题目：Efficient recovery of zebrafish maternal-zygotic mutants from in vivo expanded and cryopreserved germline stem cells

原文链接:https://doi.org/10.1038/s42003-026-10463-x

期刊：Communications Biology

摘要

遗传系的长期保存对动物研究至关重要。现有方法高度依赖单倍体精子的冷冻保存，而二倍体生殖系干细胞（GSCs）或许能提供更优的替代方案。本研究以斑马鱼为模型，构建了一套整合平台，涵盖生殖系干细胞的体内扩增（eGSCs）、冷冻保存及直接遗传恢复等环节。eGSCs 在 cyp11a2-/- 突变体中实现扩增，经冷冻保存与解冻后，其总数较传统生殖系干细胞提升约300倍。eGSCs 移植后的成功率达82%，而传统生殖系干细胞的移植成功率不足1%。此外，本研究还开发了生殖系干细胞缺陷型 nanos2/-突变体作为eGSC移植的理想宿主，可在单个成熟周期内高效产生精子和单个成熟周期内的卵母细胞。这使得母源-合子突变体可在F1代直接快速恢复。总体而言，我们的策略为斑马鱼纯合突变体的保存与恢复提供了一个稳定的平台，为斑马鱼研究开辟了新的机遇。

关键词：斑马鱼；遗传资源保护；生殖系干细胞；冷冻保存；nanos2-宿主

引言

斑马鱼（斑马属）已成为发育生物学和生物医学研究中关键的脊椎动物模型，这得益于其透明的胚胎、便捷的基因操作手段、注释完善的基因组，以及与人类超过85%的遗传同源性。在过去几十年间，大量突变体和转基因品系的建立极大地推动了我们对脊椎动物遗传学的认知3。为保护这些珍贵的遗传资源，包括中国斑马鱼资源中心（CZRC，中国）、斑马鱼国际资源中心（ZIRC，美国）和欧洲斑马鱼资源中心（EZRC，德国）在内的各大斑马鱼资源中心已广泛采用精子冷冻保存技术。

然而，精子冷冻保存仅能保存单倍体父本基因组，且存在诸多局限性：单只雄性个体的精子产量有限、需要进行大规模筛选、纯合突变体的恢复效率低下——F2个体中单基因突变体的恢复率仅为25%，三基因突变体则仅为1.56%。此外，对于存在母源贡献的基因（如nanog（纳米同源框基因）和pou5f3（POU结构域5类转录因子3基因）），其母源合子（MZ）突变体的构建通常需要两代繁育，将恢复时间延长至至少六个月的两代周期6,7。这些限制凸显了对二倍体水平种系保存策略的需求，此类策略可实现品系的快速且完整的重建。

目前，斑马鱼的卵母细胞和胚胎冷冻保存仍存在技术难题，主要原因是其卵黄含量高且对冷冻保护剂的渗透性低。相比之下，生殖系干细胞（GSCs）的冷冻保存结合移植技术，为保存二倍体基因组和生殖能力提供了极具前景的替代方案8,9。生殖系干细胞可从幼体或成体中获取，且获取相对便捷，这类细胞具有稳定的自我更新能力，还能分化为卵母细胞或精子，使其成为冷冻保存的重要研究对象。

包括精原干细胞在内的睾丸组织冷冻保存的冷冻保存及后续移植技术，已在小鼠、家兔等哺乳动物中成功建立，同时也被探索用于保存中华鲟、匙吻鲟、东京鳑鲏等濒危鱼类的遗传资源。值得注意的是，鲤、虹鳟、香鱼等水产养殖物种的相关研究也取得了重大进展，但斑马鱼等模式生物仍存在挑战。两大主要局限性继续阻碍着更广泛地应用GSC冷冻保存与移植技术：（1）低浓度与低活性低温保存的神经干细胞，导致移植效率不佳；以及（2）缺乏合适的宿主能够产生供体来源卵母细胞的模型22。

我们此前的研究表明，斑马鱼囊胚细胞可以被重编程为诱导型原始生殖细胞原始生殖细胞（iPGCs），有效提高了原始生殖细胞的可用性。然而，规模化生产功能性生殖干细胞（GSCs）的获取，尤其是在冷冻保存之后，仍然是一个尚未解决的难题。我们进一步研究发现，类固醇生成体细胞功能受损的 cyp11a2-/- 突变体能够维持使生殖干细胞（GSCs）保持未分化状态并促进其增殖23。这一发现提出了一个一个根本性问题：生殖干细胞的自我更新是否受体细胞微环境调控？此外，能否cyp11a2-/-突变体能否作为异体GSC的体内扩增模型？

宿主选择是种系移植中的另一个主要瓶颈。对宿主的有效灭菌生殖细胞对于确保供体生殖系的唯一性至关重要。因此，宿主的内源性生殖细胞通常通过在1细胞期注射死端反义吗啉代寡核苷酸（dnd1_MO）来消除 （注：根据翻译规则，保留专业缩写dnd1_MO，译文贴合原文语境，准确表达实验操作手段）生殖系缺陷突变体，以及通过三倍体诱导来提高供体细胞的植入率。然而斑马鱼不存在性染色体，在发育早期清除内源性生殖细胞通常会导致导致全雄表型的出现，阻碍了雌性微环境的建立以及供体来源的 （注：原文未完整结束，译文也保持未完整闭合的状态以匹配原文）卵子形成。一个关键挑战是选择一个能同时保证高效的最佳宿主定植以及功能性供体来源的精子和卵子的产生。

本研究中，我们建立了一套整合了体外培养的斑马鱼生殖干细胞（GSC）综合保存体系实现了生殖干细胞（GSCs）的**体内扩增**、**扩增后生殖干细胞（eGSCs）的冷冻保存**以及**生殖干细胞移植（GSCT）**。为了据我们所知，这是首次证明异体生殖干细胞能够稳定扩增cyp11a2基因敲除宿主。以nanos2基因敲除突变体为宿主，我们成功实现了供体来源的精子和卵子，包括直接在F1代重建100%的MZnanog胚胎在三个月内——远快于传统的精子冷冻保存方法。除此之外加速保护，该策略提供了一种强大的工具来产生合子性、母源-合子致死性以及复杂的多基因突变体，为遗传学研究和生物医学创新开辟了新途径。

结果

异基因睾丸生殖干细胞在cyp11a2-/-宿主中发生强烈的体内扩增

为建立高效的斑马鱼睾丸生殖干细胞（亦称为精原干细胞，SSC）保存策略，本研究对比了两种广泛应用的冷冻保存方法：分离生殖干细胞的直接冷冻法，以及完整睾丸组织的冷冻保存法（图1A）。活力检测结果显示，尽管完整睾丸内保存的生殖干细胞（解冻睾丸组织组）解冻后的存活率和活细胞浓度均显著高于分离的生殖干细胞，但二者均低于新鲜对照组（图1B、图S1A、B）。这些结果表明，相较于解离后的细胞，完整的睾丸微环境为生殖干细胞的保存提供了更有利的条件。为提高复苏效率，本研究进一步优化了冷冻保护剂的组成。在L-15培养基中添加100 mM海藻糖可进一步提升细胞活力，由此确定该配方为最优方案（图S1C）。尽管取得了上述改进，冷冻保存的生殖干细胞每只供体仅能复苏出约30±4个可移植宿主，成功率为0.71±1.42%，远低于新鲜分离生殖干细胞的移植效果（图1C、D）。因此，解冻后功能性细胞数量有限仍是实现高效移植的主要瓶颈。

为解决这一局限性，我们探究了此前有研究报道可将生殖细胞维持在未分化状态的cyp11a2–/–突变体23，能否作为异体生殖干细胞（GSCs）的**体内扩增体系**。研究人员从Tg(ddx4: EGFP)供体中分离出GSCs并移植到cyp11a2-/-宿主中，对供体细胞的动态变化进行了长期监测。移植后3天，供体来源的EGFP⁺细胞成功定植于生殖嵴；移植后30天，这些细胞形成了早期性腺结构（图1E）。移植后4个月，21.99±3.13%的野生型（WT）宿主和24.87±2.09%的cyp11a2-/-宿主中检测到了EGFP阳性的睾丸（图1F、图S1D）。值得注意的是，cyp11a2-/-宿主中的睾丸体积显著增大（图1F、图1G），这表明供体GSC的扩增能力得到了增强。为探究供体细胞的命运，研究人员对Ddx4（强阳性代表生殖干细胞）和Sycp3（减数分裂标志物）进行了双重免疫荧光染色分析。在野生型宿主中，大多数供体来源的生殖细胞同时表达Ddx4和Sycp3，表明其已进入减数分裂阶段；相反，cyp11a2-/-宿主的睾丸中主要为Ddx4强阳性、Sycp3阴性的细胞，说明这些细胞仍维持在未分化的生殖干细胞状态（图1H）。定量分析证实，cyp11a2-/-宿主中每条鱼的生殖干细胞比例和生殖干细胞含量均显著更高。与野生型（WT）相比的宿主（图1I、J）。总体而言，这些发现表明cyp11a2-/-突变体提供一个支持性微环境，使移植的异基因生殖干细胞保持自我更新状态状态，从而实现显著的体内扩增（图1K）。

图1. 异体生殖干细胞在cyp11a2-/-宿主中的显著扩增。A：纯化的生殖干细胞（GSCs）或睾丸组织（TT）冷冻保存流程的示意图。采用Percoll不连续密度梯度离心法纯化生殖干细胞。B：新鲜组、冻存生殖干细胞组与冻存睾丸组织组分离得到的生殖干细胞活细胞浓度对比。C、D：统计分析每条鱼在新鲜组、冻存生殖干细胞组及冻存睾丸组织组中可移植宿主数量与移植成功率。E：在移植后3天和30天检测供体细胞在cyp11a2⁻/⁻宿主中的定植情况。绿色荧光代表供体来源的增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达（Tg(ddx4: EGFP)）。比例尺：左图100微米，右图300微米。F、G：与dnd1吗啉寡聚核苷酸（dnd1_MO）组相比，在移植后4个月观察野生型宿主（host_WT）和cyp11a2⁻/⁻宿主中供体来源生殖干细胞的发育情况，并对宿主的性腺重量进行统计分析。绿色代表供体来源的增强绿色荧光蛋白表达（Tg(ddx4: EGFP)）。比例尺：1毫米。H：在移植后4个月使用Ddx4和Sycp3抗体对野生型和cyp11a2⁻/⁻宿主中生殖干细胞的发育进行免疫荧光分析。品红色代表Ddx4信号，绿色代表Sycp3信号，灰色为4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。比例尺：20微米。I、J：定量分析野生型和cyp11a2⁻/⁻宿主睾丸中生殖干细胞的比例及含量（性腺重量×生殖干细胞比例）。K：生殖干细胞体内扩增流程示意图。将异体生殖干细胞移植到受精后4天的(cyp11a2)宿主中，该宿主通过在单细胞阶段注射dnd1_MO实现内源性生殖细胞耗竭，用于体内扩增。dpf：受精后天数，dpt：移植后天数，mpt：移植后月数，WT：野生型，Sg：精原细胞，Sc：精母细胞，Sz：精子。H_WT：Host_WT，H_(-/-)：Host_cyp11a2⁻/⁻。

cyp11a2–/– 宿主中生殖干细胞的扩增显著提高了冻存后的移植效率冷冻保存

为进一步评估cyp11a2-/-宿主中GSCs的扩增是否能提高移植效率冷冻保存后，每位供体的睾丸均采用优化方案进行冷冻处理随后解冻并移植到 dnd1_MO 宿主中（图2A）。分离两者的细胞WT 以及 (cyp11a2) 宿主未经过 Percoll 梯度纯化便直接进行了评估。而各组细胞活力相当（图S2A），而cyp11a2-/-宿主组获得的活细胞浓度显著更高 (1.03 pm 0.05 ×10^{4} / mu L 对比 (6.5 pm 2.0 ×10^{2} / mu L)；图2B，C).

为评估扩增后的细胞群是否保留了生殖干细胞（GSC）的特性，我们进行了免疫染色实验使用针对 Nanos2 的抗体进行检测，Nanos2 是一种保守的生殖系干细胞标志物。该CYP11A2基因敲除（host_cyp11a2-/-）组表现出Nanos2阳性细胞的显著富集，数量达到257.2±13.5×与对照组中仅 0.78 ± 0.20 × 10³ 个细胞相比，增加了约 344 倍（图 2D–F）。这些结果证实，cyp11a2-/- 微环境选择性地支持了生殖干细胞的自我更新和未分化生殖干细胞的积累。冷冻保存后，源自cyp11a2-/-扩增睾丸的生殖干细胞扩增后的睾丸在移植到dnd1_MO宿主后表现出强劲的定植能力。增强型绿色荧光蛋白荧光显示在第3天及之后，供体细胞在生殖嵴中广泛分布30 天份，大幅超过野生型对照组的信号值。从定量角度来看，来自host_cyp11a2⁻/⁻ 组支持每只供体移植到 670 ± 60 个宿主中——约为 27 倍比对照组高出一倍（25±4），且移植成功率更高，达到82.0±3.0%对比 0.95 ± 1.65%（图 2G–I）。

所有 dnd1_MO 宿主均发育为具有功能的雄性个体，其精液量与野生型（WT）鱼类相当（图图2J）。此外，免疫荧光证实睾丸中EGFP与Ddx4信号存在共定位，这表明解冻后的供体来源生殖干细胞已完成精子发生分化（图2K）。重要的是，供体来源的精子具有完全的功能：当宿主雄性与野生型（WT）雌性交配时，以正常的受精率获得了表达绿色荧光蛋白（EGFP）阳性的子代（图2L、M），这证实了生殖系成功发生传递。综合来看，这些结果表明，在cyp11a2基因敲除（cyp11a2–/–）宿主中扩增的异源生殖干细胞（GSCs）显著提高了冷冻保存后的移植效率。

图2. cyp11a2基因敲除宿主中生殖干细胞的扩增显著提高移植效率冻存后。A：展示睾丸组织冷冻保存与移植。cyp11a2-/- 宿主和对照组的睾丸组织均已冷冻保存培养6个月后解冻，随后在4天pf时移植到dnd1_MO宿主中。B、C：评估及冷冻保存和解冻后，对照组和宿主_cyp11a2-/-睾丸中活细胞的定量分析使用AO/PI染色。AO（绿色）标记所有细胞，而PI（红色）标记死细胞。比例尺：50微米。D：免疫荧光检测从<...>中分离的睾丸细胞悬液中Nanos2阳性细胞解冻后的对照组和host_cyp11a2-/-组。图中显示了Nanos2信号（绿色）和细胞核（DAPI，蓝色）。比例尺：上方为50微米，下方为10微米。E、F：对照组和cyp11a2基因敲除宿主中每尾鱼Nanos2阳性细胞的比例和数量的定量分析对照组和 host_cyp11a2-/- 组每条鱼的阳性细胞数。G：供体细胞定植的检测dnd1_MO 宿主在移植对照或解冻的睾丸细胞后，分别在移植后第3天和第30天host_cyp11a2-/- 宿主。比例尺：100 微米。H、I：可移植宿主数量的统计分析且各组间每条供体鱼的移植成功率存在差异。J：所有 dnd1_MO 宿主均发育为雄性个体呈现供体来源的绿色荧光蛋白信号，且精子释放情况与野生型（WT）相当雄性。K：在 dnd1_MO 宿主中检测供体来源生殖细胞的发育与分化（3 天）移植后4个月，通过Ddx4抗体（红色）和供体来源的EGFP信号（Tg(ddx4: EGFP)）进行检测。细胞核为用DAPI复染（灰色）。比例尺：40微米。L：F1子代（5天龄）中的EGFP荧光检测源自 dnd1_MO 宿主，表明供体来源的生殖细胞（白色箭头）定位于生殖嵴。比例尺：上图1毫米，下图200微米。M：不同组间受精率的比较dnd1_MO 宿主和野生型对照组。dpf：受精后天数，dpt：移植后天数，mpt：月移植后，精原细胞：精原细胞，精母细胞，精子，野生型。宿主_（/-): Host_cyp11a2-/-. 所有数据均以平均值±标准误（SEM）表示，每组的样本量为(n=3)。

nanos2-/- 宿主可高效产生供体来源的功能性卵母细胞

尽管生殖干细胞（GSC）的扩增显著提高了冷冻保存后的移植效率，但如先前研究29所述，dnd1_MO 宿主斑马鱼无法产生供体来源的卵母细胞。在 dnd1  morphant 胚胎中，所有生殖细胞均在受精后24小时（hpf）前被消除，这会导致胚胎仅发育为雄性30，进而无法形成支持卵母细胞分化的雌性性腺微环境。相比之下，nanos2-/- 突变体在幼体发育早中期保留正常数量的生殖细胞，能够正常发育为雌性31。研究发现，nanos2-/- 雌性斑马鱼在性成熟后不久可进行1-2轮卵发生，但随后生殖细胞会快速完全耗竭，通过 Ddx4 免疫荧光检测未发现卵原细胞（图S3A-F）。这些结果表明，nanos2-/- 突变体在早期发育阶段能够建立稳定的卵巢体细胞微环境。该早期卵巢体细胞微环境，以及后续卵发生早期内源性生殖细胞的丢失，为移植的生殖干细胞分化为具有功能的供体来源卵母细胞提供了有利的微环境。此外，雄性 nanos2-/- 突变体中也完全不存在生殖细胞（图S3G-H）。因此，我们推测 nanos2-/- 突变体可作为生殖干细胞移植的高效宿主，实现雄性和雌性配子的重建。

为验证该假设，将从Tg(ddx4:EGFP)供体中分离、先前在cyp11a2-/-宿主中扩增过的生殖干细胞（GSCs），移植到未注射dnd1_MO的4天龄（dpf）nanos2-/-幼鱼体内，随后检测其移植定植情况及后续发育（图3A）。移植后3天（dpt），供体来源的生殖干细胞沿生殖嵴聚集；移植后15天和30天，绿色荧光蛋白（EGFP）荧光信号逐渐扩散；至移植后45天和80天，可分别鉴定出雄性和雌性宿主（图3B）。与仅发育为雄性的dnd1_MO宿主不同，nanos2-/-宿主的雌性比例为35.43±2.08%（图3C）。移植后90天，在nanos2-/-雌性宿主的卵巢中检测到强烈的绿色荧光蛋白荧光信号，表明供体来源的生殖干细胞成功定植并完成分化（图3D）。在野生型宿主卵巢中，仅观察到分散的EGFP阳性生殖细胞（图3D、E）。在卵巢中在nanos2-/-雌性个体的卵巢中，一次产卵后所有卵母细胞均呈现绿色（供体来源的EGFP）与红色（Ddx4）信号的共定位一次产卵事件后的信号，证实供体来源完整（图3F、G）。相反，在野生型（WT）中宿主中，仅有少数卵母细胞出现这种共定位现象，表明供体的贡献有限（图3F，G)

为验证配子功能，将 nanos2-/- 雌性与野生型（WT）雄性进行自然交配，并且在受精后5天对F1代子代进行了荧光分析（图3H）。在第一次产卵过程中(83 dpt)，33.70 ± 3.57% 的胚胎表现出生殖系特异性 EGFP 荧光，这与Tg(ddx4:EGFP)的空间表达模式（图3I、J、K），证实了其供体来源卵母细胞。值得注意的是，从第二次产卵开始，所有胚胎均呈EGFP阳性，且该模式在随后的每周产卵中持续存在（图3I、J、K）。生育力测定显示 nanos2-/-雌性宿主的产卵能力和受精率与野生型对照组相当（图3L、M）。相比之下，野生型雌性宿主仅产生极少的供体来源胚胎，这凸显了 </response>nanos2-/- 雌性作为移植宿主的优异适用性（图3I、J、K）。此外，nanos2-/-雄性宿主能够从解冻的供体GSCs中产生具有功能的供体来源精子，成功产生了后代（图S3I-L）。

综上，这些研究结果表明，nanos2-/- 突变体可作为一种有效的双性别 移植模型一种移植模型，可支持持续产生供体来源的功能性配子无需借助dnd1_MO介导的生殖细胞消融。该系统提供了一种稳健且应用广泛的适用于从冷冻保存的生殖干细胞中加速母体和纯合子突变体生成的通用策略GSCs。

图3. 冷冻保存的生殖干细胞在nanos2-/-宿主中产生功能性卵子。A：从nanos2-/-宿主获取功能性配子的实验策略示意图。解冻的睾丸细胞在受精后4天（4 dpf）移植到nanos2-/-幼虫体内，随后追踪其定植和发育过程。值得注意的是，nanos2-/-宿主无需注射dnd1_MO。B：在受精后移植后3、15、30、45和80天（dpt）检测供体来源的生殖干细胞（GSCs）在nanos2-/-宿主中的定植和发育状态。C：对dnd1_MO和nanos2-/-宿主的性别分布进行统计分析。D、E：受精后移植90天（dpt）时野生型（WT）和nanos2-/-宿主的荧光成像及统计分析。在nanos2-/-宿主的卵巢中观察到强烈的增强绿色荧光蛋白（EGFP）表达，而在对照组（无内源性生殖细胞耗竭）中表达极少。比例尺：1毫米。F：受精后移植90天（dpt）时对nanos2-/-宿主卵巢中供体来源生殖细胞分化的免疫荧光分析，显示EGFP（绿色，来自供体Tg(ddx4:EGFP)）与Ddx4（红色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，灰色）的共定位。比例尺：50微米。G：对野生型（WT）和nanos2-/-宿主卵巢中EGFP阳性生殖细胞比例的统计比较。H：子代检测的实验流程。将成熟的雌性宿主与野生型（WT）雄鱼自然交配，并在受精后5天（5 dpf）评估其后代的EGFP荧光。I：四次连续产卵事件后，受精后4小时（4 hpf）F1代子代的EGFP荧光检测。比例尺：1毫米。J：nanos2-/-雌性宿主来源的F1代胚胎在受精后5天（5 dpf）时，其生殖脊中供体来源的EGFP荧光定位（白色箭头）。比例尺：上图1毫米，下图200微米。K：对四次连续产卵事件中野生型（WT）和nanos2-/-雌性宿主来源的EGFP阳性胚胎进行统计分析。L、M：比较nanos2-/-雌性宿主与对照组的总产卵数和受精率，结果显示无显著差异。dpf：受精后天数；dpt：移植后天数；WT：野生型；H_WT：宿主野生型；H_dnd1_MO：宿主dnd1_MO；H_nanos2-/-：宿主nanos2-/-。

通过eGSC冷冻保存与移植快速获得MZnanog纯合突变体胚胎为评估基于生殖干细胞的冷冻保存与移植技术的更广泛应用价值，我们将该方法应用于针对经典母性效应基因Nanog的策略。有研究报道，合子突变体（Znanog）发育正常，而 MZnanog 则表现出严重的早期胚胎缺陷 6。实验方案包括nanog-/-生殖干细胞的扩增与冷冻保存，随后快速恢复MZnanog 胚胎（图4A）。将 nanog-/- 生殖干细胞移植到 cyp11a2-/- 受体中可产生扩增的供体来源睾丸（图4B、C、S4A）在冷冻保存六个月后仍保持高活力和活细胞浓度（图S4B、C）。通过对Ddx4、Sycp3和Pcna进行三重染色的单倍型分析和免疫染色证实，扩增的供体睾丸中富集了二倍体生殖干细胞（GSCs）（图4D、S4D）。

当将增强型生殖干细胞（eGSCs）移植到nanos2基因敲除（nanos2-/-）宿主中时，与野生型（WT）对照组相比，可移植宿主的数量和移植成功率均显著提高（图S4E-G）。雄性和雌性nanos2-/-宿主杂交产生的后代被命名为MZnanog_eGSCT（图4A）。这些胚胎持续表现出MZnanog突变体特有的发育缺陷，而纳米（nanog）信使核糖核酸（mRNA）注射可部分挽救这一缺陷（图4F、G）。重要的是，nanos2-/-宿主的雌雄个体在多次产卵中均能产生供体来源的可育配子（图S4H、I）。

已有研究证实，Nanog在母源-合子转换（MZT）过程中发挥关键作用，可促进合子基因的激活以及母源基因的清除。为进一步验证通过本方法获得的MZnanog_GSCT表型的分子真实性，本研究对受精后4小时（hpf）的MZnanog_eGSCT胚胎（简称eGSCT）进行了转录组学分析，并以野生型（WT）和MZnanog胚胎作为对照。维恩图分析显示，相较于野生型，eGSCT胚胎与传统MZnanog胚胎共有4903个差异表达基因（DEGs），表明二者基因表达模式具有相似性（图4H）。层次聚类分析进一步证实，eGSCT胚胎与MZnanog胚胎的基因表达模式高度相似，尤其是在与干细胞维持和器官分化相关的基因上（图4I）。与野生型相比，MZnanog和eGSCT胚胎中的nanog表达量均显著降低。此外，dharma、mxxt2、mir-430、bmp2b、gsc和wnt8a等合子基因的表达水平在MZnanog和eGSCT胚胎中均出现下调，提示合子基因激活过程失败（图4J）。与之相反，lin28a、nanos1、sox2、sox19b、kfl4和gys1等母源基因的表达量则出现上调，表明母源基因的清除过程未完成（图4K）。KEGG通路富集分析结果显示，eGSCT与野生型对比、MZnanog与野生型对比的通路存在广泛重叠，其中包括干细胞多能性和轴突导向通路（图S4J、K）。

总体而言，这些研究结果表明，生殖干细胞的扩增、冷冻保存与移植能够实现MZnanog突变体的精准重建，同时重现其表型和转录组特征F1代母源-合子缺陷的特征。与传统精子冷冻保存相比，后者需要至少三代（6个月）才能再生母源-合子突变体，而整合胚胎生殖干细胞冷冻保存与移植可将再生时间缩短一半。

图4. 利用冷冻保存与移植技术快速重建母源合子型Nanog（MZnanog）胚胎。A：体内扩增、冷冻保存及后续移植步骤的示意图流程，该流程可使F1代后代中的MZnanog胚胎快速恢复（MZnanog_eGSCT）。B、C：野生型（WT）和cyp11a2-/-背景下，源自nanog-/-生殖干细胞（GSCs）的睾丸形态观察与定量分析在受精后4个月（mpf）的宿主中，与野生型（WT）对照组相比，cyp11a2-/- 宿主的纳米克（nanog-/-）生殖干细胞（GSCs）发育形成的睾丸体积增大，重量显著更高。比例尺：1毫米。D、E：在宿主野生型（host_WT）和宿主cyp11a2-/-（host_cyp11a2-/-）的睾丸细胞悬液中，使用Ddx4（红色）、Pcna（绿色）和Sycp3（蓝色）抗体进行三重免疫荧光染色，DAPI（灰色）标记细胞核。定量分析显示，宿主cyp11a2-/- 睾丸中的生殖干细胞（GSC）比例显著更高。比例尺：20微米、50微米。F、G：对野生型（WT）、母源合子型纳米克敲除（MZnanog）、母源合子型纳米克敲除胚胎生殖干细胞移植（MZnanog_eGSCT）以及母源合子型纳米克敲除胚胎生殖干细胞移植+纳米克（MZnanog_eGSCT + nanog）组受精后6小时（hpf）的胚胎进行发育对比和统计分析。MZnanog_eGSCT 胚胎表现出与MZnanog相似的发育停滞表型，而补充纳米克（nanog）mRNA则恢复了正常发育。比例尺：1毫米。F：韦恩图展示了MZnanog_eGSCT与野生型（WT）对比、MZnanog与野生型（WT）对比之间的差异表达基因（DEGs）重叠情况。I：热图显示，相较于野生型（WT），MZnanog和MZnanog_eGSCT 胚胎具有高度相似的转录组特征。J、K：火山图展示了MZnanog和MZnanog_eGSCT 相较于野生型（WT）的上调和下调差异表达基因（DEGs），证实MZnanog_eGSCT 胚胎准确再现了MZnanog的转录组特征。WT：野生型，hpf：受精后小时数，mpf：受精后月数。MZnanog：母源合子型纳米克。H_WT：宿主野生型，H_cyp11a2-/-：宿主cyp11a2基因敲除型。eGSCT：母源合子型纳米克敲除胚胎生殖干细胞移植。

讨论

本研究建立了斑马鱼生殖干细胞（GSC）体内扩增、冷冻保存与移植的整合体系，可从冷冻保存的扩增生殖干细胞（eGSCs）中同时回收供体来源的精子和卵母细胞（图5）。据我们所知，这是首次在脊椎动物中实现异体生殖干细胞的成功体内扩增。该研究成果为硬骨鱼类高效种质保存与遗传资源重建策略的发展迈出了重要一步。

本研究的一项主要创新是利用cyp11a2-/-突变体作为生殖干细胞（GSCs）的体内扩增模型（图5）。这些突变体可提供稳定且未分化的睾丸微环境，促进睾丸生殖干细胞（此前称为精原干细胞，SSCs）的高效自我更新，从而解决了生殖干细胞冷冻保存的关键瓶颈——解冻后存活细胞数量不足，无法满足移植需求。尽管以往研究已在多种鱼类中探索了生殖干细胞的体外扩增，但要实现长期自我更新且不发生分化，一直难以达成。研究人员尝试通过添加血清、性腺体细胞等方式在体外重建生殖干细胞存活所需的微环境，但仍未能在实现细胞数量扩增的同时维持其未分化特性。与近期研究结果23一致，本研究证实cyp11a2-/-突变体可自然使生殖干细胞保持未分化状态，且关键在于能支持异体生殖干细胞的体内扩增。这一方法使解冻后的存活生殖干细胞数量增加了近300倍，为突破基于生殖干细胞的冷冻保存技术的数量瓶颈提供了可规模化的解决方案。此外，通过对cyp11a2-/-突变体进行免疫耐受改造，结合近期报道的通过foxp3a过表达工程化调节性T细胞（Tregs）介导免疫耐受的策略39，该系统未来有望应用于跨鱼类的生殖干细胞扩增研究。

图5. 基于整合GSC的策略可实现斑马鱼MZ突变体的长期遗传保存与快速恢复。整合式体内生殖干细胞扩增（扩增生殖干细胞）、冷冻保存与移植系统的示意图。上图：cyp11a2基因敲除突变体可提供稳定的睾丸微环境，支持生殖干细胞高效自我更新与大规模扩增。扩增生殖干细胞以高产量收集并进行冷冻保存，实现二倍体生殖系资源的长期保存与高效遗传恢复。下图：传统精子冷冻保存与基于扩增生殖干细胞的冷冻保存用于构建母合子突变体的品系恢复时间线对比。传统精子冷冻保存仅能保留单倍体父本基因组，需历经多代繁育（子一代-子二代-子三代）才能再生出母合子突变体，整个过程通常耗时六个月以上。相比之下，扩增生殖干细胞冷冻保存保留完整的二倍体遗传信息。将纯合子供体的解冻扩增生殖干细胞（eGSCs）移植到纳米样蛋白2缺失（nanos2-/-）宿主中后，供体来源的精子和卵母细胞直接促成(F_{1})子代的产生，在约三个月内实现100%的母源合子突变体（MZ mutant）。综上，这套整合的基于eGSC的系统可在单代内快速恢复复杂基因型，并为斑马鱼的长期遗传资源保存提供了可扩展的框架。 缩写说明：GSC：生殖系干细胞；eGSC：生殖干细胞扩增；WT：野生型；Z突变体：合子突变体；MZ突变体：母源-合子突变体。

宿主选择对GSC移植的成功同样至关重要。保留内源性生殖细胞可提供支持性的性腺微环境，但会竞争生殖细胞龛位通常会限制供体细胞的定植25。这与我们在野生型（WT）宿主中观察到的结果一致，在该宿主中内源性生殖细胞未被消除（图4D）。一种广泛用于提高供体细胞植入效率的策略是使用生殖细胞缺陷型宿主，其可通过dnd1_MO吗啉代注射或生殖系缺陷突变体等方法构建，这类宿主会消除内源性生殖细胞，从而为供体细胞腾出空的微环境，同时也提高了生殖干细胞（GSC）移植的成功率。。本研究中的移植效率低于此前报道的21，原因可能是每个宿主移植的供体细胞数量更少，因为本研究中的供体细胞仅来自一条鱼，而以往研究很可能使用了多条鱼。另一种独特的策略是使用三倍体宿主，这类宿主通常是通过保留受精后的第二极体诱导产生的，其奇数的染色体数会扰乱减数分裂，进而导致宿主不育。在包括鲑科鱼类、金鱼以及草鲀T. alboplumbeus在内的几种具有性染色体的鱼类中，此类策略已通过生殖细胞移植成功培育出供体来源的卵子，这表明未分化的睾丸生殖细胞移植到雌性性腺微环境中后，可分化为卵母细胞。然而，在斑马鱼中，发育早期内源性生殖细胞的消除通常会导致全雄表型，从而无法形成卵母细胞发生所需的雌性性腺环境。在此背景下，nanos2-/-突变体具有独特优势。以往研究已证实生殖细胞（尤其是卵母细胞）在雌性性别决定以及整个发育过程中维持雌性状态方面发挥着关键作用。Nanos2是一个保守的生殖系干细胞基因，对生殖干细胞的自我更新至关重要。有研究表明，nanos2-/-雌性个体中生殖干细胞（GSCs）的缺失会导致卵巢再生失败，并最终发生性逆转成为雄性。这一结果与我们的研究发现一致，尽管这些鱼会随时间丢失卵母细胞，但它们在发育早期会短暂维持雌性微环境。我们利用这一短暂窗口支持生殖干细胞来源的卵母细胞发生，证实随着内源性卵母细胞的丢失，供体生殖干细胞可分化为功能性卵母细胞。该机制能有效维持雌性命运，并实现供体来源卵子的稳定产生。以nanos2-/-突变体作为宿主，我们在3个月内成功从F1代后代中获得了功能性的供体来源卵子和精子。因此，nanos2-/-宿主模型为在斑马鱼中培育供体来源的卵母细胞，这是硬骨鱼类种系代孕研究中长期存在的一大难题。

除了提高移植效果外，该系统还显著加快了MZ突变品系的重建。在本研究中，使用nanos2-/-宿主，在F1后代中100%回收了MZnanog胚胎。传统精子冷冻保存与基于GSC的冷冻保存的直接对比（图5）进一步凸显了我们方法的实际优势。与需要连续进行F1–F2–F3繁育以恢复MZ突变体的精子冷冻保存不同（图6，左下），基于GSC的方法可直接完成(F_{1})的重建，同时供体鱼的二倍体遗传完整性得以保留。当解冻的GSCs被移植到nanos2-/-宿主中时，供体来源的配子直接参与父系和母系谱系，使得在第一代（F1）即可直接生产100%的MZ突变体（图5，右下）。这一创新将恢复周期缩短至约三个月，为复杂基因型的恢复提供了更直接、高效的途径。

生殖干细胞的保存是保护脊椎动物遗传资源的关键策略。此前有研究报道鱼类睾丸组织冷冻保存技术已取得重大进展。在具有明确性染色体的物种中，例如一年一产的鲑鱼、虹鳟鱼（虹鳟，即虹鳟鱼，Oncorhynchus mykiss）以及青鳉（Oryzias latipes）的研究中，研究人员已证实，包括生殖干细胞（GSCs）在内的生殖细胞会根据宿主的性别分化为精子或卵子，这表明其具有内在的双向分化潜力。在本研究中，我们证明了冷冻保存的睾丸生殖干细胞在移植到异性宿主后，能够分化产生功能性精子和卵母细胞。这些发现证实了睾丸生殖干细胞的双向发育潜力，并表明此前被称为精子发生干细胞（SSC）的生殖细胞群应更准确地定义为睾丸生殖干细胞。重要的是，这种基于生殖干细胞的保存体系为遗传资源的长期保存提供了概念和技术框架，包括来自动物模型和濒危物种的遗传资源。

总之，本研究为斑马鱼中基于GSC的生殖系保存和遗传资源再生建立了一个通用框架。通过整合GSC体内扩增、冷冻保存和移植技术，该系统可实现二倍体水平的种质保存，并能快速恢复复杂的基因型。该系统不仅推动了斑马鱼遗传资源管理的发展，还可已扩展至多种硬骨鱼类，在水产养殖、生物多样性保护方面具有广泛应用，以及生物医学领域。这一整合策略架起了基础生殖生物学与应用保护技术之间的桥梁保护技术，为各类脊椎动物的下一代生殖系工程铺平了道路。

实验部分

斑马鱼饲养

本研究所用斑马鱼饲养于中国斑马鱼资源中心（CZRC），饲养条件为标准实验室条件（14小时光照/10小时黑暗周期，28.5摄氏度）。所有野生型、突变型和转基因本研究使用的斑马鱼品系均为AB背景。细胞色素P450 11亚家族使用高分辨率熔解曲线（HRM）分析对2号成员（cyp11a2）ihb317/ihb317品系进行了基因分型；该对纳米同源盒（Nanog）ihb98/ihb98 以及纳米同源物 2（Nanos2）zf3087/zf3087 品系进行了基因分型直接桑格测序；以及 (Tg(ddx4:EGFP)z145Tg) 位点的阳性个体（其中 ddx4 为 DEAD-box如先前报道6,23,31,51所述，通过荧光筛选鉴定出解旋酶4）转基因品系。该用于对所有突变株进行基因分型的引物列于补充表S1。实验前，实验前，斑马鱼在水中用 0.2 毫克/毫升的三卡因甲磺酸盐（MS-222；Sigma）进行麻醉水。所有涉及斑马鱼的动物实验均经机构动物实验委员会审查并批准。中国科学院水生生物研究所动物伦理与使用委员会（方案编号：编号：IHB/LL/2022051）。实验按照获批的方案执行，且我们已遵守所有相关的动物实验伦理法规。

斑马鱼生殖细胞的冷冻保存与解冻

为建立优化的冷冻保存方案，需同时处理睾丸组织碎片和分离的生殖干细胞经Percoll密度梯度离心法富集后，先进行了六个月的冷冻保存，随后活力评估。简要来说，收集成年斑马鱼 (n=3) 的完整睾丸，在 L-15 培养基中冲洗中等大小，切成约5×5×5毫米的碎片，转移至含有500微升的冷冻管中含渗透性冷冻保护剂的冷冻保存培养基。样品在冰上预冷0.5–1小时，在程序冷冻容器中逐渐冷却至 -80 °C 过夜，随后储存于液氮。对于单独的生殖干细胞冷冻保存，先通过Percoll梯度离心分离富集睾丸细胞，使用纽鲍尔计数板计数，然后分装（500微升冷冻保护剂中含1×10^(1 ×10^{5})个细胞）后再进行冷冻，遵循相同的冷却和保存方案。解冻在32℃水浴中进行2分钟，随后在添加10%胎牛血清的L-15培养基中稀释以去除冷冻保护剂。之后，对睾丸组织进行解离，并按照先前描述的方法，有或无Percoll富集时纯化生殖干细胞29。

睾丸细胞活力检测

在冷冻保存方案优化过程中，按照此前报道的方法，从一尾鱼中分离富集睾丸细胞和生殖干细胞（GSCs）。简要来说，将睾丸组织在2 mL含0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司）、0.26单位 Liberase酶和0.05%脱氧核糖核酸酶I的L-15培养基中，于28℃条件下温和振荡孵育2至3小时。加入10%胎牛血清（体积比）终止反应，随后通过40微米细胞筛（NEST公司，中国，货号258369）过滤。将生殖干细胞或睾丸细胞重悬于L-15培养基中，采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色法检测细胞活力。

生殖干细胞与睾丸细胞移植（GSCT 与 eGSCT）

在移植实验中，经Percoll密度梯度离心富集的单条供体鱼生殖干细胞被定义为生殖干细胞移植（GSCT），而未经过该离心处理的扩增生殖干细胞（eGSC）则被定义为扩增生殖干细胞移植（eGSCT）。除非供体细胞来自Tg(ddx4:EGFP)鱼（可通过荧光直接追踪），否则均使用CellTracker™ CM-DiI（货号C7000，Invitrogen公司）对其进行标记。同时，除nanos2-/-宿主外，其余移植宿主（包括野生型WT和cyp11a2-/-）均按照既往研究[23,52]的方法，在1细胞期向宿主胚胎中注射100 nM的dead end 1（dnd1）反义吗啉代寡核苷酸（dnd1_MO，序列为5'GCTGGGCATCCATGTCTCCGACCAT-3'），以耗竭内源性原始生殖细胞。受精后4天（dpf），在体视显微镜下将供体细胞移植至宿主的生殖嵴。移植后3天（dpt），剔除无荧光信号的宿主，剩余幼鱼饲养至成年，用于繁殖能力分析。

免疫荧光检测

对解离的睾丸细胞和性腺切片进行了免疫染色。免疫荧光染色使用以下抗体，稀释比例均为1:500：抗Vasa抗体、抗Nanos2抗体、抗Sycp3抗体和抗Pcna抗体。所有抗体均针对斑马鱼抗原制备，并由本实验室通过抗原亲和层析纯化。这些抗体的有效性和特异性已在先前的研究53中详细阐述。兔源一抗抗Nanos2（1:500，自制（华岳生物），RRID: AB_2895084；http://antibodyregistry.org/AB_2895084）已在本团队已发表的研究23中使用。二抗使用兔源Alexa Fluor 594（Molecular Probes公司，RRID: AB_141637；https://antibodyregistry.org/AB_141637），稀释比例为1:1000。样品经4%多聚甲醛固定并洗涤后，在含1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%二甲基亚砜（DMSO）的磷酸盐缓冲液-吐温（PBST，含0.1% Triton-100，pH 7.4）中于室温封闭1-3小时。抗体孵育在4℃下过夜进行，随后使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，中国碧云天公司）在室温下复染1小时。样品用VECTASHIELD®封片后，在徕卡SP8共聚焦显微镜（SP8，徕卡公司）下，搭配LD C-Apo 40×/数值孔径1.1水浸物镜进行成像。图像分析至少从3条独立的斑马鱼中获取切片样本。

评估可育的移植成体及F1代子代检测

将移植的成年宿主与野生型斑马鱼自然交配，以评估产卵率和受精率。对于来自 Tg(ddx4: EGFP) 供体的后代，在受精后5天（5 dpf）使用体视荧光显微镜（Axio Zoom.V16，蔡司）检测 F1 胚胎中 EGFP 荧光的定位情况。对于来自 nanog-/- 供体的后代，在受精后6小时（6 hpf）评估其胚胎表型。

RNA测序与分析

使用 RNA 纯总 RNA 提取试剂（中国 Vazyme 公司），从 4 小时受精后（hpf）的野生型（WT）和移植斑马鱼胚胎中分离总 RNA。通过 Nanodrop、Qubit 和 Labchip GX 对 RNA 完整性进行评估。每个样本取 50 纳克 RNA，采用用于 Illumina 平台的 Universal V6 RNA 测序文库制备试剂盒（中国 Vazyme 公司）进行文库构建。在 Illumina NextSeq 500 平台上进行测序，生成 150 碱基对的双端读长。将读长序列比对至斑马鱼基因组（GRCz11），使用 featureCounts（v1.6.0）进行定量分析，并利用 DESeq2（v1.22.1）进行差异分析。差异表达基因被定义为 (|log _{2} FCl| ≥1.0) 并经校正为 (P<0.05)。利用 ClusterProfiler（v4.0）对差异表达基因进行基因本体（GO）富集分析。

组织学分析

对于手术操作，成年斑马鱼通过浸泡在0.2毫克/毫升的MS-222溶液中进行麻醉。实施安乐死时，成年斑马鱼浸泡在致死剂量为2毫克/毫升的MS-222溶液中完成安乐死，该操作符合机构动物护理与使用委员会的指导方针。在受精后3个月（3 mpf），从野生型（WT）和移植斑马鱼体内分离卵巢组织。组织经4%多聚甲醛（PFA）固定过夜、脱水后，用石蜡包埋，切成4微米厚的切片。切片经苏木精-伊红（H&E）染色后，在奥林巴斯BX53显微镜下进行成像观察。

数据分析

所有数据均以至少3次独立生物学重复的平均值±标准误（SEM）呈现。统计分析采用GraphPad Prism软件（9.0版，美国GraphPad Software公司）进行。两组间差异采用非配对双尾Student’s t检验分析，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。统计显著性定义如下：*：(P<0.05) * (P<0.01)，***：(P<0.001) **** (P<0.0001)，ns：无显著差异。所有图表均使用GraphPad Prism软件绘制。