题目：Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37453064/

期刊：Cell Reports

研究亮点

l 对mpeg1.1阳性细胞进行单细胞RNA测序，揭示出斑马鱼体内的多种免疫细胞群

l 研究人员鉴定出了促炎性和促重塑巨噬细胞

l 保守性常规树突状细胞、浆细胞样树突状细胞以及脑特异性常规树突状细胞得以明确界定

l 研究人员构建了巨噬细胞和树突状细胞亚群的特异性报告基因系

摘要

组织驻留巨噬细胞（TRMs）和树突状细胞（DCs）具有高度异质性，对免疫、组织再生和稳态维持至关重要。本研究通过单细胞RNA测序，全面分析了成年斑马鱼各器官中组织驻留巨噬细胞和树突状细胞的异质性。研究鉴定出两类巨噬细胞亚群：在屏障组织、肝脏和心脏中，一类是具有强效吞噬特征的促炎巨噬细胞，另一类是具有组织再生特征的促重塑巨噬细胞。同时，在这些器官中还发现了一类抗原呈递能力突出的常规树突状细胞（cDC）群，以及以抗病毒特性为特征的浆细胞样树突状细胞（pDCs）。值得注意的是，除了一类具有强效吞噬能力的巨噬细胞/小胶质细胞单一群外，大脑中还鉴定出一类浆细胞样树突状细胞和两类不同的常规树突状细胞。最后，本研究构建了可在体内追踪巨噬细胞和树突状细胞亚群的特异性报告基因系。本研究描绘了组织驻留巨噬细胞和树突状细胞的整体特征，并为深入研究斑马鱼中这些细胞提供了宝贵工具。

图形摘要

引言

组织驻留巨噬细胞（TRMs）和树突状细胞（DCs）是先天免疫系统的关键组成部分，它们在免疫、组织发育、组织稳态和组织修复中发挥着至关重要的作用。人们认为，TRMs 和 DCs 的多种功能主要是由这些细胞的异质性所贡献。最近单细胞分辨率转录组和蛋白质组分析技术的发展，为哺乳动物中肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞的异质性组成提供了前所未有的见解，而具有独特起源、形态、分布和功能的特化肿瘤相关巨噬细胞与树突状细胞亚群也同样已被鉴定。

组织驻留巨噬细胞（TRMs）是负责清除病原体和细胞碎片的主要吞噬细胞。 除了作为专职吞噬细胞发挥作用外，组织驻留巨噬细胞还在调控固有免疫和适应性免疫以及组织重塑方面发挥重要功能。在哺乳动物中，研究表明组织驻留巨噬细胞是高度异质性的群体，起源于多种造血来源，并受保守的细胞因子受体——集落刺激因子1受体（CSF1R）调控。在归巢至定居组织后，它们会根据微环境特异性信号进一步分化，使新定植的前体细胞发育为特化的组织驻留记忆T细胞（TRMs），以满足不同组织的功能需求。此外，组织驻留记忆T细胞还展现出显著的可塑性，能够响应环境波动做出动态适应性调整。例如，研究表明活化的巨噬细胞会根据外部刺激信号，极化为促炎性M1型巨噬细胞或具有组织重塑功能的抗炎性M2型巨噬细胞。尽管这种二分法可能过于简化，无法反映复杂环境中巨噬细胞多样表型的完整谱系，但这一M1/M2分类体系仍能有效表征参与炎症不同阶段的组织驻留记忆T细胞的两种相反极端功能。事实上，近期针对小鼠的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和命运图谱分析发现，多个转录特征不同的组织驻留记忆T细胞亚群共存于不同器官中，进一步证实了稳态条件下组织驻留记忆T细胞存在不同亚群。然而，这些巨噬细胞亚群究竟是发育过程中形成的独特谱系，还是处于不同状态的同一类细胞，目前仍有待进一步探究。由特定外部信号诱导的功能状态及其形成的分子基础在很大程度上仍未明确。

在哺乳动物中，树突细胞（DCs）通常分为两大类：常规树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs），这两类细胞的发育和存活均依赖于Fms样酪氨酸激酶3（FLT3）。常规树突状细胞是专职抗原呈递细胞，高表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子，还可进一步根据表型和功能分为两个亚群不同的亚群，即cDC1和cDC2。 cDC1以其独特的交叉呈递能力而著称它们具有卓越且独特的交叉呈递能力，可诱导CD8+ T细胞应答并促进T辅助1型（Th1）细胞极化，而经典树突状细胞2型（cDC2s）则优先启动Th2和Th17细胞的分化。与经典树突状细胞（cDCs）不同，浆细胞样树突状细胞（pDCs）的MHC II类分子表达水平较低，且高度富集内体核酸敏感性Toll样受体（TLRs）TLR7和TLR9，这些受体可识别核酸抗原并介导在病毒感染期间产生I型干扰素。20尽管人们对其功能已有广泛了解，但常规树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）的谱系特化仍不明确。事实上，常规树突状细胞（cDCs）在发育上与单核细胞相关，而有研究表明浆细胞样树突状细胞（pDCs）可源自髓系细胞和淋巴前体细胞。因此，一套全面且需要开展一项深入的研究来阐明不同树突状细胞亚群的个体发育过程。

由于斑马鱼具有保守的造血程序，且可利用多种遗传工具和命运图谱分析策略，它成为研究造血细胞（包括组织驻留巨噬细胞和树突状细胞）个体发育的优秀模型系统。尽管研究人员已通过多种报告基因系和缺陷系对斑马鱼巨噬细胞进行了广泛研究，但斑马鱼中组织驻留巨噬细胞的异质性以及树突状细胞的生物学特性仍知之甚少。因此，要深入探究斑马鱼中这些免疫细胞的发育与功能，就需要全面解析组织驻留巨噬细胞和树突状细胞的异质性，并构建细胞类型特异性的报告基因系。

本研究利用无偏单细胞RNA测序解析了成年斑马鱼中组织驻留记忆T细胞（TRMs）和树突状细胞（DCs）的异质性。我们鉴定了不同器官中多种功能保守的TRM和DC亚群，并基于这些独特亚群的特异性标志物构建了巨噬细胞和DC特异性报告基因品系。本研究加深了对斑马鱼TRM和DC的认知，为这些细胞的进一步发育和功能研究提供了有价值的工具。 

结果

单细胞RNA测序揭示成年斑马鱼中不同的mpeg1.1+免疫细胞类型

为系统评估成年斑马鱼中组织驻留巨噬细胞（TRMs）和树突状细胞（DCs）的异质性，我们对6月龄Tg(mpeg1.1:DsRedx)斑马鱼（图1A，这是一种广泛使用的髓系细胞报告细胞系）中从六种不同器官（包括三种屏障组织：表皮、鳃、肠道，以及三种内部器官：肝脏、心脏和大脑）分选得到的mpeg1.1+细胞进行了基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）。经过严格的质控过滤并进一步排除受污染的mpeg1.1-细胞后，我们对每个器官中的高质量mpeg1.1+细胞分别进行了无监督聚类（表皮：2832个；鳃：3711个；肠道：3286个；肝脏：3248个；心脏：3679个；大脑：2842个），并鉴定出8个转录上具有差异的细胞群（图1B-D；表S1）。

与预期一致，在所有分析的器官中均鉴定出了巨噬细胞和树突状细胞。巨噬细胞（MPs）是根据 csf1ra、12 型胶原结构巨噬细胞受体（marco）以及微原纤维相关蛋白 4（mfap4）的表达来定义的，而树突状细胞则通过 flt3 以及富含 SPARC（骨连蛋白）、cwcv 和 kazal 样结构域的蛋白聚糖 3（spock3）来识别。（图1B、1C及图S1）。除这两种经典髓系细胞群外，我们还在三种屏障组织中鉴定出了上皮来源的间质细胞（Metas）（((ii22ra2+ ptprc ^{-}))），但在其他内脏器官中未检测到（图1B、1C及图S1），这与我们此前的研究结果一致，即间质细胞是产生白介素-22结合蛋白（IL-22BP）的髓系样细胞，参与黏膜免疫过程29-31。此外，我们还在多种器官中发现了部分淋巴样细胞群，包括以免疫球蛋白基因igl4v8和igic1s1为特征的B细胞，以及以NK基因nkl.3和nkl.4为特征的自然杀伤（NK）样细胞（图1B、1C及图S1），这与近期研究结果相符，即Tg(mpeg1.1:DsRedx)转基因斑马鱼该报告细胞系可标记成年斑马鱼中的某些淋巴样细胞。

除了这些定义明确的细胞群外，研究还发现了一个富含核糖体蛋白基因的翻译簇和一个高表达细胞周期相关基因的循环簇（图1B、图1C及图S1）。有趣的是，这两个簇也表达巨噬细胞和树突状细胞的特征基因，尽管表达水平相对较低，这表明它们可能代表巨噬细胞和树突状细胞的某些特定发育阶段或功能状态。最后，在鳃、肠道和肝脏中还鉴定出了一个此前未被发现的高表达白介素6受体（il6r+）细胞群（图1B、图1C），但该细胞群的本质仍不明确。综上，我们的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据揭示了Tg（mpeg1.1： DsRedx）记者线标记八个不同的细胞群体，包括三个单核髓样细胞群体（巨噬细胞、DC和隐身细胞）、两种淋巴细胞类型（B和NK样[NKL]）和一个(il6r+)群体，以及翻译和循环集群。由于翻译和循环集群可能代表巨噬细胞和DC的特定发育阶段或功能状态，我们只关注其他六个细胞群体。

图 1. 利用单细胞 RNA 测序（scRNAseq）无偏倚鉴定出由 Tg（mpeg1.1:DsRedx）标记的八种细胞群。(A) 对取自 6 月龄 Tg (mpeg1.1:DsRedx) 转基因鱼 6 种器官的 mpeg1.1⁺细胞开展单细胞 RNA 测序（10× Genomics）的流程示意图。图片由BioRender.com生成。(B) 各个器官中 mpeg1.1⁺细胞的均匀流形逼近与投影（UMAP）可视化图。(C) 小提琴图，展示 6 种器官内 mpeg1.1⁺细胞群中部分标记基因的相对表达水平。增殖细胞簇依据细胞周期得分进行鉴定；该得分通过 Seurat 包的 “PercentageFeatureSet” 函数计算得到，代表每个细胞中比对到细胞周期相关基因（包括 pbk、birc5a、mki67、ube2c、top2a、tk1、aurkb、cdkn3、cenpf、cdk1、pcna 以及 tubb2b）的转录本占比 ²⁸。(D) 柱状图，展示各个器官中 mpeg1.1⁺细胞群的相对丰度。缩写： MP，巨噬细胞；DC，树突状细胞；Meta，变形吞噬细胞；NKL，NK 样细胞。另见图 S1 与表 S1

mpeg1.1+免疫细胞群在器官中高度保守

接下来，我们通过结合MPEG1。(1^{+})来自所有器官的群体进行比较分析。Pearson相关性分析显示，来自不同器官的相同细胞群体通常高度相关（图2A）。这些群体的总体跨器官相似性表明，每个细胞群都有一个核心转录组签名，该签名定义了其身份并赋予跨器官的专门功能。

为了定义不同细胞类型的核心转录组特征，我们在包括所有器官的这些人群中进行了差异表达基因（DEG）分析（表S2）。正如预期的那样，巨噬细胞高度富集与吞噬相关的基因，包括多种吞噬受体（Fc受体[fcer1gl]，清道夫受体[例如scarb2a、lgals3bpa、lgals3bpb、marco]以及磷脂酰丝氨酸受体[havcr1])、补体成分C1q(例如c1qa、c1qb、c1qc)和溶酶体活性相关基因(组织蛋白酶、lgmn、tpp1、man2b1、hexb、npc1)³⁴(图2B)。另一方面，树突状细胞群体中富集的基因为模式识别受体(例如tlr3、tlr7)和MHCⅡ类抗原呈递分子(例如mhc2dab、mhc2a、cd74b、cd40和cd83)(图2B)，这两类基因均是参与抗原识别和抗感染的关键分子抗原呈递以启动适应性免疫反应。5除了表型和功能标志性基因外，所有器官中的巨噬细胞和树突状细胞（DC）群体还表现出谱系特异性转录因子（TFs）的保守表达，例如巨噬细胞中的cebpa和mafbb，以及树突状细胞中的id2a和znf366（DC-SCRIPT）（图2C）；这些都是研究充分的调控因子，对巨噬细胞和树突状细胞的发育至关重要。跨物种。19,35,36 这些数据表明斑马鱼巨噬细胞巨噬细胞和树突状细胞与哺乳动物的巨噬细胞和树突状细胞具有保守的个体发育过程和功能。

对于间质样细胞，我们观察到它们富集了与黏着连接（如cdh1、ctnna1）和紧密连接（如cldnh、cldnb、oclna、tjp3）相关的基因（图2B），这与其通过跨上皮突起摄取外部可溶性抗原的独特功能相符此外，间质样细胞还表达一组独特的转录因子，包括spic、 prox1a和pou2f3（图2C）。所有器官中的B细胞群体均富集了免疫球蛋白基因（如igl4v8、ighv1-4、igic1s1、ighz）以及与B细胞受体信号传导相关的基因（如cd79a、cd79b）（图2B），而NKL细胞群的特征则是表达NK溶素（nkl.1、nkl.3、nkl.4）、T细胞定向基因il7r、白介素2受体（il2rb、il2rga、il2rgb）以及趋化因子受体（ccr2、ccr2.1、s1pr5a）（图2B），这些均为已知的信号分子。哺乳动物自然杀伤细胞的特征基因。 正如预期的那样，B细胞高表达B细胞发育的主转录因子Pax5，40 而NKL细胞中富集多种先天淋巴样细胞相关转录因子，如Gata3、Tbx21（也称为T-bet）、Prdm1b（哺乳动物同源物：Hobit）、Tox2以及Nfil3-4(图2C)。

最后，对于此前未被充分研究的il6r+细胞群，除了富集IL-6信号通路相关基因（il6r、il6st、sorl1）外，它们还高表达新型免疫型受体9（nitr9）和免疫相关的凝集素样受体4（illr4）（图2B）。据报道，这两种受体均为哺乳动物自然杀伤（NK）细胞受体的功能性同源物，这表明斑马鱼(il6r)细胞可能与NK细胞存在功能关联。有趣的是，il6r+细胞还高表达mafba和zeb2a这两种对巨噬细胞发育至关生要的经典转录因子（图2C）的表达水平显著升高，这表明这些细胞与巨噬细胞存在潜在的谱系关联。

综合来看，这些数据明确了斑马鱼不同器官中六种mpeg1.1+免疫细胞群的核心转录组特征，并揭示了可能参与其发育的谱系特异性转录因子。

图2. mpeg1的跨器官评估(1'')人群。（A）皮尔逊相关性分析mpeg1的平均基因表达水平。(1^{+})跨六个器官的人群。相关性的强度由色标描述，最高相关性以红色显示。（B）热图显示每个mpeg1的特征基因的相对表达水平。跨器官的(1^{+})人群。热图显示跨器官的mpeg1.1+人群中突出显示的转录因子的相对表达水平。另见表S2。

屏障组织、肝脏和心脏中存在两种功能不同的巨噬细胞亚群

为进一步表征巨噬细胞的异质性组成，我们提取了来自所有器官的巨噬细胞群，并以更高的分辨率进行了重新聚类（图3A）。由于脑内驻留巨噬细胞小胶质细胞的转录组谱与屏障组织、肝脏和心脏中的巨噬细胞相对不同（图2A），我们分别讨论了外周巨噬细胞和小胶质细胞。

经过优化的无偏聚类分析揭示了两种不同的巨噬细胞亚群，即lgals3bpb+巨噬细胞和ccl34a.4+巨噬细胞，它们在屏障组织、肝脏和心脏中具有不同的分布模式（图3A-3C；表S3）。lgals3bpb+巨噬细胞高表达半乳糖凝集素3结合蛋白b（lgals3bpb）、脂肪酸结合蛋白7b（fabp7b）和微管蛋白聚合促进蛋白（tppp），是屏障组织中的主要巨噬细胞群（图3B、3C）。另一方面，ccl34a.4+巨噬细胞以C-C基序趋化因子配体34a.4（ccl34a.4）和C型甘露糖受体1b（mrc1b）的表达为特征（图3B）。与lgals3bpb+巨噬细胞不同，ccl34a.4+巨噬细胞分别构成了肝脏中的主要巨噬细胞群和心脏中唯一的巨噬细胞群（图3A、3C）。lgals3bpb+和ccl34a.4+巨噬细胞在不同器官中的独特分布模式表明，这两种巨噬细胞群的形成在很大程度上受所处微环境的影响。

为预测两种巨噬细胞亚群可能的功能特征，我们对这两种巨噬细胞亚群之间的差异表达基因进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果显示，lgals3bpb+ 巨噬细胞高表达与吞噬作用相关的基因（lgasl3bpa、lgals3bpb、lgals9l1、lgals9l3）以及溶酶体生物发生和活性相关基因（ctsa、ctsc、hexb、lgmn、man2b1 和 fth1a）（图3D和3E），表明其具有强大的吞噬能力。此外，它们还富集了炎症趋化因子（cxcl8a 和 cxcl19）的表达以及其他炎症相关基因，包括参与ATP代谢和蛋白质分解代谢过程的基因（fuca1.1、amdhd2、galcb、mdhd2、gnpda1）和抗原呈递相关基因（mhc2dab、cd74b和lgmn）（图3D和图3E），这表明这些细胞具有促炎能力。这些数据表明，lgals3bpb+巨噬细胞表现出促炎作用，且具有更强的吞噬作用和免疫细胞募集能力。因此，我们将lgals3bpb+巨噬细胞群定义为促炎性巨噬细胞。

另一方面，ccl34a.4+巨噬细胞最显著的特征是其广泛表达与组织重塑和再生相关的基因，包括与细胞生长和增殖相关的基因（如igf2b和hbegfa）、细胞外基质重塑相关的基因（如timp2b、timp4.3和tgfbi）、伤口愈合相关的基因（如plecb和f13a1b）以及免疫调节相关的基因（如cfp、ccl34a.4和ccl38.1）（图3D和3F）。除这些共同基因外，不同器官中的ccl34a.4+巨噬细胞还表达与组织稳态维持和修复相关的独特基因，例如表皮中的Wilms肿瘤1b（wt1b）和 Versican B（vcanb）⁴⁵、肠道中的血管内皮生长因子Aa（vegfaa）和促再生颗粒蛋白1（grn1）⁴⁶以及心脏中的基质金属肽酶14a（mmp14a）（图3D）。这些组织重塑特征表明，(ccl34a. 4^{+})巨噬细胞可能在正常器官发育和组织稳态维持中发挥关键作用，因此我们将ccl34a.4+巨噬细胞命名为促重塑巨噬细胞。同样值得注意的是，尽管与吞噬作用相关的基因表达水平较低，但ccl34a.4+促重塑巨噬细胞特异性表达某些吞噬受体，如清道夫受体lgals2a和scarf1以及甘露糖受体mrc1b（图3D），其哺乳动物同源物Mrc1（CD206）是公认的M2型巨噬细胞标志物。这表明促重塑巨噬细胞可能以类似抗炎性M2型巨噬细胞的免疫沉默方式发挥特定的吞噬功能，而非像lgals3bpb+促炎性巨噬细胞那样诱发炎症反应。

为探究这两巨噬细胞亚群之间的谱系关系，我们分析了它们差异表达的转录因子（TFs）。结果显示，这两个群体差异表达许多与巨噬细胞发育和功能特化相关的转录因子（图3G）。lgals3bpb⁺促炎巨噬细胞高表达runx3和prdm1b（图3G），已知这两种转录因子均参与巨噬细胞的发育和分化，而ccl34a.4+促重塑巨噬细胞的mef2cb、sox4b和mafba表达更为丰富（图3G）。这些观察结果表明，这两个功能不同的巨噬细胞亚群可能遵循不同的发育路径，受不同的遗传程序调控。

图 3. 不同器官中两种功能不同的巨噬细胞亚群的鉴定。(A) 各器官巨噬细胞（MP）亚群的 UMAP 降维可视化图。(B) 小提琴图，展示各器官巨噬细胞亚群中部分标记基因的相对表达水平。(C) 柱状图，展示各器官中巨噬细胞亚群的相对丰度。(D) 热图，展示跨不同器官巨噬细胞亚群核心特征基因的相对表达水平。(E、F) 基于表皮中lgals3bpb⁺巨噬细胞与ccl34a.4⁺巨噬细胞之间的差异表达基因（DEG），筛选得到的 GO/KEGG 富集条目。 (E) lgals3bpb⁺巨噬细胞中上调差异基因对应的 GO/KEGG 条目。 (F) ccl34a.4⁺巨噬细胞中上调差异基因对应的 GO/KEGG 条目。(G) 点图，展示不同器官内两种巨噬细胞亚群差异表达转录因子的相对表达水平。颜色代表基因标准化平均表达量；点大小代表表达该基因的细胞占比。另见表 S3。

斑马鱼中存在常规树突状细胞和浆细胞样树突状细胞

尽管大约十年前就在斑马鱼中鉴定出了具有抗原呈递潜能的髓系细胞， 但斑马鱼树突状细胞的异质性、分布、个体发生和功能在很大程度上仍未被探索。为了更好地理解这些问题，我们从每个器官中提取树突状细胞群并重新进行聚类分析。与哺乳动物一样，斑马鱼也包含两大类树突状细胞群体：经典树突状细胞具有与抗原呈递相关的基因特征（如mhc2dab、cd74a），而浆细胞样树突状细胞则根据其内体Toll样受体（tlr7.1和tlr9）的独特表达来定义（图S2A和S2B；表S4）。由于大脑中树突状细胞的组成与其他组织中的差异显著（图S2A），因此我们单独对大脑中的树突状细胞进行了讨论。

在屏障组织、肝脏和心脏中，检测到了一个主要的经典树突状细胞（cDC）亚群（图4）。斑马鱼的经典树突状细胞可通过其高表达ccl35（包括ccl35.1和ccl35.2）以及核受体4a2b（nr4a2b）来区分（图4A-4C）。除了富集抗原呈递相关基因（如mhc2dab、cd74a）（图4D、4E和图S2B）——这是哺乳动物经典树突状细胞的特征2,19外，(cc/35+)对应的经典树突状细胞还组成性表达多种促炎细胞因子，包括il1b、tnfa和il12bb（图4D）。这些发现表明，斑马鱼的经典树突状细胞可能发挥抗原呈递细胞的功能，并可能在免疫调控中发挥重要作用。值得注意的是，在鳃中还鉴定出了一小部分具有活化树突状细胞特征的ccl35+经典树突状细胞亚群（图S2C）。该亚群的经典树突状细胞表现出较低的MHC II类相关基因表达，但更高表达与细胞迁移相关的基因（趋化因子受体ccr7）以及T细胞活化相关的基因（共刺激因子cd40；白介素12：il12a、il12ba；转化生长因子β[TGF-β]：tgfb1a）（图S2D），这些正是经典树突状细胞活化后发生的典型转录变化5。活化样经典树突状细胞的存在进一步证实，斑马鱼经典树突状细胞与哺乳动物经典树突状细胞一样，在调控多种免疫反应中发挥着多方面的作用。

另一方面，斑马鱼浆细胞样树突状细胞（pDCs）会显著高表达组织蛋白酶Bb（ctsbb）和嘌呤能受体P2X 3a（p2rx3a）（图4B）。除了内体Toll样受体tlr7.1和tlr9的独特表达外（图4D、图S2B），作为哺乳动物浆细胞样树突状细胞的特征基因，它们还富含调控I型干扰素产生的干扰素调节因子（如irf3和irf7）（图4D、图4E），这表明其在抗病毒反应中具有特殊作用，而抗病毒反应是哺乳动物浆细胞样树突状细胞的重要功能。与哺乳动物浆细胞样树突状细胞呈现的淋巴样形态及可能的淋巴起源一致，斑马鱼浆细胞样树突状细胞也具备一定的淋巴样特征。与本研究中鉴定的其他淋巴样细胞群（B细胞和NKL细胞）类似，斑马鱼浆细胞样树突状细胞的mRNA含量较低（图S2E），并表达一系列淋巴样特异性转录因子（如id3、mef2b、mef2ca和tcf12），以及其他与淋巴细胞分化相关的特征基因（如il7r和kita）和迁移相关基因（如ccr9b、cxcr3.1.1和cxcr4a）（图4D、图4E）。

总体而言，这些结果表明斑马鱼在成年器官中拥有功能保守的常规树突状细胞和浆细胞样树突状细胞，它们构成了应对多种病原体入侵的有效免疫系统。

图4.屏障组织、肝脏和心脏中cDC和pDC的鉴定。（A）屏障组织、肝脏和心脏中两个DC亚群的UMAP可视化。（B）显示每个器官中两个DC亚群的选定标记基因的相对表达水平的小提琴图。（C）显示每个器官中两个DC亚群的相对丰度的巴特图。（D）显示跨器官DC亚群核心特征基因的相对表达水平的热图。（E）Metascape网络图显示基于cDC和pDC之间DEG的GO/KEGG术语的关系。每个点的大小表示为特定GO/KEGG术语识别的DEG数量，颜色表示p值。另见图S2和表S4。

吞噬性小胶质细胞和调节性树突状细胞存在于成年斑马鱼大脑中

我们的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析在成年斑马鱼大脑中鉴定出了单一的巨噬细胞群、小胶质细胞群以及不同的树突状细胞（DC）群，包括经典树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）（图5A）。尽管大脑中的浆细胞样树突状细胞（pDCs）具有相似的分子特征屏障组织、肝脏和心脏、小胶质细胞和cDC中的pDC群体显示出显著的脑印迹特征（图S3A）。

作为脑内驻留巨噬细胞，小胶质细胞在调控中枢神经系统的发育与功能方面发挥着关键作用神经系统（CNS）。我们的单细胞RNA测序分析显示，这些细胞特异性表达p2ry12、apoeb、apoc1、sall3a和sall3b（图5B），这些是小鼠和人类小胶质细胞的经典特征基因，36,50 这表明斑马鱼小胶质细胞的转录组具有进化保守性。虽然由于无法将小胶质细胞归为促炎或促重塑巨噬细胞，成年斑马鱼大脑中的小胶质细胞很可能同时具备这两类细胞的功能，因为它们会主动表达与吞噬作用和组织重塑相关的基因（图S3B）。

与仅有一种常规树突状细胞（cDC）群体的屏障组织、肝脏和心脏不同，大脑拥有两种转录上不同的cDC亚群，即占主导地位的cnn3a+ cDCs和数量较少的ccl35+ cDCs（图5C和5D；表S5）。整合的跨组织分析发现，大脑(cc/35)这一cDC亚群与在其他五个器官中鉴定出的常见(cc/35) cDCs更为相似（图5E）。与以MHC II类相关基因高表达为特征的ccl35+ cDCs相比，大脑特异性cnn3a+ cDCs表达一些具有区分性的哺乳动物cDC1标志物，包括xcr1a.1、hepacam2和batf3（图5F），这表明它们与ccl35+ cDCs可能存在功能和谱系上的差异。基因本体（GO）分析显示，大脑特异性cnn3a+ cDCs中富集的通路与肌动蛋白丝组装相关（如pfn1、cyth4a、wasa、wasb）（图5G和5H），这可能提示其具有分支形态和活跃的伪足延伸/收缩过程。此外，(cnn3a+) cDCs还表现出Hsp70/Hsp90伴侣蛋白（hsp70.1、hsp70.2、hsp70L和hsp90aa1.2）的更高表达（图5G和5H），已有研究报道在大脑中具有神经保护作用。52,53 这些观察研究表明，cnn3a+ 常规树突状细胞可能在大脑中发挥调节和神经保护作用。值得注意的是，我们之前的研究在成年斑马鱼脑实质中发现了一个ccl34b.1mpeg1.1+细胞群，该细胞群在形态和功能上与高表达ccl34b.1的常规小胶质细胞存在差异。转录组对比分析显示，此前研究中被称为调节性小胶质细胞的ccl34b.1mpeg1.1+细胞，其大部分免疫调节特征基因均为本研究鉴定出的两种脑常规树突状细胞群所表达（图5I和5J），这表明ccl34b.1mpeg1.1+细胞本质上是树突状细胞。这也解释了为何ccl34b.1mpeg1.1+细胞的形成不依赖于csf1ra——这是小胶质细胞发育的核心因子。和组织驻留巨噬细胞的发育与维持。

综上所述，我们对成年斑马鱼脑髓样细胞进行的单细胞分辨率转录组学分析显示，斑马鱼大脑中存在吞噬性小胶质细胞和调节性树突状细胞，这些细胞被深刻赋予了脑特异性特征，并在中枢神经系统中发挥特定功能。

图5.斑马鱼脑中吞噬小胶质细胞和调节性DC的表征基因的平均表达，大小表示表达这些基因的细胞的百分比。（A）大脑MPs和两个DC亚群的UMAP可视化。括号中表示每种细胞类型的百分比。（B）点图显示哺乳动物小胶质细胞特征基因在来自不同器官的斑马鱼MPs中的相对表达水平。颜色表示基因的标准化平均表达，大小表示表达这些基因的细胞的百分比。（C）大脑pDC和两个cDC亚群的UMAP可视化。括号中表示每种细胞类型的百分比。（D）小提琴图显示大脑DC亚群的标记基因的相对表达水平。（E）跨六个器官的cDC亚群的平均基因表达水平之间的Pearson相关性分析。相关性的强度由色标描绘，最高相关性以红色显示。（F）显示哺乳动物cDC特征基因在不同脑DC亚群中的相对表达水平的点图。颜色表示归一化的（G）Metascape网络图，显示脑特异性cnn3a+cDC中上调基因富集的GO/KEGG项与脑(ccl35)cDC的关系。每个点的大小表示特定GO/KEGG项鉴定的DEG数量，颜色表示p值。（H）显示脑特异性cnn3a+cDC核心特征基因的相对表达水平的热图。（I）显示脑MP和DC亚群中ccl34b.1的相对表达水平的特征图。（J）点图展示了ccl34b.1⁺吞噬性小胶质细胞（从ccl34b.1到fosab）和ccl34b.1⁺调节性小胶质细胞（从siglec15L到batf3）的特征基因在脑髓系细胞和树突状细胞亚群中的相对表达水平。颜色代表基因的标准化平均表达量，大小代表表达这些基因的细胞百分比。

为巨噬细胞和树突状细胞亚群构建特异性报告基因系

随着在成年斑马鱼中鉴定出不同的巨噬细胞和树突状细胞亚群，我们接下来旨在构建特异性报告基因系，以对这些细胞进行进一步的发育和功能研究。我们选择了两个基因ccl35.1和c1qb——前者在跨器官的经典树突状细胞（cDC）群体中高表达，后者在所有组织驻留巨噬细胞（TRMs）中高表达（图S4A）——分别作为经典树突状细胞和全巨噬细胞标志物。此外，分别在促炎性巨噬细胞和促重塑巨噬细胞中特异性表达的 lgals3bpb 与 ccl34a.4（图 S4A）也被选为巨噬细胞亚群特异性标志物。基于这些基因构建的荧光报告系是通过克隆其启动子或利用细菌人工染色体（BAC）载体实现的。54 最终获得了四种报告系，分别为 TgBAC(ccl35.1:EGFP)、Tg(c1qb:EGFP)、Tg(lgals3bpb:EGFP) 和 TgBAC(ccl34a.4:EGFP)，推测它们分别标记普通常规树突状细胞、全巨噬细胞、促炎性巨噬细胞和促重塑巨噬细胞（图 6A–6D）。

为了表征这些特异性报告基因品系，我们将其与Tg(mpeg1.1:DsRedx)鱼进行回交，并通过共聚焦成像和流式细胞术分析了早期发育阶段（图S5）和成年期（图6及图S6）的标记细胞。结果显示，ccl35.1:EGFP+和c1qb:EGFP+细胞分别在受精后约9天和6天被检测到（图S5A、S5B），而lgasl3bpb:EGFP+和ccl34a.4:EGFP+细胞则在受精后3天出现（图S5C、S5D）。值得注意的是，除Tg(ccl35.1:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼的鳃组织外（图S6），四种报告基因品系多数器官中的EGFP+细胞同时也呈mpeg1:DsRedx阳性；在其鳃组织中，部分(EGFP+)细胞为mpeg1:DsRedx阴性。这些(EGFP ^{+}DsRedx)细胞相较于EGFP+DsRedx+细胞，体积相对更小、颗粒度更低，可能代表前体细胞或淋巴细胞（图S6E）。总体而言，这四种报告基因品系中(EGFP+DsRedx)细胞的分布模式和比例与单细胞RNA测序（scRNA-seq）鉴定的指定细胞群一致（图6E-6L、图S4B及图S4C），证实了这些报告基因品系的标记特异性。综上，本研究结果表明这些报告基因品系能够忠实再现标记基因的内源性表达，并特异性标记指定的巨噬细胞或树突状细胞亚群，为研究这些多样的髓系细胞群的发育与功能提供了强有力的工具。

图6. 成年斑马鱼中髓系细胞（MP）和树突状细胞（DC）报告基因品系的特征分析。(A–D) 成年Tg(ccl35.1:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(A)、Tg(c1qb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(B)、Tg(lgals3bpb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(C)和Tg(ccl34a.4:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(D)表皮的代表性图像。比例尺，50毫米。(E–H) 分别从成年Tg(ccl35.1:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(E)、Tg(c1qb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(F)、Tg(lgals3bpb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(G)和Tg(ccl34a.4:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(H)的表皮中分选的EGFPDsRedx+ (GR+)和EGFP+DsRedx+ (G+R+)细胞中，通过qRT-PCR检测指定标记基因的相对表达水平（每组对应((n=6)）。以eef1a1l1作为内参基因。数据以平均值±标准差表示，(p 0.05)、(^{*} p<0.01)、(^{* * *} p<0.001)。(^{* * *} p<0.0001) (I–L) 分别为成年Tg(ccl35.1:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(I)、Tg(c1qb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(J)、Tg(lgals3bpb:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(K)和Tg(ccl34a.4:EGFP; mpeg1.1:DsRedx)鱼(L)各指定器官中EGFP+DsRedx+细胞占DsRedx+细胞总数的比例（心脏对应((n=4)，其余器官对应(n=6)）。数据以平均值±标准差表示。另见图S4–S6

讨论

在本研究资源中，我们开展了一项全面的跨组织单细胞转录组学研究，以解析成年斑马鱼中组织驻留记忆性T细胞（TRMs）和树突状细胞（DCs）的异质性。

我们定义了两种统一的巨噬细胞亚群，即lgasl3bpb+促炎性巨噬细胞和(ccl34a. 4^{+})促重塑巨噬细胞。有趣的是，这两种不同的巨噬细胞亚群在不同器官中呈现出独特的分布特征。促重塑巨噬细胞似乎存在于我们检测的屏障组织和内部器官中，而促炎性巨噬细胞则主要分布在持续暴露于环境刺激的屏障组织中。这些研究结果与哺乳动物中的相关发现相似，在哺乳动物中也存在两种独立的亚群，在巨噬细胞中，鉴定出了一群具有免疫相关特征的MHC I类分子阳性细胞（(Ihi)），以及另一群表达M2巨噬细胞标志物CD206且富含组织支持特性的Lyve1hi阳性细胞。15-17 值得注意的是，与斑马鱼中两种巨噬细胞亚群的分布模式相似，小鼠的MHC I类分子阳性巨噬细胞（(I ^{hi })）主要存在于肺等屏障组织中，而另一群巨噬细胞（(Lyve1 ^{hi })）则是心脏和肝脏等内脏器官中的主要细胞群，这进一步证实了这两种巨噬细胞存在功能偏向性的观点。探究这两类巨噬细胞亚群之间精确的功能差异，明确二者是发育起源上相互独立的亚群，还是细胞不同的激活状态，并进一步阐明调控其形成的分子基础，具有重要的研究价值。随着特异性报告基因品系的建立以及活体成像技术的可行性实现，利用斑马鱼模型系统可对这些问题进行全面解答。

与哺乳动物类似，我们的研究还在斑马鱼的非淋巴器官中广泛鉴定出了两类主要的树突状细胞（DCs），即常规树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs），这两类细胞均表现出哺乳动物DCs的部分关键特征，同时也表达独特的标志物（图4B、4D及图S2B）。我们的发现拓展了近期一项研究的结论，该研究曾报道斑马鱼淋巴器官（肾脏和胸腺）中存在pDCs。值得注意的是，我们还在鳃中发现了一小群迁移性DC样细胞，这类细胞表现出活化的常规树突状细胞表型，且具备迁移潜能（表达cd40和ccr7基因）（图S2C、S2D），这提示斑马鱼鳃附近可能存在类次级淋巴结构。近期一项研究证实斑马鱼鳃中存在淋巴结构，为这一观点提供了支持。斑马鱼中常规树突状细胞和浆细胞样树突状细胞的进化保守性表明，这两类细胞的功能特化早在硬骨鱼阶段就已形成，这也奠定了斑马鱼与哺乳动物免疫系统保守性的基础。然而，与哺乳动物不同——哺乳动物各器官中均存在常规树突状细胞1型（cDC1s）和常规树突状细胞2型（cDC2s）两种不同的亚群——我们的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，斑马鱼大多数器官中仅存在一类常规树突状细胞。斑马鱼与哺乳动物的这一差异可能源于物种差异：斑马鱼仅含一类常规树突状细胞，这类细胞或许至少部分兼具常规树突状细胞1型和2型的功能。另一种可能性是，单细胞RNA测序的测序深度相对较低，导致无法将常规树突状细胞进一步划分为常规树突状细胞1型和常规树突状细胞2型两个亚群。我们更倾向于第一种可能性，因为斑马鱼体内存在吞噬细胞——这是一种非造血来源的免疫细胞细胞类型，具有显著的树突状细胞样特征。需要进一步研究来阐明这一问题。

另一项有趣的发现是在斑马鱼脑实质中鉴定出了常规树突状细胞（cDCs），此前也有研究将其标记为(ccl34b.1)调节性或分支状小胶质细胞。然而，生理状态下哺乳动物脑实质中是否存在树突状细胞（DCs）仍存在争议。多项针对小鼠的研究表明，常规树突状细胞仅在中枢神经系统血管丰富区域被检测到，如脑膜和脉络丛，而在脑实质中未检测到。另一方面，Prodinger 等人报道在健康小鼠脑实质血管旁区域鉴定出了(CD11c+)树突状细胞样细胞，并在人类脑实质中发现了(CD209+)树突状细胞样细胞，58这表明哺乳动物脑实质中可能存在树突状细胞。结合近期有证据显示稳态下中枢神经系统中存在淋巴细胞，59可以推测树突状细胞可能参与中枢神经系统适应性免疫的调节。因此，在斑马鱼脑中鉴定出常规树突状细胞，意味着斑马鱼可作为有价值的模型来解决这一尚未解决的问题。

此前有研究报道，通过常规解剖收集的鱼鳞可能含有一些真皮成分，这可能会干扰表皮细胞的异质性分析。然而，考虑到收集的鳞片中真皮组织的含量远低于表皮组织，我们认为真皮组织带来的潜在污染对本研究中定义的主要细胞群的异质性没有实质性影响。值得指出的是，本研究中用于样品制备的组织解离方案可能会在某些方面影响细胞状态。尽管这对细胞类型鉴定的影响微乎其微，但一些与免疫激活相关的差异表达基因的表达可能会受到干扰，这一点需要在体内进行严格验证。

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