标题：A simple and scalable zebrafish model of Sonic hedgehog medulloblastoma

期刊：Cell Reports

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114559

摘要

髓母细胞瘤（MB）是儿童最常见的恶性脑肿瘤，可分为三大主要亚型。 sonic hedgehog（SHH）亚型占所有髓母细胞瘤病例的30%，其患者的生存差异与TP53基因状态密切相关。本研究利用CRISPR技术构建突变体ptch1基因的斑马鱼模型，模拟人类SHH型髓母细胞瘤的主要遗传驱动因素。在该模型动物中，小脑会快速形成肿瘤，且其组织学特征和肿瘤基因组学特征与人类SHH型髓母细胞瘤高度相似。与人类患者情况一致，同时存在ptch1和tp53基因缺失的髓母细胞瘤具有侵袭性的组织学特征，且患者的生存结局显著恶化。ptch1-CRISPR突变体髓母细胞瘤模型具有操作简便、可规模化的特点，非常适用于基于CRISPR的基因编辑筛选研究，以筛选出体内SHH型髓母细胞瘤发生所必需的基因。本研究鉴定出编码Grk3激酶的基因为此类关键靶基因之一。

引言

髓母细胞瘤（MB）是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，通常在1岁左右被确诊发病于1至9岁，但也可能出现在青少年和成年人身上MB出现在小脑，通常表现为共济失调、运动技能受损和视力问题的症状。根据诊断时肿瘤细胞中是否存在特定的驱动突变和/或基因特征，MB目前分为三种主要类型：无翼（WNT）、音速刺猬（SHH）和非WNT/非SHH（以前称为第3组和第4组）。后两个亚组的总生存率较差（42%-88%）与WNT亚组（97%-100%）相比。

SHH MB最常见的遗传改变是PTCH1的丢失/突变，42%的病例中发现了PTCH1WNT MB肿瘤在诊断时经常表现出TP53突变特别是SHH MB患者，在TP53突变和标准放疗和化疗方案中MYC/MYCN扩增后，总存活率急剧下降（TP53野生型存活率为76%-86%；TP53突变体存活率为32%-50%），3,5因此促使世卫组织指定更积极的治疗这些患者的治疗方案。

SHH MB在基因组水平上有很好的特征，肿瘤发生的明显驱动因素来自激活SHH信号通路的突变。在正常胚胎发育过程中，当配体SHH与跨膜受体贴片1（PTCH1）结合时，规范的SHH通路被激活。PTCH1是G蛋白偶联受体Smoothed（SMO）的负调节因子。因此，SHH通过灭活PTCH1间接激活SMO。活性SMO直接结合并抑制蛋白激酶A（PKA）的催化亚基，PKA通常通过磷酸化和失活GLI转录因子来抑制SHH通路信号。在没有SMO活性的情况下，融合（SUFU）的抑制子与GLI转录因子结合并阻止它们的激活。GLI蛋白有三种：GLI1，一种转录激活因子，在SHH激活时产生GLI2和GLI3的通路，两者都充当转录-14依赖于通路激活的抑制物或激活物。在没有SHH信号的情况下，GLI2和GLI3的蛋白酶体降解会导致SHH靶基因的抑制。然而，当SHH激活SMO时，GLI2/3从抑制物转化为激活物形式，使它们能够转活SHH通路靶genesthatregulateCNSpolarityandneuralpatterning.15InMB，灭活PTCH1或SUFU中的突变或激活SMO或GLI2中的突变促进SHH通路的组成性激活，导致增生和肿瘤发生。

MB患儿的一线治疗包括肿瘤切除、放疗和细胞毒性化疗，这会导致对发育中的大脑的毁灭性后果由于耐药性的发展，SHH MB，通过靶向SMO或下游GLI转录因子对SHH通路的药理学抑制一直具有挑战性。耐药性通常发生在SMO或下游效应物中的二次突变中，二次突变重新激活SHH通路，或者致癌程序切换到替代信号通路，如PI3K（phosphatidylinositol3-激酶）。此外，许多潜在的替代疗法由于无法跨越血脑屏障而疗效有限。因此，目前的疗法在改善患者的长期预后方面仍然无效，大多数TP53突变的SHH MB患者最终死于他们的疾病。

已经开发了许多SHH MB小鼠模型，以更好地了解SHH MB的病因，评估靶向疗法的反应，并确定治疗利用的额外信号通路，但目前的治疗方案仍然不太理想。改善治疗策略和患者结果的努力可能需要大规模识别新的治疗靶点，并使用可扩展的动物模型系统（如斑马鱼）分析组合疗法。

在这里，我们建立了SHH通路驱动的MB的斑马鱼模型。斑马鱼中ptch1基因的瞬时CRISPR-Cas9-mediated基因敲除导致在细胞和基因组水平上类似于SHH MB的肿瘤的快速发展。与人类类似，与ptch1损失相结合的tp53突变会产生更具侵袭性的肿瘤，并且与单独的ptch1损失相比，总生存率会降低。为了测试在该模型中使用多路复用CRISPR29来识别SHH MB的新治疗靶点的潜力，我们注射了结合ptch1和grk3引导RNA（gRNA）的斑马鱼胚胎。Grk3是斑马鱼同人事实上，grk3的损失显著改善了ptch1-脆动物的生存，表明GRK2/3代表了SHH MB有前途的新治疗靶点。为了测试这一概念，我们使用哺乳动物SHH MB细胞模型来表明GRK2/3的药理学抑制显著抑制了通路活性和细胞活力。我们的数据提供了一个平台，用于使用体内斑马鱼MB模型与基于初级哺乳动物MB细胞的模型相结合的高可扩展性和低成本，用于快速识别新的治疗靶点和最具侵略性的MB亚组的组合治疗。

结果

短暂的ptch1-脆斑马鱼发展成脑瘤

为了确定ptch1丢失是否促进斑马鱼的肿瘤发生，我们使用CRISPR-Cas9-mediated基因编辑敲除ptch1。斑马鱼Ptch1蛋白与人类PTCH1显示73%的同一性，由其跨膜区域的甾醇敏感结构域以及配体识别所需的两个胞外结构域组成（图1A）。因此，我们设计了gRNA来靶向ptch1基因的第一个胞外结构域和C末端结构域（gRNA#1和#2，分别；见图1A）。我们将一种或两种ptch1 gRNA注射到单细胞阶段野生型AB胚胎中，通过CRISPR测序确认ptch1基因被破坏（图1B和1C），随后监测它们的肿瘤形成。使用ptch1单次和双次注射gRNA（称为ptch1脆片）的鱼受精后3-4周（wpf）明显出现脑突起，76%的注射动物在150天内表现出明显的肿瘤和循环游泳行为（图1D和1E）。脑突起的H&E染色显示细胞nuclear-to-cytoplasmic率高，且几乎不存在的细胞质和深染细胞核提示胚胎性肿瘤（或蓝圆细胞肿瘤，图1E）。在38只5至8周龄的ptch1基因编辑阳性肿瘤动物中，有25只的至少一只眼睛出现了更小的瞳孔大小（图1F），这与之前的研究报告一致，这些报告表明ptch1基因对视泡发育是必需的。存活率显著与单个 ptch1 基因敲除动物相比，双基因敲除 ptch1 动物中的相关指标显著降低（图1G）。这些数据表明，ptch1 是斑马鱼脑肿瘤形成过程中一个保守的肿瘤抑制基因。

图1.短暂的ptch1脆饼发展成脑瘤

tp53基因缺失促进斑马鱼暂时性ptch1基因编辑crispant脑肿瘤的侵袭性

在携带种系 Ptch1 突变或体细胞 Ptch1 破坏的小鼠模型中，Tp53 缺失会加速肿瘤的发生率和发病时间。为了确定 Tp53 是否作为肿瘤抑制为了在斑马鱼ptch1基因crispant中验证该抑制因子，我们将一条或两条ptch1向导RNA（gRNAs）注射到杂合tp53突变成年鱼((t p 53^{M 214 K /+})^{37})杂交产生的单细胞阶段胚胎中，随后监测其肿瘤形成情况与存活情况。研究发现，tp53基因的缺失会显著降低单次和两次注射ptch1-gRNA的动物的存活率（图2A和图2B），这与同时存在TP53突变的人类SHH髓母细胞瘤患者以及哺乳动物模型系统中观察到的存活率下降结果一致。ptch1-crispant; tp53模型中的肿瘤外显率取决于所使用的向导RNA数量（单次或两次）以及向导RNA的剂量（12.5–25毫摩尔），而在使用最大剂量向导RNA时，肿瘤外显率可达92%。tp53突变体介导的存活率下降还与侵袭性组织病理学特征相关，因为这些肿瘤中存在体积更大的肿瘤细胞，且细胞核塑形现象更为明显（图2C和图S1A；表S1）。

图2. tp53突变促进ptch1基因编辑斑马鱼脑肿瘤的侵袭性 （A和B）将来自指定遗传背景的斑马鱼在单细胞阶段注射ptch1向导RNA #1和#2（A）或仅注射ptch1向导RNA #1（B），并分析注射后的存活率。x轴上的箭头头表示存活率分析的开始。每组动物的总数标注在右侧。除tp53突变条件外，数据均来自单次实验；tp53突变条件下需合并多次实验的数据以获得足够数量的动物。实验至少重复两次。采用Mantel-Cox检验计算统计学显著性。*** (****p<0.0001) （C）（左）将指定遗传背景的斑马鱼在单细胞阶段仅注射ptch1向导RNA #1或同时注射ptch1向导RNA #1和#2，展示6-12周龄（wpf）动物的明场图像。（中和右）经H&E染色的对照组脑组织或ptch1基因编辑斑马鱼脑肿瘤的矢状切片。左图中白色箭头头指示肿瘤位置。右下侧黑色箭头头指示核异型更明显的大型肿瘤细胞。中间的白色方框在右侧以更高放大倍数展示。中间的黑色虚线指示小脑。另见图S1和表S1。

成年生殖系ptch1突变体可诱发脑肿瘤

为了独立验证ptch1基因的缺失会导致斑马鱼患上脑肿瘤，Wen接下来检测了ptch1基因的种系缺失是否也会引发脑肿瘤。由于瞬时ptch1基因crispr编辑的成年斑马鱼寿命较短且健康状况受损（图1），我们无法通过现有的ptch1基因crispr编辑技术建立稳定的品系。因此，我们获取并分析了一个先前已构建的ptch1tj222品系，该品系在590位氨基酸处存在一个提前终止密码子（图1A和图3），此前主要对其进行了相关研究。(ptch19222) 位点的大部分纯合子在发育早期死亡；然而，我们在 (ptch1 1^{1 / 222}) 杂合子自交的后代中，从 147 只成鱼里鉴定出 4 只纯合突变存活个体（按照正常孟德尔比例预期应出现 37 只纯合子）。这 4 只纯合突变体均在形态学水平上形成了与 ptch1 基因编辑嵌合体相似的脑瘤，且成瘤能力与 tp53 基因状态无关（图 3A）。对生殖系 ptch1 敲除等位基因的分析支持了以下结论：ptch1 基因的缺失是斑马鱼脑瘤发生的驱动因素。

图3. 斑马鱼生殖系ptch1突变体成鱼会患上脑肿瘤。（左）存活至幼体/成体阶段的生殖系ptch1tj222纯合突变体动物的明场图像。（中和右）经H&E染色的ptch1tj222脑部肿瘤的矢状切片。白色三角箭头标注左侧肿瘤的位置。中间图中的白色方框在右侧图中以更高放大倍数展示。黑色虚线在中间图中标注小脑位置。另见图S1。

ptch1 基因编辑突变体肿瘤在遗传上与人类 SHH 髓母细胞瘤相似

为确定斑马鱼ptch1基因crispant脑肿瘤与人类胚胎性肿瘤的相似程度，我们对解剖后的对照组斑马鱼脑组织（((tp53M214K)；Casper）和ptch1; (tp53M214K)突变体肿瘤（gRNA #1）进行了基于RNA测序的比较肿瘤基因组学分析（图4A及表S2）。通过基因集富集分析（GSEA）对两组间差异表达的基因进行分析，发现了少数富集的通路，其中最显著的通路包含在儿科癌症中表达或受SHH通路调控的基因（图4B）。我们采用主成分分析（PCA），将斑马鱼ptch1; (tp53M214K)突变体肿瘤的转录特征与已发表的人类髓母细胞瘤（MB）特征进行对比，这些特征此前通过GEO数据库（GSE85217）定义了髓母细胞瘤的四个主要亚型³。研究发现，斑马鱼ptch1; (tp53M214K)突变体脑肿瘤与人类SHH型髓母细胞瘤特征紧密聚集，而与其他髓母细胞瘤亚型特征无聚集关系（图4C）。这些数据表明，ptch1基因crispant斑马鱼肿瘤在基因组水平上与SHH型髓母细胞瘤高度相似。

图4. 斑马鱼ptch1基因crispant脑肿瘤与人类SHH型髓母细胞瘤相似。(A) (tp53M214K) 对照组脑组织（对照组）和 (tp53M214K) ptch1 gRNA #1 脑肿瘤组织（肿瘤组）中前40个差异调控基因的热图。每组分析三个生物学重复。对照组动物为52周龄，肿瘤组动物为4-7周龄。对具有明确人类同源基因的基因进行筛选。SHH 通路反应基因已用方框标出⁴⁰。(B) 进行基因集富集分析（GSEA），以鉴定 (tp53M214K) ptch1 crispant 脑肿瘤组织相较于 (tp53M214K) 对照脑组织中富集的表达通路。NES 为标准化富集分数；FDR 为错误发现率。(C) 主成分分析（PCA）比较斑马鱼 (tp53M214K)；ptch1 crispant 脑肿瘤与此前定义了髓母细胞瘤（MB）四大主要亚组的人类 MB 样本：SHH、WNT、3组和4组。斑马鱼肿瘤（粉色方框）与人类 SHH 亚组聚集在一起，如图所示。另见图 S2-S5 及表 S2。

ptch1突变肿瘤同时表达混合谱系干细胞和神经元标志物

为验证ptch1缺陷型脑肿瘤的遗传与基因组分析结果并进一步明确其组织学特征，我们对ptch1突变肿瘤切片进行了免疫组织化学（IHC）和RNAscope分析。我们针对神经干细胞标志物Sox2（该标志物在SHH髓母细胞瘤中特异性表达），对斑马鱼ptch1缺陷型脑肿瘤及正常脑组织开展了免疫组织化学检测，结果发现，与正常小脑相比，ptch1突变肿瘤的部分肿瘤细胞呈现Sox2核染色阳性（图5A和图S1B）。然而，ptch1缺陷型肿瘤区域也存在Sox2阴性区域。既往研究表明，SOX2阳性的人类SHH髓母细胞瘤存在干细胞和分化神经元的异质性群体42，因此我们接下来采用泛神经元标志物HuC/D评估了ptch1缺陷型脑肿瘤的神经元分化程度。结果确实在ptch1突变肿瘤细胞中观察到了HuC/D的阳性核染色（图5A和图S1B），且这些细胞与表达Sox2的细胞相邻。为进行对比，我们还对斑马鱼中枢神经系统NB-FOXR2肿瘤开展了免疫组织化学分析，这类肿瘤虽具有相似的小圆形蓝细胞形态，但源自丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号激活的少突胶质前体细胞（OPC）。我们发现，中枢神经系统NB-FOXR2肿瘤的大多数肿瘤细胞呈Sox2阳性，但HuC/D呈阴性，这与其OPC起源一致（图5A）。综上，免疫组织化学数据表明，ptch1缺陷型肿瘤属于混合谱系（干细胞/分化细胞）肿瘤类型，这与既往对SOX2阳性人类SHH髓母细胞瘤的研究描述相符。

对ptch1基因编辑突变体肿瘤的转录组分析（图4）是在大体解剖获取的脑肿瘤样本上进行的，这些样本可能包含周围的正常组织。因此，为了验证基因组数据并提供转录组基因表达模式的更高分辨率空间信息，我们采用RNAscope技术对单个肿瘤细胞的特异性RNA进行原位可视化分析⁴⁵。我们重点关注了在人类髓母细胞瘤中高度上调的基因（sox11a）、在音猬因子（SHH）通路激活中发挥作用的基因（gli1），以及在前小脑和中脑形态发生过程中表达的基因（otx2b和atoh1b）——而这正是大多数ptch1突变体肿瘤的发生位置（图5B和图5C）。与通过我们的RNA测序分析，我们观察到，与对照组脑组织和中枢神经系统NB-FOXR2肿瘤相比，ptch1基因编辑斑马鱼肿瘤中的sox11a、gli1、atoh1b和otx2表达水平均升高。因此，遗传学、基因组学和组织学分析共同证明，斑马鱼中ptch1基因的缺失会诱导髓母细胞瘤（SHH型）的发生。

图5. 斑马鱼ptch1基因编辑突变体的脑部肿瘤中，神经干细胞和分化神经元具有异质性，且SHH通路基因表达水平升高。

斑马鱼SHH髓母细胞瘤显示出神经祖细胞的转录特征

为了确定 ptch1-crispant 脑肿瘤潜在的细胞起源，我们对比了差异表达的基因将ptch1-crispant脑肿瘤与先前发表的CNS NB-FOXR2儿童脑肿瘤模型进行对比。 CNS NB-FOXR2脑肿瘤模型源于在少突胶质前体细胞（OPCs）中表达野生型或致癌性NRAS。正如预期的那样，CNS NB-FOXR2脑肿瘤显示出少突胶质前体细胞标志物sox10和erbb3的显著上调（图S2A，基因表达综合数据库：GSE80768）。相比之下，ptch1-crispant脑肿瘤在纤毛发生和神经元（特别是谷氨酸能）标志物方面呈阳性富集，且不表达少突胶质细胞标志物（图S2B和表S3）。主成分分析也得到了验证ptch1 crisp 肿瘤与中枢神经系统 NB-FOXR2 斑马鱼肿瘤模型以及正常脑组织独立成簇（图 S2C）。这些数据表明，ptch1 crisp 脑肿瘤具有神经祖细胞/干细胞的特征，其起源细胞很可能与中枢神经系统 NB-FOXR2 肿瘤不同。这些数据还提示，与人类 SHH 髓母细胞瘤类似，ptch1 crisp 脑肿瘤起源于小脑的神经干细胞区室。

斑马鱼 ptch1 基因编辑突变体肿瘤发生于小脑前部和中脑区域

ptch1基因编辑斑马鱼肿瘤的一个形态学特征是头部出现“凸起”，该凸起通常位于小脑前方（图1）。组织学分析显示，我们还观察到ptch1基因编辑肿瘤细胞具有侵袭性浸润特征，从小脑前部区域向中后脑边界（MHB）处的第三脑室间隙扩散（图1）。此外，在大多数ptch1基因编辑斑马鱼中，小脑体和小脑尾叶（位于后脑后部区域，图1D）的结构相对正常（见图1E和图2C）。由于这些肿瘤在受精后5-7周已具有高度侵袭性，我们还在出现任何明显表型前，对受精后2、3、4周的ptch1基因编辑斑马鱼进行了组织学检查，试图明确肿瘤的发生位置。值得注意的是，受精后2周时，即使是没有明显脑部凸起或行为学表型的ptch1基因编辑斑马鱼，其脑部多个区域也已存在肿瘤细胞浸润，这使得仅通过组织学难以准确判断肿瘤的发生部位（图S3A）。基于先前的解剖学观察，我们假设ptch1基因编辑肿瘤起源于小脑瓣——硬骨鱼类小脑靠近中脑的独特前部延伸结构/脑叶，或中后脑边界室管膜下区域，或两者兼具。为验证这一假设，我们利用现有的转基因品系分析了斑马鱼小脑中对音猬因子（SHH）信号通路有响应的候选区域，这些区域可能是ptch1基因编辑脑部肿瘤的起源细胞所在：其中Tg(shh:H2A-GFP)品系可标记产生SHH的绿色荧光细胞，Tg(8xGli:mCH)品系可标记响应SHH的红色荧光细胞。我们构建了双转基因品系，以可视化斑马鱼中后脑边界和小脑中的这两种细胞类型（图S4A、S4B）。有趣的是，我们发现产生SHH的细胞与响应SHH的细胞在中后脑边界的小脑前部区域紧密相邻（图S4A、S4B）。鉴于小脑颗粒神经前体细胞（GNP）是人类SHH型髓母细胞瘤的起源细胞，且斑马鱼中GNP细胞起源于小脑瓣，我们推断小脑瓣至少是ptch1基因编辑肿瘤的起源部位之一。为验证这一模型，我们整理了已知在斑马鱼中表达的基因列表中脑-后脑交界处区域（表S4），并分析了与对照大脑相比，这些基因在ptch1-crispant大脑中是否存在富集。确实，该分析显示ptch1-crispant大脑中前小脑/中脑-后脑交界处表达的基因呈阳性富集（图S5A和S5B），这表明我们在ptch1-crispant斑马鱼中观察到的脑瘤很可能起源于前小脑/中脑-后脑交界处区域，该区域包括小脑瓣（见讨论部分）。

SHH 髓母细胞瘤的肿瘤发生依赖 Grk3

为了最终利用 ptch1  crispants 进行高通量筛选中的靶点发现，我们研究了基于 CRISPR 的基因组编辑是否可作为一种快速鉴定鱼类中髓母细胞瘤（SHH MB）重要介导因子的有效工具。我们重点分析了 GRK2，这是一种 G 蛋白偶联受体激酶，可通过磷酸化促进 SHH 信号通路的激活SMO 的磷酸化。已有研究表明 GRK2 可促进髓母细胞瘤细胞系的生长与增殖，但尚未已在体内对其在SHH通路诱导的肿瘤发生过程中的重要性进行了测试。为敲除斑马鱼GRK2同源基因grk3，我们设计了靶向grk3催化结构域和RGS同源（RH）结构域的gRNA，并通过高分辨率熔解分析在F0代注射胚胎中验证了gRNA介导的grk3突变（图6A）。随后，我们将ptch1 gRNA单独或与grk3 gRNA联合注射到斑马鱼单细胞期胚胎中，并对其存活率进行监测（图6B）。我们发现，与注射ptch1加阴性对照gRNA的动物相比，通过两种独立的grk3 gRNA敲除grk3后，ptch1基因编辑动物的寿命显著延长（图6B）。我们还测试了多种smo gRNA作为阳性对照；但在ptch1基因编辑动物中敲除smo会导致早期发育缺陷，因此无法对这些动物的肿瘤发生情况进行研究和分析。相比之下，grk3 gRNA可能使肿瘤得以发生，这是因为grk3的mRNA/蛋白由母体提供。这些研究结果凸显了基于CRISPR的瞬时多重编辑技术的潜力，该技术可大量生成携带ptch1基因编辑的脑肿瘤动物，为药物研发提供支持。

为了确定体内研究结果是否在哺乳动物 SHH 髓母细胞瘤中保守，我们使用了最近开发的小鼠 Ptch1 缺陷型髓母细胞瘤细胞系 SMB21，该细胞系严格需要持续的持续的SHH通路激活使其在培养中能够增殖。26,55 我们我们用两种名为维莫德吉和 SANT-1 的 SMO 抑制剂，以及两种名为 Cmpd101 的 GRK2/3 抑制剂处理了 SMB21 细胞以及14AS。我们发现这四种抑制剂均能有效阻断通过对 Gli1（SHH 通路活性的通用转录读数）进行 qPCR 检测，可监测 Ptch1 缺陷型小鼠 SMB21 细胞中的 SHH 通路活性（图 6C）。重要的是，我们还发现两种GRK2/3抑制剂（Cmpd101和14AS）对SMB21细胞活力的抑制作用与SMO抑制剂的抑制程度相当（图6C）。这些数据表明，GRK2/3在Ptch1缺陷型SHH髓母细胞瘤发生过程中对促进肿瘤细胞活力具有保守作用，这些蛋白有望成为治疗SHH髓母细胞瘤的潜在靶点。

图6. 敲除grk3可提高ptch1动物的整体存活率并降低SHH髓母细胞瘤细胞的活力

讨论

SHH 驱动型髓母细胞瘤的临床前模型是识别和测试消除高风险肿瘤新策略的重要工具。已建立多种稳定的 SHH 驱动型髓母细胞瘤小鼠模型（包括高风险 TP53 亚组），这些模型不仅帮助我们深入了解肿瘤形成的遗传和表观遗传驱动因素，也被用于 SHH 通路抑制剂（如维莫德吉和索尼德吉）的临床前测试（Roussel 与 Stripay 综述28）。尽管小鼠模型在识别和测试理性设计的治疗方案方面仍具重要价值，但由于其产仔数少、规模化成本高，并不适合高通量筛选（如基因筛选和药物筛选）策略。为了弥补基于机制的研究方法的不足，识别能够克服当前一代 SHH 通路抑制剂缺陷（如快速耐药性和发育毒性）的肿瘤和宿主依赖型脆弱位点，需要开展动物层面的无偏筛选研究。为解决这一问题，我们建立了一种简便且可规模化的基于 CRISPR-Cas9 的方法，用于构建 ptch1 缺陷型斑马鱼 SHH 驱动型髓母细胞瘤模型，该模型可重现人类 SHH 髓母细胞瘤的组织学特征和基因组特征。根据我们的实验经验，若需要提高斑马鱼髓母细胞瘤模型的存活率并获得更大的肿瘤，建议使用单条 ptch1 向导 RNA #1 进行构建；而同时使用两条 ptch1 向导 RNA 可快速诱发肿瘤，这一特性更适用于肿瘤发生、细胞起源或谱系研究的分析。

此前关于斑马鱼中ptch1的研究主要聚焦于其在眼、耳和鳍器官发生过程中的必需性在眼睛、耳朵和鳍的器官发生过程中的作用。在此外，研究表明在斑马鱼肿瘤模型中，ptch1基因的缺失会改变notch1驱动的T细胞急性淋巴细胞白血病的恶性程度。本研究证实，仅ptch1基因的生殖系或体细胞缺失，就足以在斑马鱼体内诱发胚胎脑肿瘤，这些肿瘤在组织学和基因组层面均与SHH髓母细胞瘤（SHH MB）相似，由此证明ptch1是脑肿瘤发生过程中高度保守的肿瘤抑制基因。同时，本研究还发现ptch1与tp53基因的联合缺失会显著增强肿瘤的恶性程度并降低生存率，这与小鼠髓母细胞瘤模型中的观察结果一致。

SHH 髓母细胞瘤患者。这些数据还表明斑马鱼可能会患上其他由SHH驱动的肿瘤，例如横纹肌肉瘤和基底细胞癌，由于本研究中脑肿瘤的严重性和早期致死性，我们无法对这些肿瘤进行分析。不过，未来可在实验中使用条件性靶向的ptch1等位基因对这些肿瘤展开研究。

颗粒神经前体细胞（GNPs）是哺乳动物中由音猬因子（SHH）驱动的髓母细胞瘤（MB）的既定起源细胞。在小脑发育过程中，哺乳动物的颗粒神经前体细胞从菱形唇产生，并向切线方向迁移，以覆盖背侧小脑的表面并形成外层颗粒层（EGL）。底层浦肯野细胞分泌的SHH会诱导颗粒层从胚胎发生期到青春期持续增殖，这是产生足够颗粒细胞前体（GNPs）以支撑小脑在发育过程中生长并在成年后维持其最终体积所必需的。颗粒细胞前体中持续的SHH信号传导（例如通过PTCH1缺失）会维持颗粒层的增殖状态并阻止其分化，从而促进婴幼儿和青少年形成髓母细胞瘤（MB）。相比之下，斑马鱼在胚胎发生期不存在短暂的颗粒层增殖区，且背侧小脑中不存在Shh通路相关组分（如shh、gli1/2/3、ptch1）。因此，我们认为斑马鱼髓母细胞瘤的形成源于Sox2阳性神经干细胞/前体细胞，这些细胞在小脑中不同时间和位置产生颗粒细胞前体，这与哺乳动物的机制不同。尽管如此，由于这些斑马鱼脑部肿瘤与哺乳动物髓母细胞瘤具有相同的分子机制（SHH通路激活）和细胞机制（颗粒层/颗粒细胞前体增殖），我们预计它们将广泛用于髓母细胞瘤的研究。

我们提出假设，斑马鱼由音猬因子（SHH）驱动的髓母细胞瘤（MB）起源于小脑瓣，这是硬骨鱼小脑特有的前叶，是位于下方的小脑体的延伸部分位于中脑脑室腔附近的视顶盖。小脑瓣与小脑体保持相同的分层结构（分子层、浦肯野细胞层和颗粒神经元层），并产生表达 atoh1a 的颗粒神经元前体细胞，这些细胞会迁移进入在斑马鱼的整个生命周期中，颗粒神经元层都存在。事实上，斑马鱼小脑的一个独特特征是，由于存在持续产生颗粒细胞前体细胞（GNPs）的小脑干细胞微环境，其小脑能够在整个成年期进行再生和生长，因此胚胎发育过程中不需要外部颗粒层（EGL）增殖的短暂阶段。此外，小脑瓣的前腹侧位置使其靠近腹侧神经管中产生音猬因子（Shh）的细胞，且我们发现斑马鱼在小脑与中脑-后脑交界处（MHB）同时表达产生Shh的细胞和对Shh有响应的细胞。从大体形态和组织学角度来看，斑马鱼髓母细胞瘤（MB）的发病位置显示，大部分肿瘤起源于中脑边界区域，并通过中脑腔向背侧区域扩展。最后，我们的基因组学和组织学分析表明，其转录特征既与音猬因子信号通路诱导的颗粒细胞前体细胞增殖相关，也与小脑和中脑-后脑交界处的细胞类型特征相符。因此，我们提出小脑瓣中颗粒细胞前体细胞的持续供应可能是斑马鱼髓母细胞瘤发生的一个起源，未来可通过条件性调控系统在小脑不同区域抑制ptch1基因表达，并标记不同细胞谱系，以确定肿瘤发生的精确细胞起源。

在本研究中，我们阐述了在斑马鱼中建立SHH髓母细胞瘤的方法，这类肿瘤会在3至4周内形成明显肿块，且单个研究人员每天可对数百条斑马鱼开展相关实验。为快速鉴定肿瘤形成与存活所必需的基因，我们采用了双CRISPR相关技术对潜在治疗靶点进行基因编辑。这些实验证实，可将多个向导RNA与ptch1向导RNA共同注射到胚胎中，对影响肿瘤生长的基因进行无偏筛选，同时还能评估目前限制单药SHH抑制剂应用的胚胎及发育毒性。

在此，我们将该方法应用于研究G蛋白偶联受体激酶2（斑马鱼Grk3）在髓母细胞瘤（MB）肿瘤发生中的作用。我们近期已证实，该蛋白可通过磷酸化 smoothened（SMO）蛋白来促进蛋白激酶A（PKA）的募集与失活，进而激活GLI转录因子，在音猬因子（SHH）信号通路中发挥作用（图6D）。斑马鱼中grk3基因的缺失会导致典型的音猬因子信号缺失相关发育表型，如独眼畸形。然而，grk3/GRK2在体内音猬因子型髓母细胞瘤肿瘤发生过程中的潜在作用尚未明确。本研究发现，CRISPR技术介导的grk3基因失活可显著提升ptch1基因编辑斑马鱼的存活率，这表明Grk3不仅是体内致癌性音猬因子信号通路的关键介导因子，也是一个潜在的治疗靶点。最后，我们提出了一条将斑马鱼髓母细胞瘤研究成果转化至哺乳动物髓母细胞瘤模型的研究路径，具体采用小鼠SMB21髓母细胞瘤细胞模型作为研究体系。这一互补性研究方法证实，GRK2/3小分子抑制剂有望成为治疗音猬因子型髓母细胞瘤的新型药物。这类抑制剂包括Cmpd101、14AS以及帕罗西汀（一种获美国食品药品监督管理局批准的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂），目前已被应用于心血管疾病模型研究中，未来需在小鼠模型及人类患者来源的肿瘤模型中对其疗效展开进一步评估。

本研究的局限性

斑马鱼模型的光学透明性是开展癌症发生、癌症进展及药物反应成像研究的宝贵特性。ptch1-crispant 髓母细胞瘤模型目前的一个局限性是缺乏在肿瘤中表达的高亮度荧光报告基因，这使得利用我们先前描述的方法在体内进行药物筛选变得困难⁸⁰。尽管我们评估了在不同小脑细胞类型中表达的报告基因（由atoh1c、ptf1a、dbx1a和ngn1启动子驱动），但未能找到一种能产生高亮度和/或稳定荧光的报告基因，因此无法将荧光肿瘤细胞与周围正常的小脑/中脑细胞类型区分开来。理想情况下，利用基于CRISPR-Cas9的技术在斑马鱼中靶向ptch1（或其他抑癌基因）时，应结合荧光报告基因的整合以实现细胞自主标记。幸运的是，斑马鱼领域的新技术（如GeneWeld⁸¹）将为未来开展此类研究提供支持，从而更准确地确定肿瘤起源细胞。此外，我们的研究结果支持开发斑马鱼转基因方法，使组成型激活的SMO等位基因能够在小脑中表达荧光标签。为此，斑马鱼脑数据库是一种极具价值的在线工具，可用于鉴定特定小脑细胞类型中已建立的转基因品系。此类荧光标记的斑马鱼肿瘤模型将极大丰富基于移植的技术体系，非常适用于快速体内药物筛选以及研究肿瘤-宿主和肿瘤-微环境的相互作用。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。