题目：Directed Differentiation of Zebrafish Pluripotent Embryonic Cells to Functional Cardiomyocytes

原文链接:

https://www.cell.com/stem-cell-reports/fulltext/S2213-6711(16)30144-8

期刊：Stem Cell Reports

摘要

目前尚未建立斑马鱼胚胎体外心肌细胞分化体系。本研究通过分析斑马鱼胚胎多能性因子的基因表达模式以及三胚层标志物，确定了其多能性窗口期，发现斑马鱼从合子基因组激活到长圆形期后短暂阶段，存在一段极短的多能性维持时期。基于该多能性窗口期并结合适宜的培养条件，我们建立了一种从原代胚胎细胞体外快速高效诱导生成心肌细胞的方法。诱导产生的心肌细胞可分化为具有功能的特异性心肌细胞亚型。值得注意的是，这些体外诱导生成的心肌细胞表现出典型的收缩动力学特征和电生理特性。该体系为斑马鱼原代胚胎细胞的心肌细胞分化研究提供了新的范式。该技术不仅为心脏发育与再生研究提供了新平台，也为药物研发、疾病模型构建以及心脏毒性药物评估提供了新的研究基础。

引言

心血管疾病是导致死亡的首要原因，占全球总死亡人数的30%（Mozaffarian 等人，2015）。与成年斑马鱼以及胚胎和新生小鼠中观察到的强大心脏再生能力不同（Porrello 等人，2011；Poss 等人，2002；Sturzu 等人，2015），成年哺乳动物心脏被认为是有丝分裂后状态的（Rumiantsev 和 Carlson，1991），且更新能力极低（每年不超过1%–2%）（van Berlo 和 Molkentin，2014）。因此，人类心脏在心力衰竭后几乎无法补偿丢失的心肌细胞（Bergmann 等人，2015；Laflamme 和 Murry，2011）。治疗受损心脏的潜在有效策略包括激活内源性心脏祖细胞/干细胞分化、通过施用化合物、修饰的信使核糖核酸（mRNA）、基因和重组蛋白来刺激已存在的心肌细胞增殖（Eulalio 等人，2012；Sahara 等人，2015；Zangi 等人，2013），以及心脏祖细胞/干细胞/心肌细胞的移植（Sahara 等人，2015）。为了将基于心肌细胞的疗法应用于临床人类，明确从不同细胞来源分化为功能性心肌细胞的分子机制至关重要。

在小鼠和人类身上已建立了多种获取功能性心肌细胞的方法，包括利用GATA4等发育转录因子将成纤维细胞定向重编程为心肌细胞，在小鼠中通过MEF2C和TBX5（Ieda等人，2010年）、借助WT1/胸腺素激活驻留干细胞或祖细胞以诱导小鼠内源性心肌细胞增殖（Smart等人，2011年），以及诱导人类胚胎干细胞分化为心肌细胞（Chong等人，2014年），或从人类成纤维细胞和心力衰竭患者的细胞中诱导诱导多能干细胞（PSCs）分化为心肌细胞（Burridge等人，2014年；Feaster等人，2015年；Zwi-Dantsis等人，2013年）。然而，有诸多因素和通路（包括遗传与表观遗传调控，Burridge等人，2015年）会影响这些细胞的再生功能。建立新型分化模型无疑将有助于我们理解心肌细胞分化的分子机制。

斑马鱼的心脏在切除20%心室后能够快速再生且无疤痕形成（Poss等人，2002）。因此，斑马鱼心肌分化是解析哺乳动物心脏再生分子机制的理想模型。近年来，研究人员已在斑马鱼中鉴定出多个调控心肌细胞再生的因子和信号通路，如小凹蛋白-1（Caveolin-1）、细胞周期蛋白依赖性激酶9（Cdk9）、核因子κB、端粒酶、神经调节蛋白1（Neuregulin 1，Nrg1）、微小RNA-101a以及骨形态发生蛋白信号通路（Beauchemin等人，2015；Bednarek等人，2015；Cao等人，2016；Gemberling等人，2015；Karra等人，2015；Matrone等人，2015；Uygur和Lee，2016；Wu等人，2016）。研究人员最初利用原肠胚晚期细胞在体外自发分化条件下观察到了收缩细胞的形成（Huang等人，2012）。体外实验中，幼鱼会自发形成心肌细胞聚集体受精后3天的斑马鱼，每尾幼鱼的心脏聚集体生成效率为0.4（格鲁诺等，2015）。此外，仍有若干问题尚未解决，例如高效体外心肌细胞分化所需的条件是什么，以及体外培养产生的心肌样细胞是否具有功能。因此，在斑马鱼中开展高效心肌细胞分化的系统性研究尤为必要。本研究在确定斑马鱼原代胚胎细胞不同发育阶段的多能性时间节点后，建立了一种快速高效的心肌细胞分化方法。随后对影响心肌细胞体外生成的关键因素进行了表征，还探究了收缩动力学和肌节形成过程。最后，明确了搏动细胞簇（BCCs）的电生理功能特征。这些研究成果不仅有助于解析心脏发育与再生的分子机制，也为药物研发中的药物高通量策略筛选、疾病模型构建以及心脏毒性药物评估提供了重要参考价值。

结果

斑马鱼早期胚胎细胞的多能性时序

为了确定斑马鱼胚胎细胞的多能性，我们首先检测了其形态变化不同发育阶段的早期胚胎细胞（图1A和图1B）。在圆顶期之前的早期胚胎细胞中，可清晰观察到细胞体积较大的葫芦状细胞（图1B）。这些细胞的体积逐渐变小，直至50%外包期。值得注意的是，在所有发育阶段均观察到细胞质隆起，表明细胞质呈不对称分布。随后，我们对斑马鱼不同发育阶段原代胚胎细胞中的多能性标记基因和胚层标记基因进行了表达分析（图1C）。RT-PCR结果显示，多能性标记基因pou5f3（POU结构域5类转录因子3，又称oct4）和nanog（Nanog同源框基因）在所有阶段均有表达，提示其同时存在母源表达和合子表达；而(klf17)（Krüppel样因子17，又称klf4b）从高期（受精后3.5小时，hpf）开始表达，表明其为合子基因组激活后的表达模式。为确定胚胎细胞的分化阶段，我们进一步检测了三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的基因表达模式（图1C）。外胚层标记基因sox2（SRY盒2）和内胚层标记基因foxa2（叉头盒A2，又称hnf3b）均从30%外包期（4.9 hpf）开始表达，而中胚层标记基因ta（T型短指同源物a，又称ntla）从长圆期（3.9 hpf）即可检测到表达。胚层标记基因的表达模式结合细胞质的不对称分布，表明斑马鱼细胞谱系的分化胚胎的形成早在长圆形期就已开始。因此，斑马鱼胚胎细胞从合子基因组激活开始，到长圆形期后的短暂时刻，仅经历一个极短的多能性状态。

图1. 斑马鱼胚胎发生过程中的多能性时间。列于表S1。NTC为无模板对照。引物序列和PCR条件为胚胎不同发育阶段的模式。(C) 基因表达的RT-PCR分析组）。比例尺为50毫米。在所有阶段均观察到细胞质（来自不同阶段的下方）。(B) 分离的胚胎细胞的形态不对称分布。比例尺为250毫米。70%-外包期阶段。hpf为受精后小时数，30%-外包期、50%-外包期以及256细胞期、高期、长形期、球形期的胚胎。(A) 早期胚胎的代表性形态

原代胚胎细胞高效分化为心肌细胞

为建立一种利用斑马鱼原代胚胎细胞体外高效分化心肌细胞的方法，我们筛选出了四组均影响心肌球生成效率的因素，包括包被材料、发育阶段、细胞接种密度和培养基添加物（图2A）。将具有自主收缩活性的细胞团计为一个心肌球。分化第2天记录培养体系中生成的心肌球总数，不考虑其大小。

首先，我们通过比较每组每个胚胎产生的BCC数量，评估了平板包被材料（包括纤维蛋白凝胶（FG）、聚-L-赖氨酸（PLL）、明胶（GEL）、饲养层ZF4细胞（ZF4）或对照组（无包被））对长形期胚胎细胞向心肌细胞分化效率的影响。结果显示，ZF4细胞共培养是BCC生成效率最高的方式，且PLL组和GEL组产生的BCC数量均多于对照组（图2B）。

其次，我们比较了在明胶包被培养板上、不同发育阶段（包括256细胞期、高期、长形期、圆顶期、30%外包期、50%外包期和70%外包期）接种的胚胎细胞的BCC生成效率，以确定心肌细胞分化的最佳阶段。与其他阶段相比，长形期的胚胎细胞在心肌细胞生成方面表现出最高的效率（p<0.01图2C）。

第三，在先前的一项研究中（Ho 等人，2014 年），胚胎干细胞样细胞的接种密度会改变其分化命运，因此我们探究了细胞接种密度对其心肌细胞诱导潜能的影响。我们观察到，以 (1-2 ×10{4} cells / cm{2}) 这一密度接种的细胞，其 BCC 产量高于其他密度（p<0.01 图 2D）。原代胚胎细胞的高密度接种会形成大量细胞聚集体，而这些聚集体最终无法分化为心肌细胞。因此，胚胎细胞的接种密度对于高效生成 BCC 至关重要。

最后，我们评估了表皮生长因子（EGF）、斑马鱼胚胎提取物（ZEE）、ZF4 细胞条件培养基（ZF4 CM）和胰岛素等补充因子对心肌细胞诱导的影响。在每组培养基配方中去除单一因子后，胰岛素对 BCC 生成效率产生影响，去除 ZEE 或 ZF4 CM 也会降低效率，而表皮生长因子（EGF）则无此效果（图2E）。在0、10、25和50毫克/毫升的浓度下，添加胰岛素对诱导效率具有剂量依赖性效应，且在诱导初期添加时效率更高（图2F、2G）。因此，采用密度为1–2 1-2 ×10{4} cells / cm{2})的长形期胚胎细胞、ZF4饲养层细胞，并添加ZEE、ZF4条件培养基（ZF4 CM）和胰岛素的组合，可实现心肌细胞分化的最高诱导效率。在该培养条件下，我们观察到搏动样心肌细胞（BCCs）最早可在诱导28小时内出现，且BCCs的数量在第2天达到峰值（每个胚胎含8.4±0.6个BCCs）（图2H、2I；视频S1）。分化8天后，部分BCCs的收缩活性下降，而其余BCCs的搏动可持续长达20天（图2H）。此外，在来自myl7:EGFP转基因斑马鱼的这些诱导心肌细胞中，可检测到心肌标志物Myl7（图2J）。这些结果表明，该心肌细胞诱导培养过程的时间进程与斑马鱼体内心肌发生的时间（24小时受精后，hpf）相近（Kimmel等人，1995）。

近期有研究报道Nrg1是一种心脏促有丝分裂因子，可促进斑马鱼的内源性心脏再生（Gemberling等人，2015年）。为探究心肌细胞对该促有丝分裂因子的再生反应，我们利用体外培养体系研究了NRG1处理对斑马鱼心肌细胞形成和增殖的影响。我们观察到，随着NRG1剂量的增加，从胚胎细胞生成心外膜细胞（BCCs）的效率呈线性提升（R^{2}=0.91）（图2K）。NRG1显著促进了胚胎细胞在第2天（p<0.01）和第3天（p<0.05，图2L）的心脏分化。此外，经NRG1处理的心外膜细胞（BCCs）细胞核数量多于对照组心外膜细胞（BCCs），且经NRG1处理的心外膜细胞（BCCs）的细胞核数量从第2天到第3天有所增加（图2M）。这些数据表明，Nrg1可促进斑马鱼心肌细胞的增殖与形成。

图 2 影响原代胚胎细胞向心肌细胞分化效率的各类因素与培养条件。(A) 不同实验阶段中筛选出的、可影响搏动细胞簇（BCC）生成效率的变量，包括胚胎发育时期、胚胎细胞接种密度、培养基添加组分、培养板包被材料四类。(B) 培养板包被材料对搏动细胞簇生成效率的影响。实验采用椭圆期胚胎细胞诱导心肌分化；包被组别分别为纤维蛋白凝胶（FG）、0.1 mg/mL 多聚左旋赖氨酸（PLL）、2 mg/mL 明胶（GEL）、ZF4 饲养层细胞（接种密度 2×10⁴个细胞 / 平方厘米），以及无包被对照组。实验重复 1 次，每组设置 3 个细胞培养孔。(C) 胚胎发育时期对搏动细胞簇生成效率的影响。培养板均使用明胶包被；虚线代表 256 细胞期与 50% 外包期两组的对比。实验共开展 5 次独立重复，每组设置 3~20 个细胞培养孔。(D) 胚胎细胞接种密度对搏动细胞簇生成效率的影响。取椭圆期胚胎细胞，以不同密度接种至明胶包被板进行体外心肌诱导分化。实验共开展 8 次独立重复，每组设置 3~10 个细胞培养孔。后续实验（E~G）均统一采用该条件：椭圆期胚胎细胞、接种密度 1~2×10⁴个细胞 / 平方厘米、明胶包被培养板。(E) 单因子剔除实验，评估表皮生长因子（EGF）、斑马鱼胚胎提取液（ZEE）、ZF4 细胞条件培养基（ZF4 CM）、胰岛素（INS）分别缺失后，对搏动细胞簇生成效率的影响；对照组为完整全培养基。实验重复 1 次，每组设置 3 个细胞培养孔。(F) 胰岛素添加剂量对培养第 0、1、2 天搏动细胞簇生成效率的影响，胰岛素终浓度设置为 0、10、25、50 μg/mL。实验重复 1 次，每组设置 3 个细胞培养孔。(G) 细胞接种后 0、1、2、4 h 分别添加 50 μg/mL 胰岛素，探究添加时机对搏动细胞簇生成效率的影响。实验重复 1 次，每组设置 3 个细胞培养孔。(H) 在 (B~G) 筛选得到的最优培养条件下，分化不同天数单个胚胎产生的搏动细胞簇数量。实验共 2 次独立重复，每组设置 3~4 个细胞培养孔。(I) 分化第 2 天高效生成搏动细胞簇的代表性明场图像；虚线标注搏动区域，圆点标记收缩位点，图像取自配套视频（视频 S1）；比例尺：50 μm。(J) 分化第 3 天，myl7:EGFP转基因胚胎细胞中，由myl7启动子驱动的绿色荧光蛋白表达情况；比例尺：200 μm。(K~M) 利用斑马鱼体外心肌分化体系，探究神经调节蛋白 1（NRG1）对心肌细胞增殖的作用。(K) NRG1 促搏动细胞簇生成的剂量效应实验，NRG1 浓度梯度为 0、50、100、200、500、1000 ng/mL；线性回归方程：y = 0.0297x + 5.6657。实验共 2 次独立重复，每组设置 2 个细胞培养孔。(L) 100 ng/mL NRG1 处理后，分化第 2、3、4 天搏动细胞簇形成数量变化；对照组（CTR）NRG1 浓度为 0 ng/mL。实验共 3 次独立重复，每组设置 3~8 个细胞培养孔。(M) NRG1 对心肌细胞的促增殖效应：细胞培养样本经 Hoechst 33342 染核后，倒置荧光显微镜下观测；分别统计分化第 2、3、4 天，0 ng/mL 与 100 ng/mL NRG1 处理组单个搏动细胞簇内的细胞核总数。实验共 2 次独立重复，每组统计 23~66 个搏动细胞簇。所有数据均以平均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示；*p < 0.05，**p < 0.01。

搏动细胞簇的形态与收缩动力学

在形态学观察中，我们采用上述最佳条件进行诱导培养，观察到了不同阶段BCCs的形态变化（图3A）。第1、2天的大部分BCCs呈不规则球形、梭形或长梭形（图3B、3C）。随后BCCs逐渐铺展，收缩区域扩大（图3D、3E），最终形成节律性搏动的细胞片，该状态持续超过20天（图3F、3G）。

随后我们测量了膀胱平滑肌细胞的收缩/舒张速度和幅度。收缩速度更高其舒张速度（8.2±0.7毫米/秒，对比5.1±0.3毫米/秒；图3H）更高，而收缩幅度在20天内维持在1.8±0.1毫米（图3I）。这些BCCs在第一天跳动较慢（29.6±1.3次/分钟），随后以59.0±0.5次/分钟的速率跳动加快（图3J）。这些动力学特征与人类干细胞衍生的心肌细胞相当（Asp等人，2010；Hayakawa等人，2014）。

心脏标志物表达与肌节形成

为探究胚胎细胞在分化诱导过程中的基因表达模式，我们分析了多能性、胚层、心脏祖细胞和心肌细胞四类标志物。RT-PCR 结果显示，klf17 和 nanog 仅在前 2 天表达，而 pou5f3 的表达量逐渐下降。在胚层标志物方面，外胚层基因（sox2、nestin 和 pax6a）于第 4 天开始表达，随后内胚层基因（sox17 和 foxa2）开始表达；而中胚层标志物 ta 的表达可在第 0-16 天检测到（图 3K）。我们进一步研究了心脏祖细胞和心肌细胞的标志物表达心肌细胞。心脏祖细胞相关基因（gata4、tbx5a 和 nkx2.5）从第1天开始表达，而心肌细胞标志物（tnnt2a、myh6 和 vmhc）于第2天出现，唯有 myl7 从第1天便开始表达（图3K）。事实上，这些标志物（nkx2.5 和 tnnt2a）在胚胎发育早期并未表达（图1C）。这些结果表明，心肌细胞诱导过程中已产生心脏祖细胞和心肌细胞，且多能性逐渐降低。

为了表征肌节的形成，我们使用 myl7:EGFP 转基因原代胚胎细胞构建生物相容性复合 construct（BCC），这使我们能够评估心肌细胞分化过程中心肌标志物 myl7 的表达。对α-骨骼肌肌动蛋白（Acta1，肌节I带标志物）的免疫染色显示，第2天BCC中出现连续的点状信号，表明肌节组装的早期阶段。第6天，部分BCC中可观察到连续的带状信号，第9天和第14天，部分铺展的BCC中检测到典型的肌节I带模式（图3L），表明肌节已成熟形成。然而，成熟且排列规整的肌节几乎未见在球状BCC中检测到（图3L中第9天的上图）。这些数据表明，源自原代胚胎细胞的BCC既表达祖细胞又表达心肌细胞的心脏标志物，并在诱导的心肌细胞内呈现出动态的肌节成熟过程。

图3. 原代胚胎细胞分化的BCCs的形态与搏动特性。(A) 体外分化程序示意图。(B–G) 与ZF4细胞共培养时，不同分化天数的BCC形态。虚线为收缩区域；箭头为收缩方向；红点为(H)和(I)中BCC收缩动力学轨迹分析的位点。比例尺，20微米。(H和I) 不同分化天数BCC的收缩与舒张速度(H)及收缩幅度(I)。追踪了(B–G)中红点标注的每个BCC的三次收缩。数据以平均值±标准误表示。(J) 1–20天BCC的搏动频率。细胞培养于明胶包被的培养板。两个独立实验，每组n = 52–101个BCC。n=52-101 BCCs / group 蓝点为(B–G)中BCC的搏动频率。(K) 原代胚胎细胞心肌分化过程中通过RT-PCR进行的基因表达分析。引物序列和PCR条件见表S1。NTC为无模板对照。(L) 不同分化阶段Tg (myl7:EGFP) BCC的细胞和分子特征。早期：第2天；中期：第6天；晚期：第9天和第14天。心肌细胞标志物Myl7（绿色）；肌节标志物(###) -骨骼肌肌动蛋白(Acta1，红色)。放大方框显示心肌细胞成熟过程中肌节的形成过程。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺，50微米。

BCCs 具备功能性电生理特征

为探究诱导生成的 beating 样心肌细胞（BCCs）是否具备心肌细胞的功能特征，研究人员首先利用膜片钳放大器记录了这些细胞的自发全细胞动作电位（APs）。在 BCCs 中观察到三种典型的动作电位模式，分别为心室样、结样和心房样（图4A）。具有心室样动作电位的 BCCs 表现出快速的去极化上升和明显的平台期。结样动作电位具有起搏电位典型的4相特征，其膜电位缓慢去极化至阈电位，随后去极化上升过程更为平缓，之后进入快速复极化阶段。心房样 BCCs 呈现出与心室样 BCCs 相似的快速去极化模式，但复极化过程中无平台期。未跳动的胚胎细胞则未检测到膜电位去极化上升。在检测的 BCCs 中，81%为心室样亚型，13%为结样亚型，6%为心房样亚型心肌细胞（图4B）。这三种亚型的动作电位幅度（APA）相近（图4C）。然而，心室样亚型的动作电位时程更长，从APD_{50}（复极50%时的动作电位时程）和(APD_{90})（复极90%时的动作电位时程）均可看出，其动作电位时程长于结样和心房样亚型心肌细胞（图4D、4E）。综上，该诱导方法可生成三种具有典型心脏自发动作电位模式的心肌细胞亚型。

图4. 球样心脏球体细胞的电生理特性表征。(A) 三种心肌细胞亚型的代表性动作电位（AP）模式。在分化第5天通过全细胞膜片钳法记录动作电位。(B) 心室样、结样和心房样 beating cardiomyocytes（BCCs，搏动心肌细胞）的比例。(C–E) 三种BCCs的动作电位幅度（APA）、复极50%时的动作电位时程（APD_{50}）以及复极90%时的动作电位时程（APD_{90}）。两组独立实验：心室样，n=22 BCCs；结样，n=4 BCCs；心房样，n=2 BCCs。数据以平均值±标准误（SEM）表示。

接下来，我们评估了BCCs在频率递增的电流脉冲刺激下的反应。随着刺激频率降低，经测试的细胞表现出动作电位时程（APD）缩短；与1赫兹刺激相比，3赫兹刺激时细胞的APD进一步缩短，2赫兹刺激则降低了BCCs的APD（图5B）。因此，诱导心肌细胞能够有效响应电流脉冲刺激。

由于对肾上腺素（EPI）的反应是心脏的一项重要特征，我们随后测试了BCCs是否能对肾上腺素治疗产生反应。在EPI处理后，检测到膜电位频率加快（图5C和5D）。相应地，(APD_{50})和(APD_{90})的数值均因该处理而降低（图5E和5F），这表明BCCs中存在功能性的β-肾上腺素能受体。

由于河豚毒素（TTX）可阻断细胞(Na{+})通道，我们最终检测了诱导心肌细胞是否存在对TTX敏感的(Na^{+})通道。动作电位（AP）记录显示，TTX对动作电位幅度（APA）无影响，但降低了动作电位频率（图5G和5H）。BCCs中的(APD_{50})和(APD_{90})均未受TTX处理的影响（图5I和5J）。这些数据表明，对TTX敏感的(Na^{+})通道在BCCs中具有功能活性。

图5. 斑马鱼心肌细胞的刺激频率适应性与药物反应。(A) 对第5天心室样BCC的动作电位（APs）在1、2和3Hz的5毫秒电流脉冲刺激下进行记录。所有动作电位均来自同一BCC，分别在1、2和3Hz下刺激获得。(B) 复极50%和90%时动作电位时程的变化率。数值以1Hz刺激下的观测值为基准进行归一化处理。实验重复一次，实验编号n=5 BCCs.。(C–J) 肾上腺素能受体激动剂和某通道阻滞剂对第5天BCC自发动作电位的影响。(C) 灌流含10μM肾上腺素能受体激动剂肾上腺素（EPI）的浴液前后（分别为Pre-EPI和EPI阶段）BCC的代表性动作电位图。(D–F) 搏动频率(D)、复极50%时动作电位时程(E)和复极90%时动作电位时程(F)的变化率。数值以施加肾上腺素前（Pre-EPI）的观测值为基准进行归一化处理。实验重复一次，实验编号n=8 BCCs。(G) 灌流含10nM某通道阻滞剂河豚毒素（TTX）的浴液前后（分别为Pre-TTX和TTX阶段）BCC的代表性动作电位图。(H–J) 搏动频率(H)、复极50%时动作电位时程(I)和复极90%时动作电位时程(J)的变化率。数值以施加河豚毒素前（Pre-TTX）的观测值为基准进行归一化处理。实验重复一次，实验编号n=4 BCCs。数据以平均值±标准误（mean ± SEM）表示。

讨论

鉴于斑马鱼与人类心肌细胞在生理上的相似性（Brette 等人，2008；Nemtsas 等人，2010），斑马鱼已成为研究心脏发育与再生、开展心脏相关表型筛选、检测心脏毒性以及构建心脏疾病模型的杰出研究体系（Arnaout 等人，2007；Asnani & Peterson，2014；Bakkers，2011；Jopling 等人，2010；Kikuchi，2014；Liu & Stainier，2012；Ni 等人，2011）。在本研究中，我们通过分析多能性因子与三胚层标志物的基因表达模式。基于多能性，我们建立了一种从原代胚胎细胞体外快速高效诱导心肌细胞生成的方法。诱导的心肌细胞分化为心室、心房和起搏细胞等特定心肌细胞亚型。随后我们对体外培养的这些心肌细胞的收缩动力学和电生理功能进行了表征。该系统为原代胚胎细胞向心肌细胞分化提供了一种新的范式（图6）。

图6. 斑马鱼心肌细胞从原始状态分化过程中胚胎细胞作用的体外工作模型。在最佳条件组合下培养功能性心肌细胞。诱导产生的心肌细胞可分化为特定的心肌细胞亚型，包括心室肌细胞、心房肌细胞和起搏细胞。让卵圆期细胞分化为(<2 hr)（<2小时）的过程，使我们能够在斑马鱼卵圆期后的短暂时间内——即从合子基因组激活开始的胚胎发育多能窗口——高效诱导其分化。

斑马鱼胚胎的多能性机制仍不明确。研究人员已从卵长期胚胎中建立了数种类干细胞系（Fan 等人, 2004; Ho 等人, 2014; Hong 等人, 2014）。卵裂球或培养胚胎细胞移植研究表明，原肠胚中存在未定型的细胞（Fan 等人, 2004; Ho 和 Kimmel, 1993）。在斑马鱼中，当中囊胚胚胎的中胚层开始特化时，部分胚胎细胞可能仍维持在多能状态。事实上，近期的单细胞分析显示，哺乳动物中从受精卵到囊胚阶段的基因组甲基化水平存在显著差异（Guo 等人, 2014），这表明胚胎细胞间存在不同的多能状态。此外，鲜有研究探讨斑马鱼胚胎何时开始退出多能状态。监测胚胎不同阶段多能性相关标志物的动态表达或许是更优的解决思路。然而，在哺乳动物中广泛应用的多能性标志物（如 SOX2）在斑马鱼的本研究及以往研究（Robles 等人, 2011）中并未展现出良好的适用性。近期研究表明，多能性因子 Pou5f3 和 Nanog 在斑马鱼多能性建立过程中发挥关键作用。pou5f3 和 nanog 均为母源和合子表达基因（Takeda 等人, 1994; Xu 等人, 2012），并在斑马鱼合子基因激活中扮演核心角色（Lee 等人, 2013; Leichsenring 等人, 2013）。斑马鱼受精卵受精后，合子基因组在转录上处于静止状态，直至首次大规模合子转录激活与母源转录降解发生，这一过程被称为母源-合子转换（Tadros 和 Lipshitz, 2009）。斑马鱼的合子基因组激活始于1000细胞期（受精后3小时）（Mathavan 等人, 2005），而小鼠则始于2细胞期（受精后24小时）（Hamatani 等人, 2004）。在斑马鱼合子基因组激活过程中，Nanog、Pou5f3 及 Soxb1 结合并激活包括 miR-430 在内的大量胚胎基因的全局表达，而 miR-430 负责母源 RNA 的清除（Lee 等人, 2013, 2014; Leichsenring 等人, 2013）。哺乳动物的合子基因组激活机制可能与斑马鱼存在差异，因为其建立在小鼠中，全能性的维持并不依赖OCT4A（Wu等人，2013年）。小鼠原肠胚形成后会形成三个胚层。然而，在斑马鱼中，中胚层标志物ta早在长圆形期（囊胚中期）就开始表达，这表明斑马鱼胚胎发生的分化时间远早于小鼠。本研究中，当使用晚囊胚期和原肠胚期的胚胎细胞进行诱导时，心肌细胞的生成效率下降，这也证实了这一点。因此，仅通过Pou5f3和Nanog等多能性因子无法确定斑马鱼胚胎细胞的多能性，胚层分化的启动是另一个关键因素。综上，结合多能性和胚层标志物的表达模式，我们将斑马鱼胚胎发生的多能性窗口确定为从合子基因组激活到长圆形期后的短暂阶段（不足2小时），这是中胚层分化的细胞启动过程中维持多能性的一个非常狭窄的时期。

更好地理解斑马鱼胚胎的多能性状态，使我们能够从原代胚胎细胞中精准诱导分化出心肌细胞。我们方法的核心特征是，除了利用多能性特征外，还结合合适的条件组合——包括细胞密度、ZF4 饲养层细胞和添加物——来促进心肌细胞的诱导。该诱导过程与斑马鱼体内的心脏发生时间（24 小时受精后）相似（Kimmel 等人，1995）。在各类添加物（斑马鱼胚胎提取物、ZF4 条件培养基和胰岛素）中，胰岛素是关键因子。事实上，胰岛素及其受体均为母源和合子表达，敲低胰岛素受体会导致斑马鱼出现心脏异常，这表明胰岛素在心脏发生过程中发挥着重要作用（Papasani 等人，2006；Toyoshima 等人，2008）。用胰岛素或胰岛素样生长因子 1、2 处理小鼠胚胎干细胞，可通过 PI3K/AKT/TOR 信号通路促进中胚层细胞增殖和心肌细胞生成（Engels 等人，2014）。胰岛素样生长因子信号还能促进人诱导多能干细胞来源的心脏祖细胞的持续扩增（Birket 等人，2015）。

诱导系统的另一项特征是，诱导生成的心肌细胞具有典型的收缩动力学和电生理特性。心肌细胞的自主搏动由细胞膜电位的去极化-复极化循环驱动。本研究中体外诱导生成的BCCs动作电位（AP）模式与成年斑马鱼心脏的心室、心房或起搏细胞相似（Nemtsas等人，2010；Tessadori等人，2012），也与人类的相关模式相近（Nemtsas等人，2010）。心肌细胞的功能特性还可通过频率适应性测试和药物处理进一步体现。在频率适应性测试中，BCCs通过缩短动作电位时程（APD）来适应频率递增的刺激，这与斑马鱼心室肌细胞（Brette等人，2008）以及人类诱导多能干细胞（PSC）来源的心肌细胞（He等人，2003；Lian等人，2012；Zhang等人，2009）的表现一致。另一项特性是对β-肾上腺素能刺激的功能反应，该反应在斑马鱼心脏（Parker等人，2014；Steele等人，2011）和人类PSC来源的心肌细胞（Zhang等人，2009）中具有可比性，这表明BCCs中存在功能性β-肾上腺素能受体。更重要的特征是，通过河豚毒素（TTX）反应可证实诱导生成的心肌细胞中存在钠通道。在斑马鱼成体心脏中也观察到了河豚毒素对诱导心肌细胞的类似作用（Chopra等人，2010；Nemtsas等人，2010）。

成年心肌细胞强大的再生能力使斑马鱼成为研究心脏再生的理想模型（乔普林等人，2010；波丝等人，2002；拉亚等人，2003）。由于心肌细胞增殖是斑马鱼心脏再生的关键步骤（乔普林等人，2010），因此发现触发或促进这一过程的关键成分至关重要。近期，一种高效的成年斑马鱼心肌细胞体外培养方法已建立（桑德等人，2013）。本研究提供了一种从胚胎细胞体外诱导心肌细胞分化的详细方法。分化后的心肌细胞具有功能，能够重现对有丝分裂原的增殖反应。NRG1处理显著促进了心肌细胞的生成和增殖，这与此前在哺乳动物和斑马鱼心脏再生中的研究结果一致（贝尔塞尔等人，2009；根伯林等人，2015）。结合在心肌细胞核中特异性表达荧光蛋白的转基因鱼系的应用，本系统为探索参与心脏再生的新型有丝分裂原或因子提供了潜力。本系统的优势在于可从无法存活至成年的致死突变鱼系中获取心肌细胞。只要突变胚胎在长圆形阶段仍具有活力，就可实现分化心肌细胞的生成。通过使用本文提供的方案可实现这一点，因此可基于突变心肌细胞的再生反应开展基因功能研究。因此，我们确定了一种深入了解斑马鱼心脏再生机制的替代方法。基于原代胚胎细胞的系统可用于对心脏研究相关因子进行高通量筛选，筛选范围不仅限于小分子（Huang 等人，2012；Xu 等人，2013），还可涵盖核酸、蛋白质和脂质等，这在斑马鱼体内筛选模型中难以实现。该系统也有望用于解析致死性突变体中心脏发育和再生的信号通路。

实验步骤

斑马鱼、细胞与抗体

所有动物实验及相关方法均严格依照经批准的相关指导原则和法规开展，并获得了武汉大学伦理委员会的批准。本研究使用了野生型AB斑马鱼（斑马鱼）、Tg（myl7:EGFP）转基因品系以及ZF4细胞系CRL-2050。免疫荧光实验中使用的抗体为抗Acta1多克隆抗体（稀释比例1:10；货号AP14779，Abgent公司）以及Cy3标记的二抗（稀释比例1:100；货号E031620-01，EarthOx公司）。

原代胚胎细胞的分离

斑马鱼胚胎在0.003%的次氯酸钠溶液中漂白2分钟，用灭菌的0.53 E2培养基冲洗，随后置于0.1毫克/毫升的E蛋白酶（P5147，西格玛-奥尔德里奇公司）中，偶尔摇晃以脱膜，之后再次用灭菌的0.53 E2培养基冲洗。胚胎细胞接种于24孔板中培养。为保证各孔细胞密度一致，每个孔接种的细胞均从40-50个卵圆期胚胎中分离得到。

心肌细胞分化的诱导

椭圆形期或其他阶段的胚胎细胞在28.5℃下诱导进行心肌细胞分化。将细胞以1至(4.5 ×10{4} cells / cm{2})不等的不同细胞密度接种到培养板上。ZF4细胞（斑马鱼胚胎成纤维细胞系）作为饲养细胞，以(2 ×10{4} cells / cm^{2})的密度培养。原代胚胎细胞心肌细胞分化所用的完全培养基为基础培养基，其中添加了1%鱼血清、85毫克蛋白质/毫升斑马鱼胚胎提取物（ZEE）、30%条件培养基（ZF4条件培养基）、25毫克/毫升胰岛素（I5500，Sigma-Aldrich公司）和50纳克/毫升表皮生长因子（EGF，315-09，Pepro Tech公司）。在评估斑马鱼尾芽细胞（BCCs）对促有丝分裂原的增殖反应时，向培养体系中添加重组神经调节蛋白1（NRG1，11609H01H50，赛默飞世尔科技公司），使其浓度分别为0、50、100、200、500和1000纳克/毫升，用于培养椭圆形期的胚胎细胞。使用倒置显微镜（Leica DM IRB）观察并记录培养过程中出现的斑马鱼尾芽细胞（BCCs）。

RT-PCR

使用 TRIzol 试剂（15596026，赛默飞世尔科技）分离不同阶段胚胎细胞的总 RNA。提取的 RNA 经 DNase 处理（M610A，普洛麦格公司）后，按照实验方案合成第一条 cDNA 链（M170A，普洛麦格公司）。引物序列和 PCR 条件详见表 S1。

收缩动力学

使用配备在倒置显微镜（Leica DM IRB）上的相机记录BCC的视频。以每秒10帧的频率从视频中提取图像。通过一系列图像追踪收缩位点。使用ImageJ软件（http://imagej.nih.gov/ij/）记录位点的x和y坐标。收缩幅度根据收缩前后收缩位点的坐标计算得出。收缩或舒张速度分别通过将收缩或舒张距离除以持续时间计算得出。

电生理学

分化第2天，用连接着口腔移液管的玻璃毛细管收集BCCs，将其重新接种到多聚赖氨酸包被的盖玻片上，在记录动作电位前，于完整的心肌细胞分化培养基中培养。采用PatchMaster软件（HEKA公司）驱动的HEKA EPC10放大器，以全细胞膜片钳模式记录心肌细胞的动作电位活性。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。