标题：Disruptive CHD8 Mutations Define a Subtype of Autism Early in Development

期刊：cell

原文链接： http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.06.017

摘要

孤独症谱系障碍（ASD）是一种异质性疾病，通过行为学方法定义其亚型的努力收效甚微。我们推测基于遗传学的亚型识别可能更具成效，因此对3730名发育迟缓或孤独症谱系障碍患儿的孤独症谱系障碍相关基因CHD8进行了重测序。我们共鉴定出15个独立突变；而在8792名对照个体（包括2289名未受影响的兄弟姐妹）中，未发现任何截短型突变。除携带CHD8突变的患者极有可能被诊断为孤独症谱系障碍外，该群体还具有大头畸形、面部特征异常以及胃肠道不适等特征。斑马鱼中CHD8基因的破坏可重现人类表型的特征，包括因前脑/中脑扩张导致的头部体积增大，以及因有丝分裂后肠神经元减少而引起的胃肠动力障碍。神经元。我们的研究结果表明，CHD8 基因缺陷界定了一种独特的自闭症谱系障碍亚型，并揭示了大脑发育与肠道神经支配之间未被发现的共病关联。

引言

孤独症谱系障碍（ASD）是一种异质性疾病，具有显著的基因型和表型复杂性（Geschwind, 2009）。尽管已提出多种基于行为定义的亚型（美国精神病学协会，2000年；Wing和Gould，1979年），但这些亚型既未与遗传病因相关联，也未与治疗指征挂钩，且专业临床医生对其诊断也缺乏一致性（Lord等人，2012年）。事实上，随着向DSM-5的过渡，所有基于行为定义的亚型都被归入“孤独症谱系障碍”这一统称之下，以便识别与生物学机制更契合的亚型（美国精神病学协会，2013年）。孤独症谱系障碍的遗传病因同样具有多样性。已有超过100个基因和基因组区域与孤独症谱系障碍相关联（Betancur，2011年），且有超过800个基因被认为在其中发挥作用ASD（Iossifov 等人，2012；Neale 等人，2012；O’Roak 等人，2012b；Sanders 等人，2012）。鉴于解析行为异质性的效用有限，基因定义的亚型可能在阐明ASD的分子机制、部分ASD患者的病程与预后以及个体化治疗靶点方面更具价值。

此前已有患者突变的相关报道（O’Roak 等人，2012b）。b 无义突变（Ns）、移码突变（Fs）、剪接突变（Sp）、单氨基酸缺失突变（Aa）、剪接位点附近错义突变（Mns）、拷贝数变异（CNV）、重复突变（dup）。c 人类基因组变异序列（HGVS）。d 孤独症谱系障碍（ASD）、发育迟缓（DD）、智力障碍（ID）、注意缺陷多动障碍（ADHD）。

染色质解旋酶DNA结合蛋白8（CHD8）的严重破坏性突变与孤独症谱系障碍（ASD）相关，是特定亚型孤独症谱系障碍的潜在候选基因（O'Roak等人，2012b；Talkowski等人，2012；Neale等人，2012）。CHD8位于14q11.2区域，在染色质重塑过程中与β-连环蛋白结合（Thompson等人，2008），同时也是Wnt信号通路的潜在调控因子（Nishiyama等人，2012）。CHD8与多种儿童期罕见疾病相关；O'Roak等人（2012b）通过对西蒙单倍型集合（SSC）中209个先证者-父母三联体的外显子组测序，在孤独症患者中发现了两个散发性截短突变（Fischbach & Lord, 2010）。与此同时，对神经发育障碍患者的平衡染色体异常研究发现，一名孤独症谱系障碍患者的CHD8基因存在新型破坏（Talkowski等人，2012）。基于这些发现，Neale及其团队开展了病例对照分析，发现孤独症谱系障碍患者外显子组中破坏性突变的发生率偏高（共三例患者）（Neale等人，2012）。后续研究采用分子倒置探针（MIPs）对西蒙单倍型集合中2446名个体进行靶向测序，在8名CHD8基因存在复发性截短突变的个体中，有6名研究显示，携带CHD8突变的个体存在巨头症相关证据（O’Roak等人，2012b）。多项相互印证的研究因此表明，CHD8突变是孤独症谱系障碍（ASD）的重要风险因素。本研究旨在通过发现更多患者、开展广泛的表型-基因型关联分析，以及在斑马鱼发育过程中对截短突变进行建模，来明确CHD8突变是否定义了孤独症谱系障碍的特定亚型。

结果

患者与突变发现

此前，我们在西蒙斯 Simplex 集合（SSC）的2446名先证者中发现了9个新发突变，其中包括8个推定的功能丧失突变和1个框内氨基酸缺失（表1）。为扩大患者样本量并明确该表型与自闭症的特异性，我们选取了一组表型定义更广泛的发育迟缓患者。通过分子倒置探针（MIPs）技术，我们对另外3730名自闭症谱系障碍（ASD）或发育迟缓儿童的CHD8基因进行了重测序，验证出8个额外的潜在破坏性突变（表1及图1），其中包括3个移码突变、1个无义突变、1个氨基酸缺失突变以及3个剪接位点附近的错义突变。我们首先将6176例患者中发现的13个截短突变与SSC中2289名未受影响同胞组成的特征明确的对照队列进行对比；对未受影响同胞的CHD8基因进行测序后，未发现任何推定的破坏性突变。这一结果得出的病例-对照名义显著性p值为(p=0.0167)（费希尔精确检验）。为了扩展我们的分析，我们纳入了来自外显子组测序计划（http://evs.gs.washington.edu/EVS/）的额外6503名普通人群对照样本。尽管这些样本未针对神经精神疾病进行特异性筛选，但我们再次未在CHD8基因中发现任何额外的截短突变。结合这两组对照人群，我们将CHD8截短突变的显著性评估修正为(p=1.01 ×10^{-5})（费希尔精确检验，比值比为无穷大，95%置信区间为4.34至无穷大）（表S1）。

在可确定遗传方式的截短突变（无义突变、移码突变和经典剪接位点突变）中，绝大多数为新发突变（家系筛查中12例里有11例，占比92%；图1和表1）。作为病例-对照分析的补充，我们采用了源自人-黑猩猩固定差异和序列背景的概率模型（如O’Roak等人2012a年研究中所述），计算CHD8截化变异的零假设概率。在每位个体存在1.2个非同义编码变异的新发率下，我们估算出在6176例病例中检测到11个或更多CHD8新发截短事件的概率为(p=9.4 ×10^{-23})（二项检验）。这一结果具有统计学意义，因为即便假设我们筛查了全部20000个基因，该概率也超过了严格的全外显子组显著性临界值(2.5 ×10^{-6})。研究还发现该基因羧基末端存在两个靠近剪接位点的错义突变以及一个5千碱基对的拷贝数重复突变，这些均为遗传性突变（图S1，见在线资源；表1）。

在19584名人群对照中，未在该基因座观察到任何拷贝数变异（CNVs）。在CHD8的经典剪接位点附近检测到四种变异（三种错义变异：Nij07-06646、Leuven445853和Gecz4801，以及一种内含子变异：11654.p1）。我们使用Alamut 2.3（Interactive Biosoftware）评估了每种突变对剪接的潜在影响（Houdayer, 2011）。其中一种变异（11654.p1）破坏了内含子的经典剪接接受子信号，很可能会破坏剪接（图1B和表S2）。另外三种变异位于外显子序列中，属于剪接附近的错义变异。其中一种（Nij07-06646）影响外显子的最后一个碱基，预计会显著破坏局部剪接位点（图1B和表S2）；而另外两种（Leuven445853和Gecz4801）位于剪接连接点内侧两个碱基处，预计不会造成破坏（图1B和表S2）。在这方面，预计发生最严重经典剪接位点破坏的两例病例表现出与CHD8推定破坏性突变相关的特征，而两种不太可能破坏剪接的变异则为遗传所得（表2和表S5）。Leuven445853对应的较轻变异在临床表现上也更为轻微。我们还发现较轻微的突变更有可能从未受影响的父母那里遗传而来。级联检测显示，唯一遗传的严重突变（Nij07-06646）来自一位父亲，该父亲表现出与自闭症相关的类似行为障碍，头围较大，且存在反复的睡眠和胃肠道（GI）问题。

图1. 自闭症谱系障碍中CHD8突变的谱系，标注了突变位点。该基因的位置参见表S1、表S2及图S1。CHD8的模型与先证者的推测破坏性表达阵列探针用于图3（A和B）（A）基因亚型1和2，以及（B）蛋白质（A_24_P361167）在（A）中以红色标出。O’Roak等人，2012年a研究中的突变事件。红色标注的为新发现的突变。（*）智力障碍诊断（表1）。蓝色标注的为此前已报道的突变（Neale等人，2012年；

临床表型

我们重新联系了8名CHD8患者及其家属，以进行结构化临床评估、病历审查和畸形学评估（图2）。其中包括来自西蒙斯 Simplex 收集（SSC）的3个家庭（O’Roak 等人，2012b），以及通过对自闭症谱系障碍（ASD）和发育迟缓患者进行孟德尔疾病整合分析（MIP）筛查发现的5名新患者。我们整合了这些发现，并为所有可联系到的家庭生成了临床报告，最终对15名携带潜在破坏性突变的个体患者进行了表型描述（表2和表S5）。

ASD 是我们研究队列中观察到的最常见诊断。在被评估的15名确诊个体中，13人符合ASD的严格诊断标准；1人为疑似患有精神病性障碍的成年人，1人被诊断为注意缺陷多动障碍（ADHD）且存在边缘智力功能。在9名采用金标准诊断工具接受正式、标准化ASD评估的儿童中，所有人在孤独症诊断观察量表（ADOS）和孤独症诊断访谈量表（ADI）上均符合孤独症障碍的诊断标准。通过校准严重度评分（Gotham等人，2009年）测量的ASD严重度处于诊断范围内（均值(CSS=6.8)、(SD=1.3)），这凸显了诊断的可信度。即便是仅因发育迟缓转诊的患者，随访结果也显示大多数人患有ASD或存在ASD症状（表1）。总体而言，至少87%、甚至可能93%的患者被诊断为ASD，这为CHD8的破坏性突变与ASD高度相关且可能具有特异性提供了证据。

尽管患者年龄在4至41岁之间不等，但我们观察到他们的面部特征存在显著相似性（图2A）。主要特征包括枕额围度增大、眉弓突出、眼距宽且睑裂下斜、鼻宽且鼻尖饱满、下巴尖。其他反复出现的身体特征还包括身材瘦高、足大且扁平，已有多篇文献报道过此类个体的相关情况（表S5）。80%的病例在检测时或发育早期均存在巨头症（枕额围度(z>2.0)）。本病例系列队列中观察到的巨头症发生率，显著高于无CHD8突变的西蒙斯 Simplex 自闭症联盟（SSC）自闭症谱系障碍（ASD）儿童（360/2564，Fisher精确检验，(p=2.1 ×10^{-8})）。14%）。参考样本的使用引发了关于这些数据在建立个体OFC标准分数方面实用性的讨论（Chaste等人，2013年）。在确定个体相对头部大小时，有几个重要因素需要考虑。在本病例系列中，与SSC中未携带CHD8突变的自闭症谱系障碍（ASD）患者相比，本研究对象的头部尺寸更大，且这一特征与身高、年龄以及父母平均头围均无关，(F(1,2639)=4.79)、(p=0.029)、科恩系数(d=3.10)（基于估计边际均值的大效应量）。

我们获取了两名患者的头围增长速度数据（图2B）。这些轨迹的特征是出生后前2个月额眶部头部生长显著，随后在整个幼儿期持续保持头部大幅增长，且数值处于或高于第97百分位，从而凸显了CHD8表型这一特征的外显率。与此可能相关的是，本病例系列在分娩和生产过程方面呈现出一定的模式。六名患者（40%）接受了引产和催产，剖宫产也较为常见，有五名患者（33%）为剖宫产分娩。

12名患者（80%）出现了明显的胃肠道问题，其中60%存在反复且持续的便秘特异性症状。护理人员通常反映患者长期存在胃肠道功能紊乱，表现为严重便秘阶段后出现稀便或腹泻。本病例系列中家长报告的便秘发生率显著更高（费希尔精确检验，(p=0.006)），相较于西蒙斯 Simplex 集合（SSC）中无CHD8突变的自闭症谱系障碍（ASD）儿童的家长报告便秘率。在SSC的2630名无CHD8突变儿童中，有693名儿童的家长报告存在便秘问题（占比26%），而本研究队列的这一比例为60%。

睡眠问题频发。10名患者（67%）存在某种类型的睡眠问题，其中7名（44%）明确表现为入睡困难。2名患者的睡眠障碍极为严重，其子女可连续数日不眠。不过，这一比例尚未超过无CHD8突变的自闭症谱系障碍（ASD）儿童（60%；费希尔精确检验，(p=0.75)），且有证据表明，该症状会随年龄增长而有所缓解。另一项复发性研究发现为认知障碍。该队列人群的认知能力从重度残疾到与年龄相符不等；然而，没有一名患者的智商高于平均水平。9名患者合并诊断为智力障碍，这些儿童均在认知方面存在障碍具有主动性和适应能力。此外，其中两名儿童的认知表现处于边缘智力功能范围。

CHD8 在发育过程中的表达

鉴于 CHD8 在大脑发育过程中可能具有重要作用，我们基于现有的微阵列和 RNA 测序数据确定了其时空表达谱（Shen 等人，2012 年）。该基因广泛表达于成年和发育中的人类、猕猴以及小鼠的大脑中，遍布皮质和皮质下结构，包括新皮质、海马体、杏仁核和纹状体（图 S2、图 S3A 和图 S3B）。其表达在产前早期（受孕后 9-16 周）达到峰值，并在人类（图 3A）和猕猴（图 S3A）的胎儿及产后发育阶段逐渐降低。CHD8 在人类胎儿中期（受孕后 15-21 周）的新皮质中，也广泛表达于祖细胞层和有丝分裂后细胞层，在受孕后 15 和 16 周时可能在中间带存在富集（图 3B），但在受孕后 21 周时无此现象（数据未显示）。这一表达模式与已知的 CHD8 结合蛋白 CHD7 形成对比（图 3A），CHD7 主要表达于神经祖细胞层（室管膜区和室管膜下区；图 3C）。在发育中的猕猴皮质中，CHD8 未表现出明确的层状富集特征（图 S3B）。

我们利用从BrainSpan图谱（http://www.brainspan.org/）获得的RNA测序数据，寻找人类大脑发育过程中共表达时间模式相似的基因。我们鉴定出172个具有显著共表达关系的基因（图S2B），其中9个基因（SETD2、MLL5、ADNP、POGZ、ARID1B、PHF2、DYRK1A、SUV420H1、MBD5）此前有研究报道为自闭症先证者中从头截短突变的位点（Iossifov等人，2012；Neale等人，2012；O’Roak等人，2012a、2012b；Sanders等人，2012）（表S3）。事实上，与CHD8相关性最强的基因为组蛋白甲基转移酶SETD2，该基因与表观遗传转录激活和染色质调控相关（Simon等人，2014）。总体而言，我们发现CHD8共表达基因集中自闭症候选基因存在显著富集（基因集的95%置信区间为0.9）。随着相关性阈值的提高，这种富集现象会更加显著（在相关性阈值达到95%时，富集结果如图S2C和图S2D所示）。

为了在CHD8时空表达富集的组织中特异性鉴定与CHD8共表达的基因（图3B），我们开展了组织特异性共表达分析。首先，通过微阵列（Affymetrix探针A_24_P361167；图1A）评估了中胎期人类（15-21孕周）新皮质各层中CHD8的表达水平。在所有皮质层中，共有282个基因的表达与CHD8表达至少呈中度相关((r>0.5))。其中，282个基因中有144个在从产前早期到成年期的整个过程中，其新皮质表达与CHD8也呈高度相关((r>0.85))。经基因本体富集分析证实，这144个在产前高表达且在中胎期各层广泛表达的基因，与染色质修饰和转录调控显著相关（数据未显示）。部分相关性最高的时间相关基因（相关系数((r>)＞0.9；(p<1 ×10^{-16})；表S4）包括NAV1、MLL、ARID1A。RPRD2 以及 ZNF462（图 S2D）。在这些基因中，NAV1 和 MLL 均被鉴定为自闭症先证者的突变位点（Jiang 等人，2013；O'Roak 等人，2012b）（图 S2B 和表 S3）。

图2. CHD8表型的生理特征。（A）与CHD8相关的面部表型。患者11654.p1（左上）、14016.p1（中上）和Nij023486（右上）均表现为巨头畸形、眼距过宽、睑裂下斜、宽鼻、尖下巴以及宽额头且眉弓突出。患者12991.p1（左下）前额高、眼距过宽、耳朵大、耳垂肥厚，且有巨头畸形病史（12岁时）。患者Troina2659（中下）无眼距过宽症状，但存在巨头畸形、睑裂下斜、眉弓突出和尖下巴的表现，其他身体特征包括后斜头畸形。患者Troina2037（右下）表现为巨头畸形、眼距过宽、睑裂下斜、眉弓突出、耳朵大且耳垂肥厚上翻、嘴唇肥厚饱满，其他身体特征包括通过CT扫描观察到的颅穹窿增宽。（B）CHD8患者的头围纵向变化。对患者14016.p1（红色）和APP_109580-100（蓝色）的标准化头围数值分析显示，二者出生后前2个月额眶部头部生长显著加快，随后在整个幼儿期，头围持续偏大，始终处于或超过第97百分位。

图3. CHD8的正常表达。(A) 正常尸检个体从受孕后8周（pcw）至104周（2岁）期间，背外侧前额叶皮层（DFC，左侧）和后腹侧（下）顶叶皮层（IPC，右侧）中CHD8（红色）和CHD7（黑色）的每千碱基每百万标准化表达值。灰色高亮部分为出生前胎儿大脑中的表达情况。(B和C) 热图显示受孕后15周（左侧）和16周（右侧）中间区（IZ）中CHD8（B）或CHD7（C）的局部表达情况。红色表示表达升高，白色表示无表达。皮层样本按脑叶（f，额叶；p，顶叶；t，颞叶；o，枕叶）在列中排列，并按发育中新皮层从基底到顶侧的皮层在行中排列（SG，丘脑上膝状核；MZ，边缘区；CPo，皮层外板；CPi，皮层内板；SP，亚板区；SZo，室外侧亚脑室区；SZi，室内侧亚脑室区；VZ，脑室区）。在各脑叶内，样本大致从前侧到后侧排列。a1，初级听觉皮层；dl，背外侧前额叶皮层；dm-f，背内侧额叶皮层；dm-o，背内侧纹外皮层；dm-p，背内侧顶叶皮层（7m区）；fp，额极皮层；il，下外侧颞叶皮层；lt，外侧颞枕皮层；m1，后额叶皮层（运动皮层）；mi-t，中下颞叶皮层；ml，中外侧纹外皮层；mt，内侧颞枕皮层；or，眶额叶皮层；pd，后上[背侧]顶叶皮层；ph，后海马旁皮层；pv，后下[腹侧]顶叶皮层；s1，初级躯体感觉皮层；sl，上外侧颞叶皮层；t36，[前侧]中下颞叶皮层[36区]；tf，尾侧中下颞叶皮层[TF区]；tp，颞极皮层；v1，初级视觉皮层；vl，腹外侧前额叶皮层；vm，腹内侧纹外皮层。(D) CHD8与9个在孤独症谱系障碍（ASD）先证者中携带截短突变的基因共表达((n=133)（红色，左侧），以及1个在未受影响的兄弟姐妹和对照组中携带破坏性突变的基因((n=58)（蓝色，右侧）（Gulsuner等人，2013；Rauch等人，2012），皮尔逊相关系数为(r>0.9)（黑色虚线）。为进行对比，抽样了100,000组相同大小的随机基因集(= 133)（左侧）；(n=58)（右侧）。直方图显示每个随机集中与CHD8共表达的基因数量。研究发现，与未受影响的兄弟姐妹和对照组（无显著差异((p=0.37))）相比，CHD8与ASD先证者中被报道为新发截短突变位点的基因共表达的数量显著更高((p<)、(1 x 10)。另见图S2、图S3及表S3、表S4。

斑马鱼模型构建

我们同样评估了chd8在斑马鱼发育过程中的表达模式。我们设计了四种反义探针在基因全长上每1.5千碱基对（kbp）进行检测，并通过原位杂交评估其表达情况。我们发现，chd8信使RNA（mRNA）被母源性地沉积到受精卵中，并在体节形成早期持续广泛表达（图4A）。在受精后1天（dpf），chd8 mRNA开始在大脑和脊髓中富集，随后在胚胎发育的3-4天，其表达逐渐局限于头部和肠道区域。由于CHD8蛋白高度在斑马鱼和人类中均保守（图S4A），我们以斑马鱼为模型系统抑制内源性chd8，探究这是否会改变大脑发育并重现人类表型的某些方面。

图4. chd8 基因敲低会导致斑马鱼发育过程中前脑/中脑标记基因出现异位表达。图中展示了注射 chd8-MO1-4 前后多种标记基因的原位杂交结果。

首先，我们设计了两种靶向斑马鱼chd8同源基因两个外显子-内含子连接区的剪接阻断吗啉代寡核苷酸（MO1和MO2）（图4B）。RT-PCR和Sanger测序证实，该吗啉代设计可使正常剪接效率降低超过80%，导致两个不同外显子相邻的内含子被保留，同时使Chd8蛋白在第604位和第643位氨基酸处发生截短（图4B）。为了研究chd8基因敲低对头部发育的影响，我们首先测量了4.3天龄斑马鱼眼球凸端之间的距离（眼间距），以此作为头部大小的替代指标（Golzio等人，2012）。注射4纳克MO1或MO2会使50个吗啉代处理胚胎的平均眼距显著增加，提示头部过度生长（图4C）。重要的是，该表型未伴随明显的发育异常；与对照组相比，吗啉代注射的胚胎鳔发育正常（数据未显示），且我们未发现体长（图S4B）或体节间距（图S4C）存在显著变化。

为了确定CHD8敲低胚胎中较大的头部尺寸是否伴随脑容量增加，我们对注射了MO1和MO2的胚胎进行了抗乙酰化微管蛋白免疫染色（用于标记轴突束），结果显示与对照组相比，视顶盖之间的平均距离显著增加（(p<0.0001) 图4D）。通过对野生型、注射MO1或MO2的胚胎进行原位杂交的标志物分析，进一步证实了这些观察结果。在盾状期，CHD8敲低胚胎表现出以背侧组织者标记物chordin为特征的背侧组织者扩张，这表明CHD8的破坏促进背侧（神经元）发育（图4E和图4I）。在尾芽阶段，中脑/前脑神经元前体细胞早期标记物otx2的表达在chd8敲低胚胎中上调，这与其在神经元发育中的作用一致（图4F和图4J）。在受精后24小时（hpf），我们观察到丘脑前体区域的dlx2染色显著增加，而端脑区域无此变化（图4G、图4K和图4L）。此外，我们测量了以pax2.1染色标记的包含前脑和中脑的头部区域大小，发现前脑/中脑区域出现增大（图4H和图4M）。相比之下，端脑/眼睛（pax6）和后脑（krox20）的标记物未观察到显著变化（图S6）。

尽管巨头畸形并非MO毒性的典型副作用，但我们希望进一步探究实验结果的特异性。全长人类CHD8信使RNA（mRNA）分子过大，难以通过足量的体外转录完成拯救实验，因此我们开展了一系列额外实验。首先，我们证实头部大小缺陷具有剂量依赖性（图S4D）。我们设计了另外两种不重叠的剪接阻断型MO（MO3、MO4），经逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）验证，它们分别破坏了第7和第8外显子的剪接供体位点（图4B、图S4E）。注射这两种MO均重现了巨头畸形表型（图4C、图4D）。作为对表型特异性的最终验证，我们通过成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统在chd8基因的第2外显子处诱导微缺失（Hwang等人，2013；Jao等人，2013）（图S5A），并通过T7核酸内切酶I酶切实验（图S5B）和单分子实时（SMRT）DNA测序（图S5C），验证了50%注射胚胎（F0代奠基者）中存在基因编辑。我们设计了针对chd8基因和tyr基因（编码酪氨酸酶）的向导信使RNA（gRNA），tyr基因突变会导致色素缺失（Jao等人，2013）。我们将向导RNA与体外转录、加帽且带有多聚腺苷酸尾的nls-zCas9-nls RNA注射到单细胞期胚胎中，由两名研究人员重复进行了该操作研究人员随后在受精后5天（5 dpf）对注射混合物不知情的情况下进行表型分析，不仅在两批胚胎中分别有70%和80%的胚胎出现了镶嵌性色素减退表型，还重现了四种chd8吗啉反义寡核苷酸（MO）均出现的头部大小缺陷（((p<0.0001))）；对70个CRISPR/Cas9注射胚胎和32个假注射对照组的眼间距进行客观测量显示，两批胚胎的眼间距平均均增加了17%（图S5D和S5E）。我们注意到，无法确定每个胚胎中有多少细胞携带Cas-9诱导的chd8小片段插入缺失（indels），也无法确定突变细胞是纯合子还是杂合子。然而，我们在人类患者中未发现任何纯合子CHD8突变，这与Chd8基因敲除小鼠模型中观察到的胚胎致死现象一致（Nishiyama等人，2012）。更重要的是，注射动物的表型与携带CHD8突变的人类及吗啉反义寡核苷酸敲低模型的表型一致，且在对照组（未诱导chd8突变的向导RNA和酪氨酸酶（tyr）突变体）中未出现此类表型，这支持了CHD8功能丧失导致巨头症的解释。这些数据与患者中观察到的巨头症和眼距过宽症状一致，进一步证明CHD8在人类和斑马鱼的发育过程中均调控大脑生长，发挥保守作用。

图5.微量管饲法分析胃肠道运动

由于在具有破坏性CHD8突变的患者中报告了频繁的GI投诉，我们还检查了chd8中断在后肠发育过程中可能产生的影响。为了测试chd8的抑制是否会影响GI运动，我们进行了既定的微管饲试验（Cocchiaro和Rawls，2013）。我们通过将荧光微球注射到肠前球并跟踪微球在不同时间点的运动来灌胃Sham-、chd8 MO3-和MO4注射的幼虫((n=25))（n=25）。我们通过定义沿GI道的四个转运区（Field et al.，2009）并在灌胃后3和6小时对活幼虫中微球的更多嘴侧位置进行评分来评估GI运动（图5A）。与假注射胚胎相比，我们观察到chd8形态（MO3和MO4）的微球沿GI道的进展在灌胃后3小时显着延迟（图5B）。引人注目的是，假注射胚胎在灌胃后3小时在第2区没有明显的珠子，5/19和9/21胚胎注射了MO3和MO4，分别在2区有微球（((p=6.3 ×10^{-4})和(p=1.1 ×10^{-5})分别为chd8-MO3和chd8-MO4；图5B）。6小时后动力下降仍然突出；而26/27假注射胚胎在2-4区没有微球，9/19和13/21 MO注射胚胎在2-4区有微球((p=0.00854)和(p=2.4 ×10^{-6})分别为chd8-MO3和chd8-MO4；图5B）。

GI运动由肠神经元控制——神经冠衍生的细胞，形成肠神经系统，并从尾部后脑广泛迁移到整个GI道（Ciment和Weston，1983年）。为了调查chd8形态中观察到的运动缺陷的原因，我们测试了chd8的破坏是否会影响GI道的神经元定植。我们用抗HuC/D单克隆抗体（一种有丝分裂后神经元的标记）对注射了MO3或MO4的胚胎进行染色；以前的研究表明，肠神经元对HuC和HuD都是阳性的（也称为ELAVL3和ELAVL4；D'Autre'aux et al.，2007）。在6 dpf（每个条件60个幼虫，重复三次，由两名研究人员盲法评分）对MO-注射胚胎的掩蔽定性评分显示，与对照组相比，40%-60%的胚胎的HuC/D+细胞数量减少((p<0.0001)图5C和5D）。此外，我们通过计算在一部分形态和对照组（每个条件20个幼虫）中殖民后肠的肠神经元数量进行定量评分；我们观察到形态中平均144个HuC/D+细胞，而对照组平均为278个((p=0.0026))，表明chd8形态中存在于后肠的肠神经元数量与对照组相比平均减少了50%。与我们对头部大小的观察类似，这种表型可能以MO剂量依赖性方式加剧，并由MO1和MO2复制（图5E），提供特异性的证据。最后，对我们的CRISPRchd8胚胎进行染色（根据头部大小和色素沉着缺陷进行现场评分）显示肠道神经元显著减少（(p<0.0002)图S5F和S5G）。综上所述，我们的数据表明，在我们的CHD8截断突变患者中，胃肠道问题（便秘发作后大便稀疏）可能至少部分是由于肠道神经元对胃肠道的殖民减少，这预计会导致动力受损。

讨论

我们的研究结果表明，CHD8 基因破坏是自闭症谱系障碍（ASD）发生发展中的一条特定通路，并界定了一种独特的自闭症谱系障碍亚型。其常见表型特征包括头围增大并伴随出生后早期快速生长；面部表型表现为前额突出、双眼间距宽、下巴尖；同时胃肠道症状发生率升高且睡眠功能障碍显著。其中，与未携带 CHD8 突变的其他自闭症谱系障碍患者相比，面部特征、巨头症以及胃肠道症状（便秘）表现最为显著。巨头症与自闭症谱系障碍的关联并非首次在遗传定义的亚组中被报道。PTEN 基因突变与重度巨头症及自闭症谱系障碍相关（Butler 等人，2005 年），16p11.2 缺失拷贝数变异（CNV）亦是如此，后续研究通过改变斑马鱼胚胎中 KCTD13 基因的剂量模拟了这一变异（Golzio 等人，2012 年）。我们认为，无论遗传背景存在何种差异，这一系列症状均是该遗传定义亚型自闭症谱系障碍所特有的。值得注意的是，自闭症谱系障碍诊断的特异性也十分突出：我们对范围更广的发育迟缓患者进行筛查，发现了四名患者，其中三名后续可被临床归类为自闭症谱系障碍。大多数截短突变为新发突变且与自闭症谱系障碍相关，在 8792 名对照个体中未检测到任何截短突变。这些发现与 CHD8 突变与自闭症强烈关联的结论一致（比值比=无穷大，95%置信区间 (C.I. =4.35-ln f)）。其他与自闭症谱系障碍强相关的事件，如 16p11.2 位点的拷贝数变异（Weiss 等人，2008 年），在更广泛的筛查范围内（如 Simons Vip 联盟，2012 年）时，其临床表型存在显著的变异性。

本研究实现了将基因型优先方法应用于自闭症谱系障碍（ASD）的研究（Hennekam 与 Biesecker，2012 年；Schulze 与 McMahon，2004 年；Stessman 等人，2014 年）。尽管本研究需对6176名自闭症和发育迟缓患者进行靶向重测序，才筛选出15名携带严重截短突变的患者，但对这一小部分患者进行临床随访和详细表型分析至关重要。在ASD临床诊疗场景中，患者的遗传和非遗传病因多样，这些特定但相对细微的表型特征很容易被忽视。由共同遗传病因关联的患者，可能成为区分该疾病亚型的更优分类依据。此外，对更大规模的CHD8患者群体进行纵向研究，或许还能发现更多临床特征。例如，我们注意到一名女性患者表现出性早熟、巨头畸形和智力障碍的症状，这与此前报道的一名易位患者的表型高度相似（Talkowski 等人，2012 年）。同样，我们的两名40岁以上患者均出现了肿瘤相关症状。具体而言，患者Nij0706646的父亲在42岁时被确诊为直肠癌，后因直肠癌转移并发症去世。已有研究表明，CHD8参与胃癌的细胞周期调控，且与十种不同的胃癌/结直肠癌相关（Kim 等人，2011 年）。对101名胃癌患者的样本分析发现，癌组织中CHD8的表达水平低于健康组织；此外，进一步干扰CHD8的表达会导致癌细胞系增殖能力增强，这表明CHD8 表达的缺失可能是胃癌的一种新型标志物（Sawada 等人，2013）。这表明对 CHD8 自闭症谱系障碍队列进行纵向研究以发现结直肠癌的早期迹象可能具有重要意义。

多项证据表明，CHD8 基因的破坏会导致正常神经元发育出现缺陷。在多种生物中，发育中的大脑在出生前的表达水平最高。在人类中，新皮质的有丝分裂后层在胎儿发育中期（孕15至16周）达到表达峰值。在孕21周时，室管膜下区和室管膜层的表达量出现更显著的上升，这两个区域包含了大量神经元前体细胞。 CHD8 基因敲低的斑马鱼重现了巨头症表型（体积增大10%至15%），同时出现胃肠道运动障碍，这与患者的肠道运动缺陷症状相似。值得注意的是，这些表型并未伴随 CHD8 基因敲低胚胎发育的整体提前或延迟，说明该影响具有特异性。 早期胚胎神经元发育的标志物分析显示，头部过度生长主要由前脑/中脑扩张驱动，这可能是这些区域神经元祖细胞过度增殖所致。值得一提的是，在 CHD8 基因敲低的斑马鱼前脑区域，dlx2 基因的表达在丘脑前区有所增强，但在端脑区无此变化，表明这种过度生长表型具有高度组织特异性。 抗体染色结果显示，这些基因敲低个体的肠神经元数量减少，这提示其发育过程中神经丛的增殖或定植存在缺陷。这些研究结果与 CHD8 作为调控细胞增殖的主要转录调控因子的作用相符，也与它和 CHARGE 综合征等其他神经发育障碍的关联一致（Vissers 等人，2004）。 CHARGE 综合征是一种常染色体显性遗传病，其特征为虹膜缺损、心脏缺陷、后鼻孔闭锁、生长发育迟缓、生殖器发育不全、耳部异常及耳聋（Hittner 等人，1979；Pagon 等人，1981）。此前已有研究表明，CHD8 可与 CHD7 结合，而 CHD7 基因突变是 CHARGE 综合征的主要致病原因，因此 CHD8 也被认为与该综合征相关（Batsukh 等人，2010）。

最后，将本研究范式应用于其他与自闭症谱系障碍相关的基因（尤其关注共病情况），或许能为将自闭症谱系障碍划分为不同临床亚型提供契机。这不仅能指导诊断与管理工作，还能为未来临床试验的基因型分层提供依据，并可作为非行为学终点来验证治疗效果。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。