题目：Distinct epicardial gene regulatory programs drive development and regeneration of the zebrafish heart

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38237592/

期刊：Developmental Cell

研究亮点

l 再生与发育中斑马鱼心脏的心外膜基因表达存在显著差异

l 心脏再生与发育过程中的心外膜染色质可及性存在差异

l Hif1ab、Nrf1、Tbx2b 和 Zbtb7a 是再生心外膜的关键调控因子

l 敲除 Hif1ab、Nrf1、Tbx2b 和 Zbtb7a 会在损伤后增加 tcf21+ 细胞的数量

摘要

与再生能力有限的成年哺乳动物心脏不同，斑马鱼心脏在受损后可完全再生。心脏发育程序的再激活被认为是心脏成功再生的关键，然而损伤反应背后的调控机制仍不明确。本研究比较了发育中和再生中的斑马鱼心外膜的转录组和表观基因组。我们鉴定出了发育过程中或成年心脏再生过程中具有特异性活性的心外膜增强子元件。通过构建与心外膜发育和再生相关的基因调控网络，我们推断出驱动这两个过程的遗传程序存在显著差异。在受损心脏中，再生心外膜网络的核心调控因子Hif1ab、Nrf1、Tbx2b和Zbtb7a的缺失会导致浸润伤口的心外膜细胞数量增加，并在冷冻损伤后出现过度纤维化。本研究揭示了心外膜发育和再生过程中所采用的调控蓝图的差异，表明心脏再生并非仅依赖于发育程序的再激活。

图形摘要

引言

在哺乳动物中，心脏损伤后的修复能力在出生后会迅速下降。1,2 相比之下，斑马鱼的心脏在整个成年期都能再生，3–6 这为研究心脏再生的潜在机制提供了可能。7,8 心外膜是包裹脊椎动物心肌的一层间皮细胞，对心脏发育至关重要，9 同时也是斑马鱼心脏再生的关键必需结构。10 稳态下的成年心脏中，心外膜细胞大多处于静止状态，但在心脏损伤后会被激活。被激活的心外膜细胞重新进入细胞周期，并重新表达发育相关基因，例如转录因子（TFs）tbx18 和 wt1b。3,11–14 最初，心外膜细胞的激活是全器官水平的反应，在损伤后3天（dpi）完全显现，随后到损伤后7天，该反应会局限于损伤部位。3,14 被激活的心外膜细胞是最早迁移至损伤区域的细胞之一，会沉积纤连蛋白、胶原蛋白等细胞外基质（ECM）成分。15–17 激活的心外膜还进一步充当主要的信号中枢，13,18–22 而心外膜来源的细胞（EPDCs）会侵入心外膜下组织，9 最终分化形成心外膜周围组织血管细胞和成纤维细胞。¹¹ 因此，心外膜直接和间接支持心脏再生。

在不同物种中，重述发育程序通常被认为是损伤后成功实现心脏再生的关键特征。23-25 在心外膜中，活化的成年细胞所表达的诸多因子，也同样在发育中的心外膜上表达，且心脏再生与发育过程中的心外膜功能极为相似。9 然而，此前已有研究表明，小鼠胚胎心外膜细胞与损伤激活的心外膜细胞中，特定细胞表面标志物的表达谱存在显著差异。26 鉴于心外膜在发育和再生过程中均发挥着关键作用，但对于驱动任一过程中心外膜基因表达程序的上游转录调控机制，我们的认知却少得惊人。基因的高效精准表达由转录因子（TFs）调控，这类因子可结合启动子及远端顺式调控元件内的特定DNA序列。增强子是开放染色质的短片段，构成了非启动子顺式调控元件中最丰富的亚类。27 基因组区域的调控活性取决于其与……在结构上的关联紧密程度28通过绘制整个基因组的开放染色质区域，例如通过transposase-accessible染色质（ATAC）测序的测定，29有可能识别潜在的活性调节元件。最近，斑马鱼基因组中的区域已被确定为组织再生促进剂在小鼠35、36和36中发现了30-34个心外膜树37然而，心脏损伤后成年斑马鱼心外膜中的基因调控尚未与发育中的心外膜中的基因调控进行系统比较。

在这里，我们比较了发育和再生斑马鱼心外膜的转录组和表观基因组。我们发现发育和再生期间部署的心外膜转录组程序是不同的，再生只能部分概括发育。有趣的是，即使是驱动发育中和损伤后心外膜中一小群共享转录本表达的潜在遗传程序也显示出可识别的差异。

通过整合转录和表观基因组学数据集，我们构建了基因调控网络，并推断Wt1a、Wt1b和激活蛋白-1（AP-1）亚基Junbb、Fosab和Fosb是发育中的心外膜网络的中央调节因子，而Hif1ab、Nrf1、Tbx2b和Zbtb7a等TF是再生心外膜网络的假定中央调节因子。我们使用electroporation-based的方法将CRISPR-Cas9组件输送到受伤心脏的心外膜，以诱导心脏再生过程中的功能丧失。通过这种方法靶向hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a导致伤口和远端心室中的(tcf21+)细胞数量显着增加，并伴有损伤后后期过度纤维化。这些结果证明了由Hif1ab、Nrf1、Tbx2b和Zbtb7a组成的心外膜调节核心在斑马鱼心脏再生过程中的功能重要性。

结果

斑马鱼发育中心和再生中心的心外膜基因表达谱存在显著差异

为比较斑马鱼发育过程中及成年心脏损伤后的心外膜基因表达谱，我们分析了源自 TgBAC(tcf21:H2B-Dendra2)ox182 以及 TgBAC(tcf21:BirA2a-mCherry)ox143；Tg(bactin:Avi-Cerulean-RanGap)ct700a 转座子的心外膜细胞转录谱我们获取了受精后5天（dpf）的批量RNA测序数据，这一心外膜完全形成的时间点，样本来自心脏tcf21:H2B-Dendra2阳性细胞（tcf21幼龄心外膜细胞）和tcf21:H2B-Dendra2阴性心脏细胞（非tcf21幼龄心脏细胞）（图1A和图S1A）。对于成年样本，我们在冷冻损伤后3天（dpi）对心脏tcf21:BirA-2a-mCherry；bactin:Avi-CeruleanRanGap+细胞核进行了分析（tcf21冷冻损伤组），该时间点受损心外膜的激活范围覆盖整个器官³，我们采用生物标记法分离特异性细胞核³⁸,³⁹。从基因表达特征来看，受精后5天发育中的心外膜与冷冻损伤后3天再生的心外膜相似，二者均表达tbx18和wt1b等因子，而这些因子在成年未损伤的心外膜中不表达。我们还处理了假损伤后3天（dps）的相应假损伤对照组样本（tcf21假损伤组）。主成分分析（PCA）显示，各条件重复样本间的基因表达变异性较低（图1B）。大部分变异性源于幼龄与成年样本间的差异（主成分1，占比69%）。直接对比tcf21幼龄心外膜细胞与tcf21冷冻损伤组，我们发现8554个基因在幼龄心外膜中显著富集，而2472个基因在成年冷冻损伤的心外膜中富集（图1C）。幼龄心外膜富集的基因包括趋化因子配体cxcl14以及AP-1转录因子亚基fosab、junbb和jdp2b。成年冷冻损伤的心外膜则以多种胶原蛋白富集为特征，如col1a1a、col1a2和col12a1b。

在 tcf21 幼虫上皮细胞中富集的基因与多个与细胞信号传导相关的基因本体论（GO）术语相关，例如“细胞表面受体信号通路” ((p=0.00029)) 和“MAPKKK 活性激活” ((p=0.00037))（图1D）。在 tcf21 冷冻样本中富集的基因则与再生相关过程相关，如“再生” ((p=0.00384))、“创伤反应” ((p=0.00972)) 和“细胞外基质组织” ((p=4.2 ×10-6))。

在评估了发育中心外膜与再生中心外膜之间的转录组差异后，我们接下来探究是否存在共同的转录组程序。我们将tcf21幼鱼心外膜的基因表达与非tcf21幼鱼心脏的基因表达进行了比较，并将该比较结果与tcf21冷冻损伤组与tcf21假手术组的比较结果取交集（图1E）。一组52个在成年冷冻损伤心外膜中相较于假手术对照心外膜富集的基因，在幼鱼心外膜相较于幼鱼对照心外膜中也同样富集（图1E；表S1）。这些基因中有许多是细胞外基质（ECM）的组成成分或信号因子（图1F），其中有几个此前已被证实与心脏再生相关，例如fn1a。17 细胞因子中期因子a（mdka）已被证明在斑马鱼中表达损伤后的斑马鱼心外膜中，它作为纤维化的调节因子发挥作用。40胶原蛋白12a1a（col12a1a）和骨膜蛋白b（postnb）也斑马鱼心脏损伤后表达水平升高。15,41 然而不过，这52个基因中的其他成员此前从未在心脏损伤相关背景下被报道过，例如肌动蛋白束蛋白富丙氨酸肌动蛋白束蛋白类似物1a（marcksl1a）⁴²以及胶原加工酶前胶原-赖氨酸、2-氧戊二酸5-双加氧酶2（plod2）⁴³。

我们采用多重杂交链反应（HCR）原位染色技术44，验证了部分共有转录本在发育中心外膜（图1G和图S1B）以及冷冻损伤心外膜（图1H和图S1C）中的表达情况。我们发现mdka和col12a1a（图1G、1H）以及postnb（图S1B、S1C）在发育和再生期的心外膜细胞层内表达，并与tcf21转录本共定位。HCR技术还检测到mdka和col12a1a在假手术处理的成体心外膜中存在表达（图S1D），这与转录组学数据一致。

总之，我们的数据表明，成年心脏冷冻损伤后3天内启动的心外膜转录组反应并非单纯重演发育中心外膜的基因程序（详见图S1E，展示了幼虫或冷冻损伤心外膜中富集的核心基因）。不过，我们也鉴定出了发育中和再生中心外膜共有的几种转录本，这意味着这些基因可能是心外膜功能的关键调控因子。

图1.发育和再生斑马鱼心外膜中的基因表达程序是不同RNA测序工作流程概述。（b）转录组样本的主成分聚类。（C）tcf21 幼虫上皮细胞与 tcf21 冷冻细胞的差异基因表达分析。图中展示的是经 (log2) 转换的表达倍数变化以及经 Benjamini-Hochberg 校正的沃尔德检验 p 值。显著富集的基因（经 (p value <0.05) 校正）以红色标注。(D) tcf21 幼虫上皮细胞（相较于 tcf21 冷冻保存样本，左列）中富集基因与 tcf21 冷冻保存样本（右列）中富集基因的 GO 术语过度代表性分析。气泡大小代表统计富集程度，颜色代表显著性。（E）展示不同条件下基因表达富集重叠情况的维恩图。图中标注了每个交集包含的基因数量。(F) 在tcf21幼虫表皮与非tcf21幼虫心脏中富集、且在tcf21冷冻样本与tcf21假手术样本中富集的基因表达情况。(G) 5 dpf 心脏中 col12a1a（橙色）、mdka（品红色）和 tcf21（绿色）的 mRNA 染色。(G0 和 G00) 心外膜区域中被 col12a1a、mdka 和 tcf21 转录本包围的细胞核（星号）。(H) 3天损伤后心脏中col12a1a（橙色）、mdka（品红色）和tcf21（绿色）的mRNA染色。Ia为损伤区域。(H0和H00) 被col12a1a、mdka和tcf21转录本包围的心外膜区域中的单个细胞核（星号）。比例尺：图(H)中为100毫米；图(G)、(H0)和(H00)中为20毫米；图(G0)和(G00)中为5毫米。分别调整各颜色通道的亮度/对比度。图(G)和图(H)为单张光学切片。dpf为受精后天数；dpi为损伤后天数；V为心室；A为心房；BA为动脉球。分析的生物学重复数：tcf21幼虫上皮，n=3；非tcf21幼虫心脏，n=3；tcf21冷冻损伤组，n=3；tcf21 (n=2)。另见图S1。 

发育中心外膜与再生中心外膜的染色质可及性图谱

接下来，我们旨在深入了解驱动心外膜基因表达的基因组调控机制。我们对经荧光激活细胞分选（FAC）的5天龄（dpf）tcf21+心外膜细胞（从TgBAC(tcf21:H2B-Dendra2)ox182品系分离，对应(tcf21)非心外膜心肌细胞）、成年3天损伤后（dpi）(tcf21+)心外膜细胞（从TgBAC(tcf21:BirA-2a-mCherry)ox143品系分离），以及来自相应假手术对照样本的tcf21+细胞（从TgBAC(tcf21:BirA-2a-mCherry)ox143品系分离）进行了ATAC-seq检测（图2A）。

在全基因组范围内鉴定出可及的染色质区域（峰）后，45 我们根据所有样本峰位置的相似性对其进行了聚类分析46（图2B）。每种条件的生物学重复样本均紧密聚类。然而，tcf21 冷冻样本的峰图谱与 tcf21:H2B-Dendra2+ 幼虫心外膜样本（tcf21 幼虫心外膜）或 tcf21:H2B-Dendra2+ 幼虫心肌细胞样本（非 tcf21 幼虫心肌细胞）的峰图谱相关性均不佳。

接下来，我们构建了一个涵盖所有条件下35,247个可及区域的共识峰集46，并使用Homer47分析了峰的基因组特征；74.8%的峰位于启动子或基因编码区（图2C），这表明它们可能参与转录活性的近端调控，而22.5%的峰位于基因间区。GC中位数各峰值的含量在42%至45%之间波动（图2D），这一范围与此前斑马鱼基因组的报道值相符。48 富含长GC序列的区域（CpG岛）在峰值序列中所占的中位数比例为3%至5%，其中启动子区域的峰值CpG含量中位数最高（图2E），这与CpG岛与转录起始位点（TSS）之间已被充分证实的关联一致。49 此外，正如预期，转录起始位点周围区域各条件下的平均测序覆盖度有所升高（图2F）。我们计算了峰值的平均大小，发现除斑马鱼幼心外膜的((t)检测中，所有条件下启动子峰值均大于其他峰值（启动子与非启动子峰值对比：tcf21幼心外膜，(p=0.75)；非tcf21幼心，(p=5.8 ×10^{-102})：tcf21冷冻组，(p=5.3 ×10^{-105})；tcf21假手术组，(p=2.4 ×10^{-167})）（图2G）。tcf21幼心中启动子峰值小于tcf21冷冻组，这可能表明发育过程中心外膜的基因调控对启动子的依赖性更低。相反，tcf21幼心外膜中转录终止位点（TTS）附近的峰值和基因间区峰值均大于tcf21冷冻组。这些观察结果表明，发育中心外膜的基因表达调控与受损成体心外膜的调控存在显著差异。

图2. 发育中和再生斑马鱼心外膜中的染色质可及性。(A) ATACseq 测序工作流程概述。(B) 幼体与成体可及染色质谱的皮尔逊相关系数基于距离的聚类，树状图展示聚类结果；相关系数大小以颜色表示。(CE) 峰在基因组元件上的分布相对定量 (C)、峰的 GC 含量 (D)、峰的 CpG 含量 (E)。(F) 转录起始位点（TSS）处测序读段的平均相对密度。(G) 不同基因组元件上峰的平均长度。缩写说明： dpf：受精后天数；dpi：损伤后天数；V：心室；A：心房；BA：动脉球；bp：碱基对。 分析所用生物学重复数量：tcf21幼体心外膜，n=2；非tcf21幼体心脏，n=2；tcf21冷冻损伤组，n=4；tcf21假手术组，n=2。 图 D、E 中，箱线图（Tukey 样式）展示中位数以及第一、第三四分位数。

发育与再生过程中心外膜基因的表达依赖于独特的调控程序

鉴于我们的数据表明发育和再生过程中心外膜存在不同的转录组程序，我们接下来探究了造成这种差异的调控程序。通过直接比较tcf21幼虫心外膜和tcf21冷冻心外膜，我们鉴定出3211个峰（占10%）在tcf21幼虫心外膜中具有富集的可及性，554个峰（占2%）在tcf21冷冻心外膜中具有富集的可及性（图3A）；位于tcf21基因座的8个峰中有4个在tcf21冷冻心外膜中显著富集，其中4个峰里有3个距离tcf21转录起始位点（TSS）不足10千碱基（图3B）。此外，对重复样本取平均值后，注释到tcf21的8个峰中有7个在再生心外膜中表现出更高的可及性。这表明，再生心外膜中tcf21表达的调控可能利用了一套更复杂的不同调控元件网络，相比发育过程中采用的转录调控，这使得其对损伤的反应更为迅速。

我们发现，tcf21 幼虫心外膜细胞富集的峰中启动子峰的比例低于 tcf21 冷冻保存细胞富集的峰（图3C，tcf21 幼虫心外膜细胞：10%，tcf21 冷冻保存细胞：26%）。相比之下，基因间峰则呈现相反趋势（基因间区，tcf21 幼虫心外膜细胞：33%，tcf21 冷冻保存细胞：23%），这表明发育中心外膜的远端调控模式向再生中心外膜的以启动子为基础的调控模式转变。而“胚胎形态发生”等发育相关的GO术语((p=0.04))和“组织发育”((p=0.016))在tcf21幼虫肾上腺素条件下被过度代表（图3D），tcf21低温元件的顶部过度代表术语与细胞反应相关，例如“细胞对内源性刺激的反应”((p=0.007))和基因调节，例如"参与调控转录的染色质组织"((p=0.024))，潜在地反映了对损伤的反应。

接下来，我们研究了在发育和再生心外膜中表达的52个基因（表S1）附近的染色质可及性在这些条件下的变化程度。发育中心外膜对富集作用具有强烈偏向性（图3E），这表明即使是同时标记发育中和再生中心外膜的基因，其表达调控也存在差异。

图3.发育和再生的心外膜中不同的染色质可及性概况。（A）差异峰可及性分析，比较tcf21幼虫epi与tcf21低温。显示的是log2转化的可及性折叠变化和BenjaminiHochberg-adjustedWald测试p值。显著富集的峰（调整后的(p value <0.05)用红色着色。突出显示的是位于tcf21基因座的峰。（B）tcf21基因座的染色质可及性。在低温损伤与幼虫心外膜中显著富集的峰用红色突出显示。（C）跨基因组特征差异可及性峰分布的相对定量。（D）位于靠近富集于tcf21幼虫epi（左栏）或tcf21低温（右栏）的峰的基因的GO项过度表示。气泡大小描绘了统计富集的幅度，颜色显著性。（e）位于幼虫和成虫低温损伤心外膜((n=52))标记基因附近的峰的差异可及性，在基因水平上量化气泡颜色表示富含tcf21幼虫外膜的差异可及性峰数量与富含tcf21低温的峰数量的比率（绿色=所有tcf21幼虫外膜，棕色=所有tcf21低温，白色=相等的比率）。

最后，我们检测了位于mdka和col12a1a基因附近的差异可及元件的体内活性，这两个基因均在发育中和再生的心外膜中表达。我们建立了稳定的Ac/Ds荧光报告基因系50，发现mdka_e1（一个在tcf21幼虫心外膜中富集的峰，位于mdka的第一个内含子内，图4A）在发育中心外膜中具有活性（图4B），但在冷冻损伤后的成体心外膜中无活性（图4C）。相比之下，mdka_e2（一个在tcf21冷冻损伤样本中富集的峰，位于mdka下游10千碱基对处，图4A）在发育中心外膜中无活性（图4D），但在心脏损伤后于成体心外膜细胞的亚群中具有活性（图4E）。

我们还采用瞬时转染方法验证了mdka_e1和mdka_e2的增强子活性，该方法是对斑马鱼中先前使用的体内DNA电穿孔方案进行改造而来的⁵¹。我们首先将编码泛在表达的Citrine的DNA构建体电穿孔导入未受伤的心脏，观察到心外膜区域广泛存在荧光（图S2A）。接下来，我们对Tg(tcf21:myr-(eGFP) ^{ax 183}))鱼进行冷冻损伤，随后电穿孔用于构建稳定表达系的mdka增强子报告载体（图4F）。在电穿孔mdka_e1报告构建体后，冷冻损伤的成鱼心外膜中未检测到荧光（图4G），但我们发现mdka_e2增强子在心外膜具有明显活性（图4H），这与使用稳定报告系获得的结果一致。因此，电穿孔方法可用于瞬时检测再生的成年斑马鱼心脏中的增强子活性。

此外，我们分析了一个在 tcf21 幼虫上皮细胞中富集的峰值，该峰值位于 col12a1a 基因下游 30 千碱基对处（col12a1a_e1，图 S2B）。稳定的 col12a1a_e1 报告基因系显示，该增强子在发育中和再生的心外膜中均具有活性（图 S2C 和 S2D）。

综合我们的数据可以看出，在发育中和再生的心外膜中观察到的基因表达变化，很可能是由开放染色质动力学的差异导致的。

图4. mdka基因座中差异可及染色质区域的体内增强子活性。(A) mdka附近测序峰的染色质可及性。红色方框标记的峰，其中 e1 用于 (B)、(C)、(G) 进一步分析；e2 用于 (D)、(E)、(H) 进一步分析。(B) 5 dpf 时，由mdka_e1驱动的 mCherry 稳定表达。tcf21的表达由 myreGFP 荧光标记（绿色细胞膜）。(B′) 为 (B) 的单张光学切片。(B″) 星号标记心外膜处的 mCherry 荧光信号。(C) 成体心脏冷冻损伤后 3 dpi，mdka_e1驱动的 mCherry 稳定表达。(C′) 为 (C) 中部分损伤区域 (ia) 的高倍放大图像。(D) 5 dpf 时，由mdka_e2驱动的 mCherry（品红色）稳定表达。(D′) 为 (D) 的单张光学切片。(D″) 心外膜区域无 mCherry 荧光信号（星号位置）。(E) 成体心脏冷冻损伤后 3 dpi，mdka_e2驱动的 mCherry 稳定表达。(E′) 为 (E) 中部分损伤区域的高倍放大图像；星号标记显示mdka_e2活性的心外膜细胞。(F) 成体斑马鱼心脏损伤，随后电穿孔导入增强子活性报告载体的实验流程。(G、H) 向冷冻损伤的成体心脏电穿孔后，mdka_e1(G)、mdka_e2(H) 驱动的 mCherry 瞬时表达。(G′、H′、H″) 为 (G) 和 (H) 的高倍放大图；(H′) 与 (H″) 中，星号标记显示mdka_e2活性的心外膜细胞。

与发育和再生相关的心外膜基因调控网络可识别心外膜基因表达的核心调控因子

接下来，我们旨在探究在心脏发育和再生过程中，哪些转录因子可能调控心外膜基因的表达为此，我们在ATAC-seq峰集上查询了从JASPAR 2020数据库获取的746个脊椎动物转录因子结合基序的存在情况⁵²。我们使用chromVAR⁵³联合分析了染色质可及性与基序出现情况，并根据所有基序的可及性偏差对ATAC-seq样本进行了聚类（图S3A）。与基于峰可及性的聚类结果类似（图2B），tcf21幼虫上皮样本与成年tcf21冷冻和假手术样本聚为不同的类群（图S3A）。

我们接下来检测了发育中心外膜与再生中心外膜差异开放的峰中存在的转录因子（TF）基序。我们发现在tcf21冷冻保存的峰中，AP-1复合物亚基FOS和JUN结合基序的出现频率有所增加（图5A）。AP-1复合物是斑马鱼心脏再生所必需的，并能控制心肌细胞的染色质开放状态⁵⁴。相比之下，WT1和KLF2基序在tcf21幼体中心外膜富集的峰中出现频率更高。这些结果与近期的研究发现一致，即成年斑马鱼心外膜中AP-1结合位点的开放程度在损伤后会增加，而WT1结合位点的开放程度则会下降³⁷。TCF21和TBX18基序在两种条件下的出现频率相同。因此，不同的转录因子可能分别调控幼体中心外膜和受损成年心外膜。基于此，我们分析了转录因子的表达情况（图5B），包括近期发表的成年未损伤心脏中tcf21⁺细胞的表达数据⁵⁵。我们发现，与再生中心外膜相比，幼体中心外膜中wt1a和wt1b的表达更为富集（错误发现率对应的标识：([F D R](w t 1 a)=0.0016)、(FDR(wt 1 ~b)=2 ×10^{-8}))），这与WT1基序开放程度的增加相匹配。然而，我们发现AP-1复合物组分在发育中心外膜中也同样富集（标识：(( FDR (j u n)=9 ×10^{-12})、(FDR(junba) =5 ×10^{-19})、(FDR(junbb) =)、(2 ×10^{-29})、(FDR (f o s / 1 a)=3 ×10^{-5})、(FDR(fosab) =1 ×10^{-50})、(FDR(fosb) =3 ×10^{-12})）。这些发现与幼体富集峰中AP-1结合位点开放程度较低的结果相矛盾。再生中心外膜中富集的基因包括：缺氧诱导因子1αβ（hif1ab，标识：((F D R=0.0052))，已被证实为斑马鱼心脏再生所必需⁵⁶）；含锌指和BTB结构域的因子zbtb7a（标识：((FDR=3 ×10^{-9}))），它是心肌梗死后心力衰竭相关基因的调控因子⁵⁷；以及tbx2b（标识：((F D R=1 ×10^{-6}))），它是房室管形成的已知调控因子⁵⁸。总体而言，这些基因在成年未损伤的心外膜中表达水平较低，表明它们并不参与维持完整的心外膜。

我们接下来结合染色质可及性和基因表达数据构建了心外膜基因调控网络使用最近开发的计算框架59（图5C）。我们将网络筛选至连接强度排名前1%的部分，得到约10万个连接的子网络（图S3B）。所有子网络均包含200-250个转录因子（n ([larval epicardium] =230)、(n[cryoinjured epicardium] =216)，n [假手术处理的心外膜] = 214），且靶基因数量更多((n[larval epicardium] =1,798)、(n[cryoinjured epicardium] =)、2445、(n[sham-treated epicardium] =2,422 ))（图S3C）。为了预测网络内的连接性并由此确定转录因子的调控重要性，我们计算了每个因子的特征向量中心性60。Tcf21、Stat3和Meis1b，以及Jun、Junba、Fosl1a和Fosl2在幼体和冷冻损伤的心外膜网络中均具有较高的中心性值，表明它们可能在两种情况下均调控心外膜的转录（图5D）。相比之下，W1a和Wt1b等转录因子在发育中心外膜网络中的中心性远高于再生中心外膜网络，而Hif1ab、Zbtb7a、Tbx2b和Nrf1等转录因子则呈现相反趋势。为进一步筛选可能在心脏再生过程中特异性发挥调控作用的转录因子，我们比较了冷冻损伤与假手术处理心外膜网络的中心性（图5E）。Nrf1、Mynn和Pknox2仅在冷冻损伤心外膜网络中具有高中心性，而Klf15、Hif1aa等则在假手术网络中中心性更高。随后，我们探究高网络中心性的转录因子是否也位于调控转录因子层级的顶端。为此，我们将特征向量中心性与入度中心性（IDC，一种衡量网络入边连接数量的指标）60进行了比较。Wt1b ((I D C=0))（而非Jun ((IDC =0.116))和Fosab ((IDC=0.083))）被预测位于幼体心外膜调控层级的顶端（图5F）。相比之下，Hif1ab被预测位于成体心外膜两种条件下层级的顶端((IDC[cryoinjured] =0.003)、(IDC[sham-treated] =0 ))（图5G和5H）。有趣的是，tcf21在幼体心外膜中被预测接受的调控输入量低于成体活化心外膜(( IDC [ larval ]=0.024)，IDC[冷冻损伤] (jured] =0.049)和(IDC[sham-treated] =0.051)，这表明Tcf21在心脏再生过程中可能发挥更下游的作用。

总之，我们的基因调控网络分析预测了一些特定的转录因子（TFs），它们在调控心外膜基因表达方面发挥核心作用（完整概述见图S4A）。

图5. 基因调控网络可识别发育和再生过程中斑马鱼心外膜的核心转录调控因子。（A）tcf21 幼虫上皮与 tcf21 冷冻组中差异可及峰内转录因子基序存在情况的定量分析。右侧展示了部分基序序列标识。（B）幼虫、成年冷冻损伤及假手术处理的心肌外膜中转录因子的表达情况。构建基因监管网络和确定中央监管机构的工作流程。（D和E）tcf21幼虫肾上腺素和tcf21低温网络（D）以及tcf21假心外膜和tcf21低温网络（E）中的特征向量中心性。在冷冻损伤的心外膜中具有丰富中心性的TFs显示为蓝色，在假处理的心外膜中具有丰富中心性的TFs显示为紫色。（F-H）在tcf21幼虫epi（F）、tcf21冷冻（G）和tcf21假（H）子网络中的程度中心性与特征向量中心性。在（D-H）中，幼虫和成虫心外膜的选定调节剂显示为红色，幼虫心外膜的调节剂显示为黄色，成虫心外膜的调节剂显示为绿色。在（D）和（E）中，AP-1组分以粗体字母标记。Epi，心外膜。另见图S3和S4。

心外膜上游调控因子的特定组合驱动损伤后发育基因的转录重激活

在确定了转录因子（TFs）是发育和再生过程中心外膜的调控因子后，我们探究了损伤后重新激活的少量发育基因是否受到差异调控（如图3E所示）。为此，我们比较了这些基因（表S1）与Tcf21、Meis1b、Stat3（预测为核心调控因子）之间网络连接的标准化强度在心脏发育和再生过程中心外膜中处于中心地位）、Wt1a 以及 Wt1b（在发育中的心外膜中更具中心性），还有 Tbx2b 和 Nrf1（在再生的心外膜中更具中心性）（图6A和图6B）。我们发现，Tcf21、Meis1b 和 Stat3 在幼虫和冷冻损伤的心外膜网络中均具有较高的连接得分。然而，Wt1a 和 Wt1b 主要在幼虫心外膜网络中表现出更强的连接性，而 Tbx2b 和 Nrf1 通常在冷冻损伤的心外膜网络中具有更强的连接性。该分析表明，即便是在发育和再生过程中均存在的转录本，其表达也由不同的上游转录因子组进行调控。

接下来我们评估了哪些转录因子（TFs）可能驱动mdka_e1和col12a1a_e1在体内的幼虫心脏活性。在这两个增强子序列中，我们均鉴定出一个WT1结合基序（mdka_e1：CTCCCTCCCCCATGC，正链，基序(score =10.8)；col12a1a_e1：ATGTGTGGGAGGAA，负链，基序得分=11.1）（图6C和图S5A）。此外，mdka_e1序列还包含一个KLF9基序（TGTGTGTGTGTGTCTC，负链，基序(score =10.3)）和一个MEIS1基序（AGTGATTTATGAC，负链，基序(score =10.9)）。主要在冷冻损伤心外膜中可及的mdka_e2序列，包含多个在tcf21冷冻损伤子网中具有高中心性的转录因子结合位点，其中包括一个TBX2基序（TTTGACACCCT，负链，基序(score =8.9)；图6D）。我们发现人TBX2与斑马鱼Tbx2b的DNA结合结构域存在96%的氨基酸序列相似性（图S5B），这表明Tbx2b可能结合该TBX2结合基序。多重原位染色验证了klf9在发育中心外膜中的表达（图6E），且在冷冻损伤后损伤区域存在稀疏表达（图S5C）。tbx2b的表达在冷冻损伤的成体心脏中显著存在，并与损伤区域的tcf21转录本共定位（图6F），而幼虫心脏中tbx2b的表达似乎主要局限于心房（图S5D）。我们在幼虫和成年损伤心脏中均检测到了meis1b的表达，其与tcf21转录本以及sox4a转录本共定位（图S5E和S5F）。最后，我们发现zbtb7a和nrf1在幼虫心外膜中呈稀疏表达，而在靠近tcf21的成体损伤区域表达更为显著（图S5G和S5H）。与我们的研究结果一致，近期一项研究发现，心脏损伤后斑马鱼心外膜细胞中ZBTB7A基序的可及性有所提升损伤。

两者合计，我们的分析确定了TFs可能会驱动发展和再生斑马鱼心外膜中常见表达的基因的差异调控。

为了关注心外膜上游调节，我们观察了两个网络中Tcf21、Meis1b、Stat3、Wt1a、Wt1b、Hif1ab和Nrf1之间最强的联系（图6G和6H），并发现了显著的差异。虽然Wt1b在幼虫心外膜条件下处于调节层次的顶端，但在冷冻损伤的心外膜条件下不存在。在相比之下，Hif1ab 在幼虫心外膜调控中仅发挥微弱作用，但在损伤后的心外膜调控中却具有广泛的连接性。例如，Hif1ab 与 Nrf1 存在关联，而 Nrf1 是另一个仅在再生过程的上游调控中发挥作用的调控因子。与幼虫心外膜网络中较低的互作差异分数（IDC）相符（图5F），Tcf21 位于调控发育中心外膜的转录因子（TF）层级顶端。然而，在冷冻损伤的心外膜调控网络中，Tcf21 从多个来源获得调控输入，包括其自身。这可能反映了损伤后需要快速上调 tcf21 的表达，这与发育中心外膜中更稳定的表达状态形成对比。因此，发育中心外膜中预测的上游转录调控与再生中心外膜中的调控存在显著差异。

图6. 斑马鱼发育与再生心外膜中共同表达基因的差异转录组调控（A和B）在发育心外膜网络（A）和再生心外膜网络（B）中，所选转录因子与两种条件下共同表达的基因之间的网络连接得分。（C）mdka_e1序列中的转录因子基序。(D)mdka_e2 序列中的 TF 基序。tcf21 幼虫上皮细胞内源性基因组区域的代表性可及性（C）或 tcf21 冷冻样本中的代表性可及性（D）以灰色标出。气泡大小表示该因子在 tcf21 幼虫上皮细胞子网络（C）或 tcf21 冷冻样本子网络（D）中的特征向量中心性。(E) 5天龄斑马鱼心脏中klf9（品红色）和tcf21（绿色）的mRNA染色结果。(E0和E00) 心外膜区域中一个被klf9和tcf21转录本包围的细胞核（星号）。(F) 3天冷冻损伤后成年心脏中tbx2b（品红色）和tcf21（绿色）的mRNA染色。Ia，损伤区域。(F0 和 F00) 心外膜区域中被tbx2b和tcf21转录本包围的单个细胞核（星号）。（G）发育中心外膜的预测上游转录调控  (H) 再生心外膜中的上游调控。  在图(G)和图(H)中，所有相互作用均为激活型。比例尺：图(F)为100毫米；图(E)为20毫米；图(E0)、图(E00)、图(F0)和图(F00)均为5毫米。已分别针对亮度/对比度调整了颜色通道。图(E)和图(F)为单张光学切片。TFBS为转录因子结合位点；V代表心室。另见图S5。

成年再生心外膜核心调节因子功能丧失影响斑马鱼心脏再生

我们进一步探究了通过生物信息学分析鉴定出的成年再生心外膜核心转录调控因子，在斑马鱼心脏再生过程中是否确实发挥功能性作用。为此，我们在冷冻损伤时通过电穿孔诱导Cas9介导的基因编辑。共电穿孔驱动Cas9表达的质粒与靶向eGFP的sgRNA（图S6A），会显著破坏TgBAC(tcf21:myr (eGFP) ^{0 ×183}))心脏中心外膜的荧光（图S6B和S6C），这表明心外膜中发生了高效的基因编辑。

随后我们以在tcf21冷冻网络中具有高中心性的四种转录因子（TFs）的编码基因为靶向对象（图5D）：hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a。同时靶向这些因子（实验条件，图7A）导致损伤区域（图7B0-7E0中的箭头所示，图7F为定量分析；对照组中位数：每(1,000 mu m^{2}) (n=7) 2.02个；实验组中位数：每(1,000 mu m^{2}) (n=5) (^{circ} p=0.047) 4.58个）在7dpi时tcf21:H2B-Dendra2+细胞的数量显著增加，心室未损伤区域也呈现相同趋势（图7G；对照组中位数：每(1,000 mu m^{2}) (n=7) 0.2个；实验组中位数：每eeadc450-f914-4242-bc7d-7f8105bb39f1 (n=5) (^{*} p=0.004) 0.34个）。功能丧失型心脏的心外膜层中，hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a的转录本数量减少（图S6D-S6G），这可能是由于编辑的基因中引入了提前终止密码子，并激活了无义介导的mRNA降解途径⁶¹。为评估增殖情况，我们对增殖细胞核抗原（PCNA）进行染色，发现在7dpi时，功能丧失型心脏伤口区域的tcf21:H2B-Dendra2+细胞增殖趋势更高（图S7A-S7C）。

我们以纤维化组织的清除作为心脏再生成功的指标，研究发现靶向hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a会损害22天注射后（dpi）纤维化组织的消退（图7H和7I，定量分析见图7J，对照组中位数：心室面积的1.97%，(n=5)；实验组中位数：心室面积的2.83%，(n=7)：(^{*} p=0.028)）。同时，我们观察到覆盖纤维化组织区域的致密肌层厚度有所增加（图7H0和7I0中的括号标注，定量分析见图7K，对照组中位数：42.25微米，(n=5)；实验组中位数：70.43微米，(n=7)：(^{*} p=0.015)）。冷冻损伤后，通过Cas9介导靶向hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a导致过量的纤维化组织，再加上心外膜细胞数量的增加，有力表明我们通过计算机预测鉴定出的心外膜调控核心在斑马鱼心脏再生过程中具有重要的功能。

图7. hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a基因的缺失会影响斑马鱼的心脏再生。（A）成年斑马鱼心脏损伤后电穿孔Cas9表达载体以及hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a向导RNA混合物（实验条件）或对照向导RNA的实验流程。(B–E) 7天损伤后对照（B和C）和实验（D和E）TgBAC(tcf21:H2B-Dendra2)心脏，经Dendra2（绿色）和MF20（品红色）染色。展示的是存在大面积损伤（B和D）和小面积损伤（C和E）的心脏。(B0–E0) 分别为(B)–(E)中损伤区域的放大图。箭头头指示损伤区域的心外膜细胞。(F) 损伤区域 tcf21* 心肌细胞数量的定量分析 ((^{*} p=0.047))(G) 第91天心室非损伤区域tcf21*心肌细胞数量的定量分析((^{*} p=0.004))。(F)和(G)中的细胞数已分别以损伤区域(F)和心室非损伤区域(G)为基准进行归一化处理。在(F)和(G)中：对照组n=7，实验组n=5。（H和I）酸性品红-橙黄G（AFOG）染色显示，伤后22天对照组（H）和实验组（I）心脏中健康组织呈橙棕色、纤维蛋白呈红色、胶原蛋白呈蓝色。星号标注损伤部位。（H0）和（I0）分别为（H）和（I）中损伤区域的放大图。方括号标注损伤部位处致密肌层的厚度。（J）对AFOG染色的组织面积进行定量分析，以心室面积为标准化处理（*p = 0.028）。((^{circ} p=0.028))(K) 损伤部位致密肌层厚度的量化分析（*p = 0.015*）。(('p = 0.015))在图（J）和（K）中：对照组数量（n）= 5，实验组数量（n）= 7。比例尺：图（B）-（E）和图（B0）-（E0）为100毫米，图（H）和（I）为200毫米，图（H0）和（I0）为50毫米。A：心房；BA：动脉球；V：心室；WT：野生型；ia：损伤区域。在图（F）、（G）、（J）和（K）中，箱线图（图基样式）展示了中位数及第一/第三四分位数。另参见补充图S6、S7及补充表S3。

讨论

心外膜是心脏发育和再生过程中心血管衍生细胞及有丝分裂信号的重要来源。因此，了解调控心外膜发育及其损伤应答的潜在遗传程序，对于实现病变心脏的有效治疗性干预至关重要。

人们普遍认为，胚胎发育过程中使用的转录程序在再生过程中往往会被重新利用；然而，这些程序背后的遗传机制仍不明确。在本研究中，我们对斑马鱼心外膜发育过程中和成年心脏损伤后发挥作用的心外膜基因程序进行了无偏倚的全基因组比较。令人惊讶的是，我们发现再生过程中部署的转录组程序并非仅仅是驱动胚胎发育的转录活性的重现。通过结合染色质可及性和基因表达数据分析，我们构建了特异性调控每个过程的基因调控回路。我们发现，Wt1a、Wt1b、Klf9以及AP-1亚基Junbb、Fosab和Fosb在发育中心外膜基因调控网络中处于更核心的位置，这表明它们可能是激活胚胎心外膜转录程序所必需的。相反，再生心外膜基因调控网络则以Hif1ab、Zbtb7a、Tbx2b和Nrf1等转录因子作为潜在的核心调控因子，其中Hif1ab被预测为冷冻损伤心外膜中调控层级顶端的因子。我们还发现，即使对于胚胎和再生心外膜共有的转录本群体，驱动其表达的潜在遗传程序也存在差异。值得注意的是，Tcf21 在各个网络中的定位差异显著：在发育中的转录因子层级中处于顶端的同时，Tcf21 在再生心外膜网络中还接收来自包括自身在内的多个来源的调控信号。这表明，再生心外膜中 tcf21 表达的调控允许多种上游信号输入，这可能有助于其在损伤时快速启动表达，与发育过程中采用的更缓慢的基因组调控蓝图形成对比。

我们通过基于电穿孔的Cas9介导的基因编辑技术，验证了在再生心外膜中发挥作用的假定调控核心的功能重要性，该核心由Hif1ab、Nrf1、Tbx2b和Zbtb7a组成。在冷冻损伤时靶向hif1ab、nrf1、tbx2b和zbtb7a，会导致浸润伤口区域的心外膜细胞数量增加，并出现过度纤维化。近期有研究表明，心肌梗死后小鼠心脏成纤维细胞中HIF-1α的缺失会增加线粒体活性氧（ROS）的产生，进而导致成纤维细胞增殖加剧和过度纤维化。62 表达tcf21的心外膜细胞是心脏成纤维细胞的前体细胞。63 我们确实发现，在tcf21冷冻损伤网络（连接概率>0.995）中，Hif1ab的核心靶基因前20名里，与活性氧相关的基因本体（GO）术语（如“活性氧响应”）显著富集((p=0.015))（图S7D）。突变体中tcf21+细胞数量增加的一个可能解释是，hif1ab的缺失导致这些细胞中活性氧产生增多，从而促进了心外膜内的增殖。事实上，我们观察到损伤后7天（dpi）的突变体心脏伤口处心外膜增殖有升高的趋势，尽管差异不显著。由于已知斑马鱼心外膜细胞在损伤后3天（dpi）会强烈增殖，3,6 因此突变体心脏中大部分(tcf21+)细胞可能是在7天前通过增殖产生的。尽管如此，在现阶段我们仍不能排除其他机制的可能性，例如心外膜细胞的上皮-间质转化（EMT）增强，这也可能导致伤口处(tcf21+)细胞数量增加。

有趣的是，成纤维细胞中的活性氧（ROS）生成是由转化生长因子β（TGF-β）信号通路诱导的，且近期有研究报道，在肺纤维化小鼠模型中，NRF1对TGF-β具有负调控作用⁶⁶。事实上，在tcf21冷冻电镜网络((probability =0.96 ))中，Nrf1与TGF-β抑制因子Smad7之间的连接强度，与Nrf1和已知Nrf1靶基因（如Tfam⁶⁷ ((probability =0.94 ))以及(Tfb2m68)）之间的连接强度相当（概率=(0.99))）。在受损斑马鱼心脏中，TGF-β配体tgfb1在心外膜细胞和成纤维细胞中表达，而TGF-β信号通路在伤口处介导纤维化组织的沉积。22 有理由认为，在冷冻损伤后，nrf1 的缺失导致 (tcf21+) 心肌细胞中 TGF-β 信号通路过度激活，从而在突变体心脏中观察到了过度的纤维化现象。此外，仅实验条件下 (tcf21+) 细胞数量更多，也可能增加了伤口区域的纤维化组织沉积，因为我们发现冷冻损伤后心肌 (tcf21+) 细胞中表达了胶原蛋白以及 fn1a 等其他多种细胞外基质成分。

(tcf21+)细胞数量的增加或许也能解释突变体在22dpi时伤口区域覆盖的致密肌层增厚现象。心脏损伤后，心外膜细胞充当信号枢纽，通过视黄酸¹³和神经调节蛋白1⁶⁹等旁分泌因子刺激心肌细胞增殖⁶⁹。心脏损伤时，心外膜还会产生趋化因子Cxcl12a，该因子可引导心肌细胞迁移至伤口区域⁷⁰。未来还需进一步研究，明确在心脏损伤与再生的背景下，心外膜细胞数量的增加是否会促成有丝分裂信号增强，以及心肌细胞的增殖和迁移能力是否得到提升。

本研究基于心外膜基因表达和染色质可及性图谱，采用全基因组分析方法，构建、比较并对比了在胚胎发育和再生过程中特异性驱动心外膜遗传程序的基因调控网络。研究揭示了这些过程各自的差异调控机制，并提出心外膜发育这一较慢过程涉及一系列预先规划的协同事件；而损伤与再生则呈现出快速响应模式。因此，在这两个过程中，调控元件的定位、利用与占据情况存在差异。深入理解心外膜基因表达动态变化背后的基因调控机制，是开发能够诱导非再生哺乳动物心脏再生的治疗策略的关键。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。