题目：Conserved expression of the zebrafish syt4 gene in GABAergic neurons in the cerebellum of adult fishes revealed by mammalian SYT4 immunoreactive-like signals

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38765140/

期刊：Heliyon

摘要

突触结合蛋白4（syt4）属于突触结合蛋白蛋白家族，人类和斑马鱼中分别有17个和28个家族成员。在斑马鱼和啮齿动物中，已知syt4在发育早期的整个中枢神经系统中大量表达。在成年啮齿动物体内，该基因的表达转而主要集中于小脑，且大多存在于浦肯野细胞（一种γ-氨基丁酸能神经元）中。然而，目前尚无关于syt4在成年斑马鱼脑中表达模式的相关报道。因此，我们推测syt4的表达在成年斑马鱼中具有保守性，且特异性定位于小脑的γ-氨基丁酸能神经元（很可能是浦肯野细胞）。为验证这一假设，我们首先证实斑马鱼基因组中仅保留一个syt4基因拷贝，且该基因与其他脊椎动物的syt4基因为直系同源基因。我们还在菱脑的多个结构中检测到了哺乳动物突触结合蛋白4抗体免疫反应样（mSYT4-ir）信号，包括小脑瓣内侧区和小脑体。此外，研究发现γ-氨基丁酸能神经元中存在mSYT4-ir信号，在上述结构的分子层浦肯野细胞层中信号尤为显著。相反，在谷氨酸能神经元或胆碱能神经元中未检测到mSYT4-ir信号。综上，我们推断斑马鱼的syt4基因表达模式与此前研究的脊椎动物物种具有同源性，这一结论可通过哺乳动物突触结合蛋白4抗体的阳性免疫反应样信号得到证实。

引言

在模式生物斑马鱼与包括人类在内的其他脊椎动物类群之间，某一特定基因的保守性不仅揭示了该基因的重要功能，也为研究该基因变异引发的人类疾病提供了在斑马鱼身上开展实验的可能。作为研究人类疾病的重要模式生物，明确所研究的基因在斑马鱼与其他哺乳动物物种之间是否具有保守性至关重要。保守性可从不同层面进行分析：基于DNA和蛋白质序列的同源性，以及不同发育阶段的表达模式。值得注意的是，由于硬骨鱼特异性的基因组复制事件，斑马鱼通常拥有与其他物种某一基因同源的一个或多个重复基因。因此，在将斑马鱼作为人类疾病研究模型开展相关基因研究前，有必要先对该基因与脊椎动物同源基因的系统发育关系进行分析。本研究中，我们明确了斑马鱼中一个突触结合蛋白基因与其哺乳动物直系同源基因的保守性。

突触结合蛋白基因家族（SYT）在人类和啮齿类等哺乳动物物种中拥有17个家族成员。这个包含不同异构体的庞大基因家族，通过调控不同生物体中的突触前囊泡胞吐、突触后受体内吞等多种生物学功能，保障大脑的正常功能。尽管对该蛋白家族的认知大多源于对SYT1和SYT2的研究，但越来越多的研究表明，该家族中的同源基因在中枢神经系统中发挥着多样且差异化的作用。

突触结合蛋白4（SYT4）是该基因家族中最具特殊性的成员之一。与其他SYT基因负责囊泡胞吐和感知钙信号不同，研究发现SYT4在果蝇的神经肌肉接头以及啮齿动物的神经元中参与囊泡运输和突触可塑性的调控。

Syt4在啮齿动物大脑中的表达随发育阶段呈动态变化。在发育早期，该基因在中枢神经系统的大部分区域均有表达，而在成年个体中，其表达主要局限于垂体、海马体和下丘脑，且成年个体的小脑中该基因表达量最高。此外，SYT4以细颗粒模式分布于啮齿动物小脑浦肯野神经元（一类γ-氨基丁酸能抑制性神经元）的胞体和树突中，同时也存在于斑胸草雀的小脑颗粒层和浦肯野细胞层。一系列研究表明，SYT4的缺失会导致啮齿动物运动协调能力受损、被动回避行为异常，以及焦虑和抑郁样行为减少。这些研究表明，Syt4对啮齿动物运动、学习和记忆相关神经元回路及脑区的突触调控至关重要。

有趣的是，研究发现该基因的一些基本分子功能在果蝇和啮齿动物之间存在相反表现。尽管果蝇和啮齿动物均出现了非同义突变，该突变会损害SYT4蛋白C2A结构域的钙感应能力，但果蝇仍保留了结合钙的能力，而啮齿动物则丧失了这一能力。此外，该基因在果蝇和啮齿动物的突触后逆向信号、囊泡胞吐速率以及SNARE催化的膜融合过程中发挥着相反的作用。这引出了一个有趣的问题：该基因在无脊椎动物和脊椎动物之间可能存在功能分化。然而，目前关于斑马鱼中该基因的相关信息十分匮乏，这限制了其作为人类疾病相关脊椎动物模型的应用潜力。

作为研究人类基因的相关模式生物，斑马鱼中关于syt4基因的研究认知仍较为有限。研究观察到，syt4基因在斑马鱼胚胎和幼体的大脑、脊髓等中枢神经系统中特异性表达，这一表达模式与啮齿动物中的情况一致，具有保守性。然而，目前关于syt4基因在成年斑马鱼脑区及细胞中的分布情况仍不明确。为探究syt4基因在脊椎动物与无脊椎动物之间是否发生功能分化以及分化的机制，获取该基因在成年斑马鱼脑中的基础研究数据至关重要。我们推测斑马鱼syt4基因在成年大脑中可能呈现出与啮齿动物相似的保守表达模式。本研究通过以下实验解答了这一问题：（1）分析斑马鱼syt4基因与啮齿动物的直系同源Syt4基因、人类SYT4基因的系统发育关系，以明确它们的同源性；（2）揭示syt4基因在成年斑马鱼脑区及神经细胞类型中的表达分布。本研究将为未来研究斑马鱼中该基因的功能奠定基础，也有助于进一步理解该基因在无脊椎动物与脊椎动物类群间的功能分化。

结果

突触结合蛋白4（syt4）是斑马鱼中与其他脊椎动物的SYT4基因对应的唯一同源基因

在将斑马鱼用作模式生物研究人类SYT4基因功能之前，确认斑马鱼syt4基因的同源性至关重要。SYT基因家族在人类中有17个家族成员：SYT1至SYT17（人类基因组草图GRCh38.p13，Ensembl数据库）。在斑马鱼中，已鉴定出28个家族成员（ZFIN数据库，补充表1）。由于硬骨鱼特异性基因组复制，部分基因成员保留了重复的旁系同源物，例如斑马鱼基因组中的syt1a和syt1b。尽管在斑马鱼中仅鉴定出一个syt4基因，但我们的目标是通过系统发育分析确认斑马鱼syt4与脊椎动物中其同源基因的同源性。截至我们检索和分析数据之日，ZFIN数据库中报道的部分斑马鱼syt基因未纳入分析，原因是这些基因在Ensembl数据库中未被鉴定到，即syt2b、syt8、syt18a、syt18b和syt19。

系统发育分析总结出以下两点结论：（1）斑马鱼syt4与人类和啮齿动物的其他SYT4基因聚为一支，而所有其他SYT基因则作为外类群出现（图1A、补充图1）。采用最大似然法（ML）和最大简约法（MP）两种不同算法，以及DNA编码序列和肽序列进行分析，结果均保持一致（补充图1）。（2）如先前研究所述，SYT11与syt11a/b分别是人类和斑马鱼中SYT4与syt4的最近旁系同源基因。需要指出的是，当采用最大简约法分析时，人类SYT11以及斑马鱼syt11a和syt11b的DNA编码序列会与其他SYT4基因聚为一类（补充图1B）。但这一发现并未改变此前的结论：在所分析的物种中，相较于其他SYT基因，SYT4与SYT11拥有最近的共同祖先。

总之，斑马鱼中的syt4基因是人类及选定脊椎动物物种中SYT4基因的直系同源基因。因此，斑马鱼syt4基因可作为研究人类直系同源SYT4基因功能的合适模型。这进一步表明SYT4在脊椎动物中具有保守且重要的功能。

图1. syt4与其他脊椎动物物种同源物的同源性。(A) 斑马鱼及啮齿类、人类等其他脊椎动物物种中syt4与syt基因的简化系统发育树。完整的系统发育树见补充图1。(B) C2A结构域部分肽序列的比对，该结构域在图中标注了1-5号5个钙结合位点。我们选取了人类中钙结合位点第三位无突变的同源物SYT1-3与SYT4进行比对，同时选取了存在氨基酸替换的另一同源物SYT11作为参照。钙结合位点的氨基酸替换（天冬氨酸(D)变为丝氨酸(S)）在斑马鱼基因syt4、syt11a和syt11b中具有保守性（第三个氨基酸，红色框标注）。我们还观察到斑马鱼syt4和人类SYT11的第五结合位点存在额外的氨基酸替换（天冬氨酸(D)变为谷氨酸(E)，浅蓝色框标注）。为便于直观观察，不同物种间的保守氨基酸以不同颜色标注。

钙结合位点的氨基酸取代在斑马鱼SYT4 C2A结构域中具有保守性

有研究表明，由于第三个钙结合位点从天冬氨酸（D）突变为丝氨酸（S），人类SYT4的C2A结构域不具备钙结合能力。研究发现，这种天冬氨酸向丝氨酸的突变在啮齿动物SYT4中具有保守性。在人类和啮齿动物中，亲缘关系最近的相关基因SYT11中也发现了该替换。通过对比C2A结构域的钙结合区域，我们在斑马鱼SYT4的第三个钙结合位点鉴定出了天冬氨酸向丝氨酸的保守替换（图1B）。此外，我们还在斑马鱼syt4的第五个钙结合位点发现了天冬氨酸（D）向谷氨酸（E）的替换，该替换在人类SYT11中同样存在。相关文献显示，天冬氨酸和谷氨酸的钙结合能力可能存在差异。然而，该蛋白中新替换位点的离子结合能力仍需进一步研究来阐明。

针对斑马鱼大脑的抗体选择及免疫反应检测

在斑马鱼和啮齿动物的胚胎阶段，syt4 在整个中枢神经系统中均有丰富表达，但在啮齿动物成年期，其表达量最高的部位仅限于小脑。鉴于成年斑马鱼中 syt4 的相关研究较少，本研究旨在确定 SYT4 在斑马鱼脑中的表达模式及抗体特异性。

最初通过原位杂交技术在斑马鱼成体大脑中检测RNA表达的尝试未获明确结果（补充图2）。因此，研究人员转而致力于阐明该基因在成体大脑中的蛋白表达情况。为此，我们开展实验以检测该基因在成体大脑中的蛋白表达。实验流程如补充图3所示。

在免疫荧光染色实验中，我们设置了全面的阴性对照。鱼脑仅用二抗（赛默飞世尔科技公司的Alexa Fluor 488和594）进行染色，未加入一抗，同时还设置了不含一抗和二抗的阴性对照（补充图4）。这些对照实验旨在确保后续在SYT4染色中观察到的阳性信号具有可靠性。

由于缺乏特异性靶向斑马鱼SYT4的抗体，本研究评估并测试了多家制造商生产的针对大鼠和人SYT4的多种哺乳动物SYT4抗体。大部分实验结果采用由Synaptic Systems公司生产的、基于大鼠SYT4肽段设计的抗SYT4抗体（货号#105143）获得，并通过ABClonal公司生产的、基于人SYT4肽段设计的抗SYT4抗体（货号#A7737）进行了验证（相关结果将在后文段落中阐述）。需要重点说明的是，尽管哺乳动物与鱼类SYT4的蛋白序列具有较高的相似性（约70%），但本研究将斑马鱼中呈现的哺乳动物SYT4免疫反应性样信号定义为mSYT4-ir信号，这一定义是暂时的，因为尚未对斑马鱼中其他SYT抗体进行测试。

在成年斑马鱼的后脑（主要是小脑）中检测到阳性的mSYT4免疫反应性信号

我们首先旨在通过分析野生型（WT）斑马鱼全脑内mSYT4免疫反应性信号的分布来鉴定表达syt4基因的脑区，实验至少设置3次重复（一次重复的结果见补充图5）。在本文中，我们仅描述了本研究中所有重复实验均一致标记的免疫阳性区域。

在前脑（包括端脑和间脑）以及视顶盖中未检测到 mSTY4-ir 信号（图2A、B，补充图5）。在小脑瓣内侧部（Vam）检测到阳性信号，而小脑瓣外侧部（Val）的信号荧光水平较低（图2C、D）。在小脑体（CCe）中也能观察到 Vam 处强烈的 mSYT4-ir 信号（图2C-H），尤其是在分子层（ML）（图2E-H）。这表明 syt4 基因在成年斑马鱼脑中的高表达区域可能位于小脑，这一特征与哺乳动物中的情况一致。结合文献可知，syt4 基因在硬骨鱼和哺乳动物中的表达模式具有保守性：在幼体阶段，该基因在中枢神经系统的大部分区域均有丰富表达；而在成体阶段，其表达则主要集中于小脑。

图2. SYT4在成年斑马鱼的小脑中主要表达。每个切片（A-H）的对应位置已在（I）中标出。视顶盖：顶盖；纵隆起：纵隆起；垂体：垂体；小脑瓣外侧部：小脑瓣外侧部；小脑瓣内侧部：小脑瓣内侧部；小脑体：小脑体；颗粒隆起：颗粒隆起；小脑尾叶：小脑尾叶。绿色代表 mSYT4-ir信号。

 mSYT4-ir 阳性信号主要定位于γ-氨基丁酸能神经元

在啮齿类动物和鸟类中，Syt4 基因被认为在小脑的浦肯野细胞（一种γ-氨基丁酸能神经元）中表达。我们进一步探究了两个问题：（1）斑马鱼 syt4 基因是否在γ-氨基丁酸能神经元中表达；（2）在成年斑马鱼脑中，该基因是否主要在γ-氨基丁酸能神经元中表达。我们设计了三组实验，使用两种分别带有γ-氨基丁酸能和谷氨酸能神经元特异性报告基因的转基因斑马鱼品系，并结合胆碱能神经元标志物抗体来解答上述问题。

首先，我们旨在确认mSYT4免疫反应性信号在gad1a转基因品系Tg(gad1a: GFP)的γ-氨基丁酸能神经元中的定位。根据文献记载，gad1a主要在小脑分子层（ML）的浦肯野细胞和星状细胞中表达。结果显示，mSYT4免疫反应性信号在腹侧视顶盖（Vam）和小脑瓣（CCe）的γ-氨基丁酸能神经元中富集并共定位（图3A-C）。在腹侧视顶盖中，mSYT4免疫反应性信号出现在γ-氨基丁酸能神经元的胞体（主要为细胞质）和树突中（图4A、B）。在小脑瓣中，我们在分子层的γ-氨基丁酸能神经元中观察到了mSYT4免疫反应性信号，但在颗粒细胞层（GCL）中未观察到（图4C-E）。具体而言，我们在分子层基底层的胞体中观察到了mSYT4免疫反应性信号，该基底层被认为是浦肯野细胞层（PCL）（图4F）。在分子层腹侧区域，树突中可见强烈的mSYT4免疫反应性信号（图4G）。与啮齿动物类似，我们也在神经元中观察到了mSYT4免疫反应性信号的精细颗粒状分布模式。结合小脑多数区域（包括腹侧视顶盖和小脑瓣）中mSYT4免疫反应性阳性细胞的形态，这些细胞大概率为浦肯野细胞。通过使用另一厂家的人SYT4抗体，进一步证实了γ-氨基丁酸能神经元中存在mSYT4免疫反应性阳性信号（补充图6）。值得注意的是，我们未在小脑的颗粒隆起（图2G中标注为EG）以及尾叶（图2H中标注为LCa）的相关浦肯野细胞中观察到mSYT4免疫反应性阳性信号。

图3. SYT4 特异性定位于成年斑马鱼的γ-氨基丁酸能神经元。(A) 小脑瓣内侧部（Vam）中 mSYT4 免疫反应信号（红色）与谷氨酸脱羧酶（GAD，γ-氨基丁酸能神经元标志物，绿色）的共定位情况。(B) 分子层（ML）和小脑瓣内侧部（Vam）中 SYT4 与 GAD 的共定位情况。(C) 分子层（ML）中 mSYT4 免疫反应信号与 GAD 的共定位情况。左侧脑部示意图的矢状视图中标注了切片的相对位置（红色为小脑的分子层 ML）。Vam：小脑瓣内侧部；ML：分子层；GCL：颗粒细胞层。

图4. 成年小脑不同区域胞体和树突中GAD（绿色）与mSYT4免疫反应信号（红色）的共定位情况。(A和B) 前庭内侧核（Vam）中的GAD与mSYT4免疫反应信号。(C–E) 小脑蚓部（CCe）中的GAD与SYT4信号。信号仅出现在分子层（ML）的胞体和树突中，而未在颗粒细胞层（GCL）中观察到。(F和G) 分子层（ML）中的GAD与mSYT4免疫反应信号。分子层的基底层为浦肯野细胞层（PCL），箭头所示。左侧大脑示意图的矢状视图中标注了切片的相对位置（红色为小脑中的分子层）。

为回答斑马鱼syt4是否主要在GABA能神经元中表达这第二个问题，我们旨在观察谷氨酸能神经元和胆碱能神经元中的mSYT4-ir信号。本研究使用了vglut2a报告品系(Tg(vglut2a:GFP))，该研究人员在小脑瓣（CCe）的颗粒细胞层（GCL）的谷氨酸能神经元中特异性表达了绿色荧光蛋白（GFP）。结果显示，突触结合蛋白4免疫反应（mSYT4-ir）信号在小脑瓣（CCe）和瓣叶（Vam）的分子层（ML）中富集，而来自囊泡谷氨酸转运体2a（vglut2a）报告基因的绿色荧光蛋白（GFP）阳性信号出现在颗粒细胞层（GCL）中，在分子层（ML）中未检测到（图5A-C）。由此我们得出结论，斑马鱼的突触结合蛋白4（syt4）基因不在谷氨酸能神经元中表达。

通过对胆碱乙酰转移酶（ChAT）和哺乳动物SYT4抗体进行双重染色，未观察到两种抗体在胆碱能神经元中共定位（图6A-C）。具体而言，mSYT4免疫反应性信号与NIII中的胆碱能神经元未发生共定位（图6D）。

我们得出结论，与啮齿动物的情况一致，代表斑马鱼syt4基因表达的mSYT4免疫反应性信号在后脑小脑结构的GABA能神经元中具有保守性且具有特异性。该表达主要局限于小脑瓣的分子层和小脑 corpuscle 分子层，这些区域的细胞很可能是浦肯野细胞。此外，在我们检测的脑部结构中，谷氨酸能神经元或胆碱能神经元中均未检测到斑马鱼syt4基因的表达。

图5. 未在小脑中观察到Vglut（谷氨酸能神经元）与SYT4共定位。（A–C）小脑中ChAT和mSYT4免疫反应信号的概览。Vglut强信号出现在颗粒细胞层（GCL），如箭头所示。切片的相对位置在左侧脑部示意图的矢状视图中标出（红色表示小脑的分子层）。Vam：小脑瓣内侧部；CCe：小脑体；ML：分子层；GCL：颗粒细胞层。

图6. 小脑内未观察到胆碱乙酰转移酶（胆碱能神经元）与突触结合蛋白4的共定位。（A-C）小脑内胆碱乙酰转移酶与膜结合型突触结合蛋白4免疫反应信号的整体视图。（D）动眼神经核（第三脑神经核）内胆碱乙酰转移酶与突触结合蛋白4的信号。左侧脑部示意图的矢状视图中标注了切片的相对位置（红色表示小脑的分子层）。Valvula cerebelli 内侧部：小脑瓣内侧部；小脑体：小脑皮质体部；分子层：分子层；颗粒细胞层：颗粒细胞层。

 SYT4 不在成年大脑的催产素神经元中表达

研究表明，小鼠下丘脑的催产素神经元中大量表达SYT4。研究人员提出，Syt4通过增强SYT4与囊泡的结合，对催产素的胞吐作用产生负调控，进而加强对催产素释放的负向调控。然而，我们在斑马鱼的下丘脑中未检测到SYT4的表达，也未观察到mSYT4免疫反应信号与催产素神经元的共定位现象（补充图8）。 

讨论

本研究假设斑马鱼中的syt4与哺乳动物的Syt4具有保守性和同源性，即斑马鱼大脑中syt4的序列与表达模式应与文献中报道的其他脊椎动物物种同源。我们首先证实，斑马鱼基因组中仅有一个syt4拷贝，且该拷贝与人类和啮齿动物的SYT4及Syt4为直系同源基因。研究还发现，斑马鱼syt4的钙结合位点突变具有保守性。在表达模式方面，斑马鱼syt4与啮齿动物表现出相同模式：在成年斑马鱼体内，该基因主要局限于γ-氨基丁酸能神经元中表达，而在小脑的谷氨酸能神经元和胆碱能神经元中均无表达。

根据相关文献，SYT4 的某些基本分子功能在果蝇和啮齿动物之间存在差异，包括钙结合能力和突触后逆行信号。尽管本研究未评估这些分子功能，但我们旨在通过揭示syt4在斑马鱼中的表达模式来提供一些见解。从我们的观察来看，我们认为其表达模式在脊椎动物物种中是保守的，这表明在果蝇中观察到的分化情况脊椎动物的共同祖先中可能存在其他无脊椎动物谱系。不过，未来需要开展进一步的研究和实验来验证这一假设，并探究其分子功能是否与保守的表达模式相符。

与在大鼠整个生命周期内于大脑大部分区域均有表达的Syt1不同，Syt4主要在成年大鼠的多个脑区表达。它仅在发育早期普遍表达，成年后则主要在小脑、下丘脑、海马体和垂体等多个结构中表达，其中在大鼠小脑中的表达最为显著。与文献研究结果一致，我们发现syt4主要在成年斑马鱼的小脑多个结构中表达。然而，我们并未在哺乳动物中观察到的神经内分泌结构（即催产素神经元）中检测到可靠的信号信号。尽管在啮齿动物的神经内分泌系统中能检测到Syt4的表达，但与发育早期以及成年啮齿动物的小脑相比，这些结构中Syt4的表达水平相对较低。此外，有研究表明，海人酸诱导的癫痫可诱导啮齿动物海马细胞中Syt4的表达。因此，我们无法排除syt4在这些结构中不表达的可能性，或者其仅维持低水平表达并在特定刺激下被激活的可能。

从文献中可知，Syt4 在下丘脑的催产素神经元中大量表达。作者推测，Syt4 通过增强囊泡与 SYT4 的结合，对催产素的胞吐作用产生下调效应，从而强化对催产素释放的抑制性调节。然而，我们并未在小细胞性视前核后部（PPp）的催产素神经元中观察到 mSYT4-ir 信号的共定位（补充图 8）。这可能意味着 syt4 在斑马鱼催产素神经元中具有不同的功能。未来还需开展进一步研究，以阐明该基因在脊椎动物中尚未解决的问题。

在哺乳动物中，小脑负责调节运动功能和学习行为，而这一功能在斑马鱼等硬骨鱼中也具有保守性。小鼠小脑缺失Syt4会导致运动控制缺陷、被动回避行为紊乱，同时焦虑和抑郁样行为有所减少。这些研究结果凸显了该基因在小脑功能中发挥的关键作用。

在大鼠小脑中，研究发现Syt4在浦肯野细胞中大量表达，浦肯野细胞是一类γ-氨基丁酸能神经元。研究人员还在鸣禽（斑胸草雀）中发现了相同的表达模式。在这两个物种中，Syt4的表达分别可由海藻酸诱导的癫痫发作和鸣叫行为诱导。我们证实，成年斑马鱼的GABA能神经元中存在syt4表达，且主要分布在小脑区域，包括Val的ML层以及CCe区域。斑马鱼的小脑Val、Vam和CCe区域均存在浦肯野细胞。近期，科学家发现斑马鱼小脑中的浦肯野神经元可能具有不同的生理功能和形态。研究人员发现三种不同类型的浦肯野神经元对不同离子（钠或钙）的响应具有不同的刺激谱，且形态也各不相同。尽管我们无法阐明斑马鱼中哪种亚型的浦肯野神经元表达syt4，但我们可基于果蝇和啮齿动物的相关研究，假设syt4在响应钙刺激的神经元亚型中表达。不过，仍需开展进一步研究，证实斑马鱼syt4在浦肯野细胞中的表达情况，以解答这一问题。

除了与γ-氨基丁酸能神经元共定位外，我们还在腹侧下丘脑核（Vam）的一群细胞中观察到了mSYT4免疫反应性信号，这些细胞并非谷氨酸能或胆碱能神经元（补充图7，箭头所示）。已有研究发现，在啮齿类动物中，Syt4在星形胶质细胞（神经胶质细胞的一种亚型）中表达。星形胶质细胞中Syt4的减少会降低钙依赖性谷氨酸释放，这是调控突触传递的神经胶质递质释放通路。这为我们提供了一个未来研究方向，即我们可以探究斑马鱼大脑的神经胶质细胞中是否存在SYT4的表达。

正如我们所明确的，结果部分仅纳入了在不同染色重复实验中均能稳定观察到信号的区域。然而，在我们的图中，某些区域可能会被误判为阳性信号，例如图2B端脑的脑室区和视顶盖表层，以及图2C中的背侧丘脑核。我们在额外的染色结果中以更高放大倍数对这些信号进行了仔细检查，以确认其有效性。研究发现，图2B和2C中视顶盖和背侧丘脑核处观察到的信号可能为背景信号，因为在更高放大倍数下，它们并非真实的信号（补充图9A和9B）。

最后，我们想分享另一种抗SYT4抗体的使用经验。我们还测试了Sigma-Aldrich公司的一款抗体（货号HP010574）。然而，在多次重复染色实验中均未检测到经验证的信号。这种信号缺失可能是由于该抗体克隆子对应的区域与斑马鱼中对应区域存在较大的序列差异所致。 

结论

我们发现斑马鱼基因组中的syt4基因是啮齿动物Syt4基因以及人类SYT4基因的直系同源基因。此外，SYT4的表达模式在脊椎动物成体大脑中具有保守性：它在小脑的γ-氨基丁酸能神经元中表达量最高。我们得出结论，斑马鱼中的syt4基因可作为研究人类SYT4基因的模型。

材料与方法

从数据库中获取SYT序列及系统发育分析

氨基酸序列和编码核苷酸序列均从Ensembl数据库获取（https://asia.ensembl.org/index.html，数据于2020年7月获取）。从鲤（Cyprinus carpio）、攀鲈（Anabas testudineus）、金鱼（Carassius auratus）、眼斑双锯鱼（Amphiprion ocellaris）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）、八齿鼠（Octodon degus）、金黄地鼠（Mesocricetus auratus）、豚鼠（Cavia porcellus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、大猩猩（Gorilla gorilla）、猕猴（Macaca mulatta）、橄榄狒狒（Papio anubis）和红毛猩猩（Pongo abelii）等多种脊椎动物物种中获取了人类SYT4同源物的序列。syt4及其同源物的集合编号列于补充表1中。若在数据库中发现多个转录本，则选取最长的编码序列及其对应的氨基酸序列进行分析。

基于序列获取基因组，利用MEGA-X软件并采用MUSCLE算法，分别对氨基酸序列和核苷酸序列进行比对。比对完成后去除空位，分别分析每个氨基酸和核苷酸序列的序列获取基因组，以确定平均距离。使用MEGA-X的“选择最佳DNA/蛋白质模型（最大似然法）”功能挑选最优模型，并针对每个基因组的氨基酸和核苷酸序列，分别采用最大似然法（ML）构建一棵系统发育树，同时采用最大简约法（MP）构建另一棵系统发育树。

动物

斑马鱼（Danio rerio）饲养于28摄氏度的自来水中，置于14小时光照/10小时黑暗的光周期环境中。每日监测水质。用于研究γ-氨基丁酸能神经元和谷氨酸能神经元的转基因鱼系分别为Tg(Gad1b:GFP) 和Tg(Vglut2a:GFP)品系。转基因鱼系与野生型鱼在相同条件下饲养。所有实验流程均遵循IACUC协议NTU-110-EL-00141。

免疫组织化学的脑组织切片制备

将鱼置于250毫克/升的MS-222（西格玛-奥德里奇公司）中麻醉。用林格氏液进行心脏灌注，直至循环血液被冲净、鳃部变得透明。灌注完成后，将鱼斩首，包含头骨和脑部的整个头部在4%多聚甲醛（PFA）中固定两天。通过小心去除头骨解剖出鱼脑，将其包埋在磷酸盐缓冲盐水（PBS）配制的1%琼脂糖中，随后使用振动切片机将其冠状切成50微米的切片。切片在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中保存，以待后续实验。

免疫荧光（IF）实验

将切片在室温下用 PBST（含 0.1% 吐温 20 的磷酸盐缓冲液）洗涤 10 分钟，共洗涤三次。将切片在含 1% 封闭试剂（罗氏公司）的 PBST 中于室温孵育 2 小时。封闭处理后，将切片分别在含 1% 封闭试剂的 PBST 配制的一抗中于 4℃ 孵育 8 小时（过夜）。随后将切片在室温下用 PBST 洗涤 10 分钟，共洗涤三次。将切片在室温下与二抗孵育 2 小时。将切片在 PBST 中按 1:10,000 稀释的 DAPI（西格玛-奥德里奇公司产品）中于室温孵育 20 分钟。DAPI 染色后，将切片在室温下用 PBS 洗涤 5 分钟，共洗涤三次，最后保存于 75% 甘油中。

本研究使用的一抗如下：针对SYT4的兔多克隆抗体（Synaptic Systems公司，货号105,143，来源于大鼠SYT4的肽段序列），稀释比例1:100（大部分实验结果均使用该抗体）；针对SYT4的兔多克隆抗体（ABclonal公司，货号A7737，来源于人SYT4的肽段序列），稀释比例1:100（用于补充图6的验证实验）；针对ChAT的山羊多克隆抗体（Sigma-Aldrich公司，货号AB144P），稀释比例1:250。使用抗GFP抗体（Cell Signaling公司，小鼠抗GFP单克隆抗体，货号4B10，产品编号2955 S），稀释比例1:1000，用于扩增Tg(Gad1b:GFP)和Tg(Vglut2a:GFP)转基因斑马鱼品系中的GFP信号。使用抗催产素抗体（Peninsula Laboratories International, Inc.公司，豚鼠抗催产素抗体，货号T-5021），稀释比例1:500。本研究使用的二抗包括：山羊抗兔Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific公司，货号A-11008），稀释比例1:500；山羊抗兔Alexa Fluor 594（Thermo Fisher Scientific公司，货号A-11012），稀释比例1:500；山羊抗豚鼠Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific公司，货号A-11073），稀释比例1:500。

原位杂交

有关原位杂交的详细信息请参见补充材料与方法。

成像分析

使用75%的甘油作为封片液将脑切片固定在显微镜载玻片上。荧光显微镜图像是通过蔡司 Axioskop 显微镜和 iNS-EDF 软件获取的。共聚焦显微镜图像通过徕卡 SP8 或尼康 ECLIPSE Ti 显微镜获取。使用 Fiji（ImageJ）软件对图像进行处理和分层。所描述的斑马鱼脑区的拓扑结构和命名遵循《斑马鱼脑神经解剖学：拓扑图谱》。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。