因胚胎中注射了Mcm10信使核糖核酸（用 mcm10 吗啉代寡核苷酸处理后）并进行磷酸化组蛋白 H3（pH3）染色以检测细胞增殖情况。在对照吗啉代寡核苷酸处理的胚胎中过表达 mcm10 确实增加了增殖细胞的数量（图5C和5D），但更重要的是，这一操作能够挽救 mcm10 吗啉代寡核苷酸处理胚胎中观察到的细胞增殖减少现象（图5C和5D）。相应地，mcm10 过表达也挽救了 mcm10 吗啉代寡核苷酸处理胚胎中 runx1 表达水平的降低（图S7C）。综合所有结果，这些研究表明 mcm10 参与了胚胎发育过程中的造血干细胞发生过程，其作用机制可能是通过调控生血内皮细胞的细胞周期进程来实现的。

图4. mcm10过表达提高造血干细胞标志物的表达。(A)未注射组与注射全长mcm10 mRNA 的胚胎，在 28 hpf 时期runx1基因的表达情况。 (B) 采用 Fisher 精确检验进行统计学分析。p < 0.001（n 为三次独立生物学实验的胚胎总数量）。 (C) 对未注射组与注射全长mcm10* mRNA 的 36 hpf 胚胎进行 WISH（全胚胎原位杂交），检测cmyb基因表达。 (D) 采用 Fisher 精确检验进行统计学分析。p < 0.01（n 为三次独立生物学实验的胚胎总数量）。 (E) 未注射组与注射全长mcm10 mRNA 的胚胎，在 48 hpf 时期cmyb基因的表达情况。 (F) 统计每个胚胎 CHT（尾部造血组织）区域内cmyb阳性细胞数量。采用非配对双尾 t 检验进行统计学分析。p < 0.01（n 为三次独立生物学实验的胚胎总数量）。 (G) 对未注射组与注射全长mcm10 mRNA 的 5dpf 胚胎进行 WISH，检测cmyb基因表达。 (H) 采用 Fisher 精确检验进行统计学分析。p < 0.001。 (I) 对未注射组与注射全长mcm10* mRNA 的 5 dpf 胚胎进行 WISH，检测rag1基因表达。 (J) 测量各个胚胎的胸腺面积。采用非配对双尾 t 检验进行统计学分析。**p < 0.01（n 为三次独立生物学实验的胚胎总数量）。比例尺：100 μm（A、C、E、G、I）。

图5. Mcm10过表达在生血内皮水平促进新生造血干细胞增殖。(A)对未注射或注射了mcm10全长mRNA的32小时受精后（hpf）kdrl:mcherry/cmyb:GFP双转基因胚胎的背主动脉进行荧光成像。(B) 报告了每种条件下双阳性细胞的数量。采用未配对双尾t检验完成统计分析。(^{* * *} p<0.0001)。中心值代表平均值，误差值代表均值标准误（n = 三次独立实验的胚胎总数）。(C) 对增殖的内皮细胞进行针对绿色荧光蛋白（GFP）和磷酸化组蛋白H3（pH3）的免疫荧光检测，采用单因素方差分析多重t检验进行评分。(^{*} p<0.01)、(^{* *} p<0.001)，统计分析完成后，中心值代表平均值，误差值代表均值标准误，涵盖每种条件下的所有胚胎。(A)-(C) 为双阳性细胞（对成像区域进行了统计）。(D) 对注射了对照吗啉代寡核苷酸或mcm10吗啉代寡核苷酸的32小时受精后（hpf）flk1:GFP转基因胚胎，报告了双阳性细胞的数量。比例尺：50微米

Mcm10 缺陷的造血干细胞中会积累 DNA 损伤

接下来，我们着手解析mcm10调控造血作用的机制。此前在人体细胞中的功能研究表明，Mcm基因（Mcm2-7）通常以过量形式存在，这能在复制应激状态下保护基因组。Flach及其同事研究发现，Mcm基因水平降低会激活经典的DNA损伤反应，引发大量与复制相关的γH2A.X焦点形成，同时导致与细胞周期缺陷相关的复制应激水平升高。学界普遍认为，γH2A.X焦点是DNA复制叉异常以及染色体缺口/断裂的标志。为了在斑马鱼模型中验证这一假设，我们首先检测了注射对照吗啉寡核苷酸和mcm10吗啉寡核苷酸的AB*胚胎中γH2A.X蛋白的水平。结果发现，mcm10组的γH2A.X水平显著升高形态缺陷型胚胎（图6A和图6B）。接下来，我们特异性评估了造血干细胞中γH2A.X的存在情况。我们向cmyb:GFP转基因胚胎中注射了对照吗啉代寡核苷酸和mcm10吗啉代寡核苷酸，并在受精后32小时进行γH2A.X免疫染色。Mcm10形态缺陷型胚胎的主动脉底板/生血内皮细胞中DNA损伤显著增加，这与我们之前的观察结果一致（图6C和图6D）。该结果表明，与之前已证实的Mcm2-7的作用类似，Mcm10在维持DNA正常的细胞周期进程中也发挥着同等重要的作用。

图6. mcm10缺陷型胚胎出现在新生造血干祖细胞中积累DNA损伤 t检验。（A）蛋白质印迹法检测对照组中γH2A.X的表达量（B）对照组和mcm10形态发生子中γH2A.X/肌动蛋白比值的统计分析。（C）对32小时受精后（hpf）的cmyb:绿色荧光蛋白（GFP）胚胎进行抗绿色荧光蛋白（GFP）和组蛋白H2A.X磷酸化位点（γH2A.X）染色，对照组和mcm10形态发生子的主动脉底板阳性细胞数。（D）对三个独立实验中注射对照吗啉寡核苷酸或mcm10吗啉寡核苷酸的胚胎总数进行双阳性细胞数定量分析。统计分析采用未配对双尾t检验。(>30)（每个实验条件下合并胚胎）。比例尺：50微米（C）。(^{*} p<0.01)（三个独立均值，误差值表示均值标准误，统计分析采用未配对双尾t检验。(^{* * *} p<0.001) (n= number)

抑制 p53 可挽救 mcm10 缺陷胚胎中造血干细胞的缺失

我们已证实，Mcm10 缺陷型胚胎无法从生血内皮细胞中产生造血干细胞。事实上，Mcm10 的缺失似乎会在早期阶段阻断细胞周期。符合HSC规范，诱导细胞凋亡。为抑制同胞胚胎中吗啉代所导致的生血内皮细胞凋亡，以及(mcm 10^{-/-})突变体胚胎中的该凋亡，我们在28小时后受精（hpf）时分析了runx1的表达。我们发现，为了弥补mcm10缺陷型胚胎的情况，我们共注射了对照试剂或(p53)，结果显示runx1的表达得到了显著挽救。注射了p53吗啉寡核苷酸的(mcm 10^{-/-})突变体（图7A）。我们在mcm10吗啉寡核苷酸敲低胚胎中获得了相似的结果（图7B和7C）。总之，mcm10对主动脉造血干细胞的发育是必需的，因为其缺失会导致在gata2b向runx1转化过程中，生血内皮前体细胞发生(p53)依赖性凋亡。

图 7. p53 敲低可挽救 mcm10 缺陷型胚胎中造血干细胞的缺失。(A) 28 hpf 时 runx1 在 (mcm 10^{-1-}) 突变体胚胎及其同窝胚胎中的表达情况，这些胚胎均注射了对照吗啉代或 p53 吗啉代。(B) 28 hpf 时 runx1 在共注射 mcm10 和 p53 吗啉代的胚胎中的表达情况。(C) 使用费希尔精确检验完成统计学分析。(^{*} p<0.01)；(^{*} p<0.001)；(* * * p<0.0001)（n = 来自三次独立实验的胚胎总数）。比例尺：200 微米（A）、100 微米（B）。

讨论

本研究利用斑马鱼模型探究了mcm10在胚胎发育过程中的作用。研究发现，mcm10特异性调控生血内皮细胞向造血干细胞的分化过程。mcm10缺陷型胚胎的新生造血干细胞中会出现DNA损伤累积，进而导致细胞凋亡。通过敲低p53基因可有效逆转这一表型。这些结果与已发表的研究结论一致，进一步证实了复制因子mcm10在胎儿期和成年期对造血干细胞——以及其他干细胞——的细胞周期调控中发挥关键作用。造血干细胞的细胞周期活性受细胞内在机制与微环境分泌的细胞外在因素共同调控，二者之间存在复杂的相互作用。已有大量研究表明，在胎儿期，造血干细胞的核心功能是快速生成维持机体稳态的血细胞以满足氧气运输需求，并在发育中的生物体内建立免疫系统。与这一功能相符的是，在小鼠胎肝发育至E14阶段时，95%至100%的造血干细胞处于活跃增殖状态，细胞周期时长为10至14小时。值得注意的是，小鼠成年骨髓造血干细胞在4周龄时会迅速进入静息状态，仅有5%的造血干细胞处于活跃增殖阶段。胎儿期造血干细胞的活跃增殖与成年期静息状态的转变，可能与基因表达程序的改变相关。如前所述，近期针对小鼠的研究表明Mcm基因家族的所有成员均参与造血干细胞的细胞周期调控。Mcm2-7基因在人类细胞中通常呈过量表达状态，这使我们能够在复制应激条件下维持基因组的完整性。我们在mcm10缺陷型斑马鱼模型的生血内皮细胞中观察到了类似的DNA损伤增加现象。同时，我们发现mcm10的过表达会上调转录因子runx1的表达，这进一步支持了mcm10在生血内皮细胞向造血干细胞分化的初始阶段发挥重要作用的假说。我们的研究结果与果蝇模型中的既往研究结论一致。通过在S2细胞中进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以及在Mcm10敲低的果蝇中进行定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR），研究人员证实Mcm10可能参与了lozenge基因的转录调控，该基因是果蝇中runx1的同源基因。该研究团队利用抗Mcm10抗体对染色质进行免疫沉淀后，成功扩增出了lozenge基因的上游区域，该区域包含多种绝缘子相关因子的结合位点，如MDG4、Su(Hw)、CTCF、CP190和BEAF32。这一系列数据表明，Mcm10在果蝇和脊椎动物中可能分别直接调控lozenge基因和runx1基因，不过这一调控过程的具体分子机制仍有待进一步阐明。

我们的mcm10缺陷斑马鱼模型的特定表型具有特别的研究价值。作为细胞周期/DNA复制中的关键因子，我们原本预期mcm10缺陷会在胚胎发育的极早期诱导致死表型。尽管胚胎早期的缺陷可能由母体来源的RNA所弥补，但这无法解释为何该缺陷首先会在造血系统中诱导表型。不过，这一现象在人类新生儿患者中也有发现，MCM10的突变与特定的造血疾病相关。两项近期研究表明，MCM10基因的杂合突变会导致16至24个月龄的儿童出现自然杀伤细胞缺乏症（NKD）或胎儿限制性心肌病（RCM），并伴随胸腺和脾脏发育不全。在一个单一家族中鉴定出了与自然杀伤细胞缺乏症相关的变异体，包括外显子10中的一个错义突变（(c. 1276 C>T) p.R426C）以及在外显子13末端引入提前终止密码子的一个无义变异（c.1744C>T, p.R582X）。值得注意的是，这种自然杀伤细胞缺乏症还与其他造血谱系细胞数量大幅减少相关，尤其是T细胞和B细胞。关于限制性心肌病，在三名患病同胞中鉴定出了相关变异体，其中包括一个剪接供体位点（c.764+5G>A，p.D198GfsTer10）和一种移码变异体（c.236delG，p.G79EfsTer6）。携带单个MCM10变异体的家庭成员未出现病理症状，这表明单等位基因无效突变在人类中并非单倍剂量不足。由于每种杂合组合均包含一种无效等位基因，每对中的低活性等位基因似乎是进一步降低MCM10功能并诱发疾病的必要条件。基于此，可假设MCM10缺陷型人类患者出现的这些特定造血系统疾病是由RUNX1表达改变引起的。事实上，多项研究已证实RUNX1可驱动促进自然杀伤细胞成熟和增殖的转录程序。在近期的转录组分析表明，来自巨细胞病毒感染小鼠的Runx1缺陷型自然杀伤细胞会出现细胞周期和增殖相关基因的显著下调。在此背景下，未来有必要开展转录组学和功能学研究，以阐明MCM10调控RUNX1表达的确切机制，这有望为造血系统疾病的治疗提供更优的疗法。

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