题目：Novel endopeptidase overcoming lysostaphin resistance

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41598-026-43937-3

摘要

本研究报道了一种新型酶LssR的发现与特性分析，该酶来自模仿葡萄球菌，属于M23肽聚糖水解酶家族。克隆了LssR的三种变体，即全长蛋白（LssR_FL）、成熟形式（LssR_M）和催化结构域（LssR_CD），并在异源大肠杆菌系统中进行了过表达和纯化。系统评估了这些变体的溶菌活性，并为每种变体确定了最佳条件。值得注意的是，所有变体均对活葡萄球菌细胞展现出强劲的溶菌活性，包括对通常赋予耐溶葡萄球菌素抗性的含丝氨酸交联桥菌株。据我们所知，这是首次报道一种新型内肽酶可裂解葡萄球菌肽聚糖中的含丝氨酸交联桥，凸显了LssR作为一种有望克服潜在溶葡萄球菌素抗性的抗菌剂的潜力。

关键词 溶葡萄球菌素，金黄色葡萄球菌，肽聚糖水解酶，M23 肽酶

引言

金黄色葡萄球菌以及某些其他葡萄球菌属菌种是感染人类和其他哺乳动物的致病性细菌，可引发多种疾病，包括皮肤和眼部感染、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎以及食物中毒。这些病原体常从血管相关和异物相关的医学样本中被分离出来。除了形成可侵袭组织的生物膜外，它们还是耐药基因的储存库。携带耐药基因葡萄球菌的流行率不断上升，以及现有抗生素治疗这类感染所面临的挑战，凸显出迫切需要开发对这类细菌有效的新型抗菌剂。自1928年青霉素被发现以来，抗生素的研发历程始终伴随着细菌的快速适应性进化，正如亚历山大·弗莱明所预言的那样：“在适宜的环境下，细菌很可能通过某种方式获得‘耐受性’[耐药性]，从而对任何化疗药物产生反应”。在许多情况下，耐药性会在新抗生素投入使用后的数年内出现。作为低分子量治疗药物的替代选择，溶葡萄球菌素（Lss）的发现为基于溶菌酶的抗菌剂研发开辟了新途径。溶葡萄球菌素是一种源自模仿葡萄球菌溶葡萄球菌生物型的肽聚糖水解酶，属于M23家族（MEROPS数据库）。溶葡萄球菌素通过其特异性甘氨酰-甘氨酸内肽酶活性，能够有效裂解金黄色葡萄球菌及其他葡萄球菌（包括耐药菌株）的细胞壁。该活性靶向葡萄球菌肽聚糖（PGN）中的五甘氨酸交联桥。M23酶属于金属肽酶，其活性依赖于由两个组氨酸残基和一个天冬氨酸残基配位的(Zn^{2+})离子，形成了保守基序：HXXXD和HXH。在结构上，溶葡萄球菌素由N端信号肽、前肽、催化结构域（CD）、细胞壁靶向结构域（CWT）以及连接CD与CWT的柔性连接肽组成。

在抗生素耐药性（AMR）背景下，溶葡萄球菌素通过不同于传统抗生素的机制降解细菌细胞壁，使其成为治疗葡萄球菌感染的有力候选药物。此外，溶葡萄球菌素对形成生物膜的金黄色葡萄球菌展现出疗效，而形成生物膜是慢性感染的常见特征，这类感染用传统抗生素治疗难度极大。研究人员已在多种医疗应用中评估了溶葡萄球菌素的抗菌潜力，结果显示其疗效显著。溶葡萄球菌素的抗菌谱较窄，仅针对葡萄球菌属，这与传统抗生素的广谱效应形成对比——传统抗生素会破坏正常微生物群，进而导致菌群失调。除治疗潜力外，溶葡萄球菌素还在各类生物技术应用中受到关注。其溶菌活性被用于食品保鲜，以控制乳制品和肉类中的葡萄球菌污染。此外，它还被研究作为农业中的生物防治剂，用于管控动植物体系中的葡萄球菌污染，为化学处理提供了一种环保替代方案。

尽管溶葡萄球菌素具有良好的特性，但仍有若干挑战阻碍其在治疗和工业领域的充分开发应用。酶的稳定性、递送策略以及大规模生产等问题亟待解决，以实现溶葡萄球菌酶是抗生素的一种可行替代方案。值得注意的是，主要担忧在于耐药性的潜在产生。作为一种细菌素，溶葡萄球菌酶使模仿葡萄球菌能够消除其生态位内的竞争细菌。为避免自身裂解，模仿葡萄球菌采用由epr基因（也称为lif——溶葡萄球菌酶免疫因子）介导的自身免疫机制。该基因促使其肽聚糖五肽交联桥中掺入丝氨酸而非甘氨酸。编码溶葡萄球菌酶及其免疫因子的基因位于质粒上，可水平转移至其他葡萄球菌菌株，从而推动耐药性的传播。实验表明，携带epr基因的金黄色葡萄球菌菌株对溶葡萄球菌酶的敏感性降低约十倍。这种耐药基因的质粒介导迁移特性增加了耐药性产生的可能性，这一点已在体外实验中得到证实。

本研究描述了一种新型溶葡萄球菌素样肽聚糖水解酶（命名为 LssR）的发现与特性表征。与溶葡萄球菌素不同，LssR 在模仿葡萄球菌中由染色体编码。研究人员克隆了 lssR 基因，并对该蛋白进行了表达、纯化及全面的特性分析。LssR 具有强效的抗葡萄球菌活性，且重要的是，其对含丝氨酸替代交联桥的细菌细胞壁仍保持活性。此外，LssR 在较宽的 pH 值和离子强度范围内均表现出活性，在血清中仍能发挥作用，这凸显了其作为新型抗菌剂的潜力。值得注意的是，生物学实验表明 LssR 无细胞毒性且无致畸性，这为其在人和动物体内安全的治疗应用提供了可能。

结果

蛋白质鉴定

本研究旨在鉴定并表征一种对内肽菌具有独特活性的内肽酶，这类葡萄球菌会将丝氨酸残基整合到其肽聚糖交联桥中，以此作为对这类酶产生耐药性的机制。研究人员在模仿葡萄球菌DSM20322的基因组中对溶葡萄球菌素的同源物进行了搜索。通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的基本局部比对搜索工具（BLASTP），鉴定出了一条编码424个氨基酸长蛋白的基因（登录号：KXA44996.1）。该蛋白包含N端信号肽、前肽序列、催化结构域以及C端细胞壁靶向（CWT）结构域（图1A和B）。

N端信号肽的存在表明该定位于细胞外。前肽在其他肽酶中发挥抑制作用，但其与任何已知蛋白均无显著序列相似性。CD结构域属于MEROPS M23家族，即(Zn^{2+})依赖的内肽酶，具有锌结合和酶活性所必需的特征性HxxxD和HxH基序。C端CWT结构域被归类为SH3b家族的成员。序列比对显示，这种新型蛋白的催化结构域（CD）与溶葡萄球菌素（Lss）的氨基酸序列同源性达68%，而C端的CWT结构域同源性达73%。将LssR的AlphaFold模型与溶葡萄球菌素的结构进行比对，证实这两种蛋白在其催化结构域和细胞壁结合结构域之间存在高度的结构相似性（图S1）

基于其与溶葡萄球菌素的相似性，以及对溶葡萄球菌素耐药菌株的潜在活性，这种新发现的蛋白质被命名为 LssR。

基因座结构

利用操纵子分析工具分析了模仿葡萄球菌基因组中编码LssR的基因（登录号：KXA44996.1）的位点。该基因与另外两个基因共定位，分别编码IS1272蛋白（上游）和FmHA样蛋白（下游）。分析表明，lssR基因与相邻的编码氨酰基转移酶FmhA样蛋白的基因共同转录。FmhA属于非核糖体肽基转移酶家族，该家族负责构建肽聚糖交联桥并决定其长度与氨基酸组成。FmhA样蛋白与金黄色葡萄球菌FmhA的氨基酸序列一致性为67%，已知后者会在交联桥的第3位和/或第5位掺入丝氨酸残基。这种基因排布与溶葡萄球菌素操纵子类似，其中lss基因与其免疫因子epr共同转录。同样，兽疫链球菌中编码肽聚糖水解酶佐辛A（zooA）的基因也与其免疫因子一同转录。

lss和zooA基因均被类转座子序列侧翼包围。值得注意的是，在lssR基因下游发现了一个编码转座酶家族蛋白IS1272的基因，这表明水平基因转移可能是此类水解酶系统获得的原因（33,34）（图S2）。克隆与蛋白质初始纯化。对三种蛋白质变体进行了初步小规模纯化，以评估其表达水平和可溶性。LssR_FL（全长LssR）和LssR_M（成熟LssR）均以可溶形式成功表达并纯化。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析显示，其条带清晰，分子量与理论值相符：LssR_FL为44.6千道尔顿（TEV蛋白酶切割后为42.1千道尔顿），LssR_M为30.6千道尔顿（TEV切割后为28.1千道尔顿）（图S3A和B）。相比之下，LssR_CD（LssR的胞内结构域）变体主要以包涵体形式产生，仅回收到微量可溶性蛋白。为提高可溶性，将LssR_CD与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合表达，得到了可溶产物，其在SDS-PAGE上显示为单一条带，分子量与57.7千道尔顿的理论值一致。用TEV蛋白酶切割MBP标签后，通过尺寸排阻色谱法分离产物。得到的条带与MBP（42.4千道尔顿）和LssR_CD（15.3千道尔顿）的预期分子量相符（图S3 C-E）。通过热移位分析对纯化缓冲液进行了进一步优化，该分析有助于确定能提高蛋白质稳定性和可溶性的缓冲液配方（图S4）。

图1. (A) LssR蛋白结构域组成的示意图。结构域以方框表示，并根据其预测功能进行标记：信号肽（SP）、N端结构域（ND）、催化结构域（CD）、连接区（L）和细胞壁靶向结构域（CWT）。结构域的大致边界由氨基酸位置标出。本研究设计的构建体展示于下方，标记如下：LssR_FL（全长蛋白）、LssR_CD（催化结构域）和LssR_M（成熟形式）。(B) LssR与溶葡萄球菌素在CD、L和CWT区域的序列比对。催化结构域（CD）内M23家族蛋白特征性的保守基序：负责催化锌离子配位的HxxxD和HxH，分别以蓝色和黄色背景突出显示。

LssR的特异性

首先，我们评估了所生成的蛋白质变体是否具有酶活性，以及能否裂解其细胞壁肽聚糖中含丝氨酸交联桥的细菌。既往研究表明，N端前肽的存在（可能发挥抑制作用）以及反应的缓冲条件（尤其是离子强度）会对肽聚糖水解酶的活性产生显著影响。因此，我们在两种缓冲液中开展了初步活性测试：低离子强度缓冲液（50 mM 甘氨酸，pH 8.0）和高离子强度缓冲液（50 mM 甘氨酸，pH 8.0，100 mM 氯化钠）。通过浊度降低实验，利用活的金黄色葡萄球菌8325-4菌株和模仿葡萄球菌CCM3583菌株细胞，对细菌裂解活性进行了评估（图2）。我们检测到所有变体对两种测试细菌均具有活性。全长蛋白（LssR_FL）和成熟形式（LssR_M）在高离子强度缓冲液中均表现出更高的活性。相反，单独的CD结构域（LssR_CD）仅在低离子强度条件下表现出显著活性，而在氯化钠存在的情况下其活性几乎完全丧失（图2）。

总体而言，这些结果表明，LssR 变体对其肽聚糖中含有典型五甘氨酸交联桥或丝氨酸取代交联桥的葡萄球菌菌株仍保持强效的溶菌活性。为确认 LssR 确实是一种具有内肽酶活性的肽聚糖水解酶，我们利用从金黄色葡萄球菌和模仿葡萄球菌中纯化的肽聚糖开展了酶解实验，并对反应产物进行了质谱分析。我们从金黄色葡萄球菌 NCTC 8325-4（含典型五甘氨酸交联桥）和模仿葡萄球菌 CCM3583（含由甘氨酸和丝氨酸组成的交联桥）中分离了肽聚糖。首先用变溶菌素对两种肽聚糖样品进行酶解，生成小分子可溶性底物（胞壁肽），随后用 LssR 处理。无论丝氨酸残基是否存在，LssR_M 处理均能产生质量对应于交联桥被切割的肽聚糖片段的产物。与仅用变溶菌素处理的对照组样品相比，LssR_M 处理样品的超高效液相色谱（UPLC）色谱图中，对应肽聚糖单体的峰丰度显著增加，而对应完整交联产物（二聚体、三聚体和四聚体）的峰则明显减少（图3）。这些结果表明，LssR 是一种具有内肽酶活性的肽聚糖水解酶，能够切割仅含甘氨酸以及含甘氨酸/丝氨酸的交联桥，但仍需进一步的串联质谱（MS/MS）分析来明确确认所鉴定肽聚糖片段的结构。

图2. 采用浊度降低法评估LssR变体对金黄色葡萄球菌8325-4和模仿葡萄球菌CCM3583的溶菌活性。在21℃下，于含（+）或不含（-）氯化钠的50 mM甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中，与100纳摩尔酶孵育60分钟后，测定光密度（OD595）的降低值。结果为以(O D_{595})相对于对照组（未加酶培养的细胞）的降低百分比表示。**** - (P<0) .0001，采用Sidak事后多重比较法的双因素方差分析

图3. 经溶菌酶（金色）或同时经溶菌酶与LssR_M（黑色）处理后，金黄色葡萄球菌NCTC 8325-4（A）或模仿葡萄球菌CCM3583（B）的肽聚糖消化产物的分离结果。肽聚糖经以下试剂处理：在50 mM、pH 8.0的甘氨酸缓冲液中，于50℃下仅处理24小时；或随后在添加100 mM氯化钠的相同缓冲液中，于室温下用LssR_M酶解24小时。样品通过超高效液相色谱（UPLC）分离，并使用质谱仪进行分析。各图展示了单体制品与高分子量肽聚糖片段分离的色谱图。示意图基于从所得质荷比（m/z）光谱推断的质量，描绘了单体反应产物的结构（图S5、表S2）。

为进一步明确LssR的底物特异性，我们针对多种细菌菌株开展了活性测定实验（图4）。对于肽聚糖存在直接交联的菌株，如枯草芽孢杆菌和棒状杆菌属菌株，未检测到裂解活性。同样，那些肽聚糖交联桥由短肽构成的菌株，例如仅含D-天冬氨酸的乳酸乳球菌和含二丙氨酸的无乳链球菌，也未被裂解（图4）。

我们随后评估了LssR_CD和LssR_M酶变体对含五甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸交联桥的多种葡萄球菌的活性。除科氏葡萄球菌外，这两种酶变体对所有测试的葡萄球菌菌株均表现出强劲的溶菌活性。值得注意的是，科氏葡萄球菌对LssR_CD高度敏感，而对LssR_M的敏感性显著降低，这表明细菌细胞壁的其他结构成分参与了酶活性的调控。

为了确认在单一细菌菌株背景下，肽聚糖交联桥中丝氨酸的存在是否会影响 LssR 活性，我们测试了金黄色葡萄球菌 TF5303 菌株（其含有天然五甘氨酸交联桥）及其同基因变体 TF5311 菌株（该菌株表达 epr 基因，使丝氨酸掺入交联桥中）。所得结果证实，肽聚糖交联桥组成的这种修饰对所测酶的效率仅有轻微影响（图 S6）。为进一步研究细胞壁聚合物其他组分（特别是壁磷壁酸，WTAs）的可能作用，我们用衣霉素（一种磷壁酸生物合成抑制剂）处理金黄色葡萄球菌 TF5303 和 TF5311 菌株的培养物，制备了磷壁酸耗竭细胞。此外，本研究还纳入了一株磷壁酸缺陷突变株——金黄色葡萄球菌 RN4220ΔtagO，该菌株缺失磷壁酸生物合成初始步骤必需的 tagO 基因。

图4. LssR_M和LssR_CD对不同肽聚糖交联桥组成（用单字母氨基酸代码表示或标注为DIRECT——无交联桥）的细菌菌株的溶菌活性。进行了浊度降低测定将细菌细胞与 100 纳摩尔/升的每种酶在 21 摄氏度下于 50 毫摩尔/升甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中孵育 1 小时：对于 LssR_CD，仅使用该缓冲液；对于 LssR_M，则补充 100 毫摩尔/升氯化钠。酶活性以初始底物减少的百分比表示，该百分比经阴性对照（未加酶孵育的细胞）归一化处理。(O D_{595}) (P<) 0.0001，(** -P<0.01)，(*-P<0.05)，采用 Sidak 事后多重比较检验的双因素方差分析

在浊度降低实验中，缺失WTA的细胞对LssR_M酶的敏感性与其亲本菌株相同（图S6）。然而，LssR_CD酶对缺失WTA的细胞的活性显著降低，这表明CD的活性高度依赖于WTA。

LssR 的裂解效率

为进一步对这些酶进行特征分析，我们将其活性与溶葡萄球菌素进行了对比——溶葡萄球菌素可裂解葡萄球菌肽聚糖交联桥中的甘氨酰-甘氨酸键。为开展详细的抗菌特征分析，我们选取了活性最高的酶变体LssR_CD和LssR_M。以溶葡萄球菌素为参考内肽酶，我们通过浊度降低法和菌落形成单位（CFU）减少法两种方式评估了抗葡萄球菌活性。测试所用菌株为拥有五甘氨酸交联桥的金黄色葡萄球菌8325-14，以及在交联桥中同时掺入甘氨酸和丝氨酸的模仿葡萄球菌CCM3583。

总体而言，与模仿葡萄球菌相比，所有酶对金黄色葡萄球菌均表现出更高的效力（图5）。在低至50纳摩尔的浓度下，LssR_CD 就能在一小时内将金黄色葡萄球菌的菌数从10⁸ (10^{4}) 菌落形成单位降至更低水平，而100纳摩尔的 LssR_CD 则能完全杀灭(10^{8}) 数量的金黄色葡萄球菌。要达到相当的杀菌效果，溶葡萄球菌素的使用浓度需达到200纳摩尔（图5）。其活性为LssR_M的作用与溶葡萄球菌酶相似，且明显取决于酶的浓度。

这些酶快速的溶菌作用也十分明显，培养的前10分钟内初始光密度下降了70%至80%（图6）。

所有测试浓度的 LssR_CD 均使初始的 (OD 595) 降低了约 85%，且该效果在 20 分钟后即可实现（图 6）。LssR_M 也表现出类似的浊度快速降低效果，仅在酶浓度最低的 50 纳摩尔时速度稍慢。与所测试的 LssR 酶相比，溶葡萄球菌素在浊度降低实验中的效率也更低，即便以 200 纳摩尔的浓度使用亦是如此。

与溶葡萄球菌素不同，LssR_CD和LssR_M对模仿葡萄球菌均具有高度活性。在200纳摩尔浓度下，LssR_CD将模仿葡萄球菌的细胞数量从超过10⁸个降至约(10^{4})，而LssR_M将初始细菌细胞数量降至10⁵个菌落形成单位。相比之下，溶葡萄球菌素对模仿葡萄球菌的活性微乎其微（图5）。浊度降低实验进一步表明，尽管模仿葡萄球菌的裂解速度慢于金黄色葡萄球菌，但即使在最高浓度下，光密度的最终降幅中约有一半发生在孵育的前10分钟内（图6）。值得注意的是，在两种实验中均证实溶葡萄球菌素无法有效清除模仿葡萄球菌。

这些研究结果表明，与溶葡萄球菌素不同，LssR_CD 和 LssR_M 均对将丝氨酸整合到肽聚糖交联桥中的葡萄球菌菌株展现出独特的溶菌活性。

图5. LssR_CD和LssR_M对细菌的清除效果。以金黄色葡萄球菌8325-4和模仿葡萄球菌CCM3583为对象，使用50、100和200纳摩尔浓度的LssR_CD、LssR_M以及作为参照的Lss进行实验。实验采用了菌落形成单位减少分析法，酶类为在50mM、pH 8.0的甘氨酸缓冲液中，将其与细菌细胞（108 CFU/ml）在21℃下孵育2小时（仅针对Lss_CD）；针对LssR_M和Lss，则在上述缓冲液中补充100mM NaCl后进行相同条件的孵育。通过系列稀释平板法对菌落形成单位（CFU）进行定量分析。**** - P < 0.0001，** - P < 0.01，采用Sidak事后多重比较法的双因素方差分析

图6. LssR_CD和LssR_M的溶菌活性。采用不同浓度的LssR_CD、LssR_M以及作为参照的Lss，对金黄色葡萄球菌8325-4和模仿葡萄球菌CCM3583进行浊度降低实验。将细菌细胞与酶在21℃振荡条件下孵育60分钟。C-为对照组，细菌置于用于LssR_CD的甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中；C+为对照组，细菌置于用于LssR_M和Lss的添加100 mM氯化钠的甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中。(P<0.001)、(** -P<) 0.01、(* -P<0.05)，采用重复测量方差分析结合邓尼特事后多重比较检验，以无酶的对照组样本作为对照。

反应条件的影响

离子强度。以往研究表明，肽聚糖水解酶的活性受缓冲液离子强度的影响，且细胞壁结合结构域的存在在调节该酶活性方面发挥关键作用（35,36）。为进一步探究这一机制，我们在不同氯化钠浓度下检测了催化结构域（LssR_CD）和成熟酶（LssR_M）的活性。值得注意的是，LssR_CD即使在蒸馏水中，也能将细菌悬液的初始浊度降低约30%；在50 mM甘氨酸缓冲液等低离子强度缓冲液中，其活性可提升至70%以上。然而，当缓冲液电导率超过3 mS/cm时，其活性急剧下降，在约5 mS/cm以上（对应约50 mM氯化钠）时活性降至可忽略不计的水平。相比之下，包含CWT结构域的成熟酶LssR_M，即使在测试的最高盐浓度（250 mM氯化钠，约20 mS/cm）下仍保持稳定的活性（图7）。

这些研究结果凸显了CWT结构域在高盐条件下维持酶功能的关键作用，并证明了LssR_M相较于其单独的CD具有独特的功能特性。

图7. 离子强度对LssR_M和LssR_CD酶裂解活性的影响。采用悬浮于50 mM甘氨酸缓冲液（pH 8.0）中的模仿葡萄球菌CCM3583细胞进行浊度降低实验，缓冲液中添加了浓度递增的NaCl以获得不同的离子强度。缓冲液的电导率值（单位：微西门子/厘米）以灰色标注。在21 ℃孵育45分钟后测定(O D_{595})。酶活性以相对于无酶对照组的初始吸光度（OD₅₉₅）降低百分比表示****。(P<0.0001) *** (P<0.001)、(* -P<0.05)，采用双因素方差分析结合Sidak事后多重比较检验

以模仿葡萄球菌CCM3583和金黄色葡萄球菌8325-4菌株为研究对象，评估了pH对LssR_M、LssR_CD以及溶葡萄球菌素（Lss）活性的影响（图8）。溶葡萄球菌素在7.0至10.0的宽pH范围内对金黄色葡萄球菌均保持较强的活性，LssR_M的活性特征与之高度相似——其在上述pH范围内表现出高活性，且在更低和更高的pH值下也保留了一定活性。相比之下，在裂解模仿葡萄球菌时，LssR_M的最适pH范围更局限于7.0至8.0。而单独的CD结构域（LssR_CD）对两种细菌的活性pH范围更窄，仅为6.0至8.0（图8）。这些研究结果表明，与单独的CD结构域相比，LssR_M具有更广泛的功能灵活性，尤其是在不同pH和离子条件下（图8）。

图8. 利用浊度降低法评估pH值对LssR_M、LssR_CD以及参比酶溶葡萄球菌素（Lss）活性的影响。酶活性在与金黄色葡萄球菌8325-4共孵育60分钟后、与模仿葡萄球菌CCM3583共孵育100分钟后进行测定。结果以相对于阴性对照（不含酶的细菌悬液）的初始浊度降低百分比表示。****P<0.0001，***。(P<0.001)、(** -P<0.01)、(* -P<0.05)，采用双因素方差分析并以pH 8.0为对照进行Dunnett事后多重比较检验

离子螯合剂。蛋白质序列分析将LssR归为M23家族金属蛋白酶的成员。作为金属依赖性酶，M23金属蛋白酶已知对离子螯合剂敏感（40,41）。为了评估这种敏感性，在EDTA和邻二氮菲存在下测试了LssR_M和LssR_CD的活性（图S7）。EDTA浓度高达31mM时，LssR_M对金黄色葡萄球菌的活性基本上不受影响。即使在125mM EDTA时，也只观察到活性的适度降低，即使在250mM时也没有实现完全抑制。相比之下，当对模拟人S细胞进行测试时，从测试的最低EDTA浓度开始就有明显的抑制作用。LssR_CD也观察到类似的趋势。邻二氮菲对两种酶变体都显示出明显更强的抑制作用（图S7）。LssR_M，在2mM邻二氮菲时观察到对金黄色葡萄球菌的完全抑制作用，在大约0.5mM时观察到对模拟人S的完全抑制作用。记录了LssR_CD的可比抑制谱（图S7）。

这些结果表明LssR酶是相当敏感的邻二氮菲比EDTA，抑制程度取决于细菌菌株和酶的变体。

温度。我们测试了温度对LssR_M和LssR_CD裂解活性的影响。两种酶都有效地降低了21℃下金黄色葡萄球菌NCTC 8-3254和模拟葡萄球菌CCM3583细胞悬浮液的浊度。酶活性在37℃和45℃下进一步增加。相比之下，在4℃下，两种酶的活性明显下降，模拟葡萄球菌的活性下降更明显。（图S8）。

血清中LssR_M酶的活性

成熟的酶，LssR_M，与两种著名的抗金黄色葡萄球菌活性的溶葡萄球菌酶一起进行了评估：溶葡萄球菌毒素（Lss）和AuresinePLUS，这是一种嵌合酶，将LytM的催化结构域与溶葡萄球菌毒素的细胞壁结合结构域结合在一起（35）。Lss_CD变体被排除在这些测试之外，因为它在更高的离子强度条件下缺乏活性，例如血清中存在的那些。所有三种测试的酶在裂解含有五甘氨酸交叉桥的金黄色葡萄球菌细胞时都表现出相当高的效率（表1）。然而，用丝氨酸取代的交叉桥测试细菌菌株时观察到显著差异。溶葡萄球菌毒素和嵌合酶AuresinePLUS在甘氨酸缓冲液中的活性都显着降低，在血清存在下进一步下降。相比之下，LssR_M酶对含丝氨酸的金黄色葡萄球菌和模拟葡萄球菌菌株保持了强大的葡萄球菌活性，在甘氨酸缓冲液和血清中保持了有效性。有趣的是，血清对酶活性的影响因血清来源而异。对于模拟人，LssR_M在牛和人类中表现出非常高的活性但马和兔血清活性显著降低。值得注意的是，这种变异性是模拟葡萄球菌特有的，而金黄色葡萄球菌菌株没有观察到（表1）。

表1.在各种来源的血清存在下LssR_M、Lss和AuresinePLUS的活性。将细菌细胞（106 CFU/ml）与100nM的每种酶在37℃下孵育4小时。通过确定细胞存活来评估酶活性，并表示为初始细胞数量的log减少。

LssR蛋白的安全性

LssR_M的潜在毒性在体外（使用两种哺乳动物细胞系）和体内（使用斑马鱼胚胎）进行了评估。为了建立安全范围，在两种测定中测试了更高浓度的蛋白质（300 nM）。在MTT测定中，它该方法通过线粒体脱氢酶将MTT还原为甲臜来测定代谢活性，300纳摩尔的LssR_M处理对两种细胞系的细胞活力均无显著影响（图9A）。这表明LssR_M在所测试的条件下无细胞毒性或代谢影响，可认为其无毒性。在斑马鱼模型中，暴露于300纳摩尔的LssR_M未出现急性毒性迹象。所有胚胎均存活，且与对照组胚胎一样，未观察到发育迟缓、凝血异常、心脏水肿或其他畸形及毒性迹象（图9B、C）。综上，这些体外和体内实验结果有力证明，300纳摩尔浓度的LssR_M无毒性，这为其在涉及活生物体的潜在应用中安全使用100纳摩尔等更低浓度提供了支持。

图9.体外和体内LssR_M毒性评价。（A）对暴露于300 nMLssR_M22-24小时的人HaCaT角质形成细胞和NIH 3T3小鼠成纤维细胞进行MTT测定的结果。来自三个独立实验的数据呈现为细胞活力，表示为阴性对照（无LssR_M培养基）的吸光度百分比。（B）受精后96小时（hpf）代表性斑马鱼胚胎的侧视图。图像显示用300 nMLssR_M和未处理对照处理的胚胎。比例尺条=1毫米。（C）Bar图比较用300 nMLssR_M和未处理对照处理4天的斑马鱼胚胎的体长。没有观察到体长的显著差异。对于细胞活力: *** - P<0.001，双向方差分析与Sidak的事后多重比较测试，对于体长：结果不显著，未配对t检验。

讨论

抗生素耐药性和新的抗菌素

随着抗生素耐药性的挑战日益严峻，以及具有新作用机制和低耐药性流行率的新抗生素的稀缺，替代抗菌治疗正受到越来越多的关注。噬菌体疗法，已经为临床实施探索了很长时间，就是这种替代方法之一。类似地，酶生物制剂-具有强效的肽聚糖水解酶抗菌活性-已在研究实验室进行了深入研究，最近已推进到临床试验。

提前解决耐药性发展的重要性是抗生素历史上的一个重要教训。因此，耐药性的低流行率现在是新抗菌素最受欢迎的特征之一。在这种情况下，溶菌酶被认为是一个有希望和安全的选择，因为它们被认为在很大程度上难以抵抗耐药性发展。然而，尽管有这一假设，令人惊讶的是，很少有实验证据被公布来证实这一说法。

溶葡萄球菌酶可能是特征研究最为充分的肽聚糖水解酶，作为抗生素的替代品，它已得到广泛研究。尽管其抗葡萄球菌功效已得到证实，但由于可能引发免疫反应（包括产生降低治疗效果的抗体以及自然界中已存在的耐药机制），溶葡萄球菌酶的临床应用仍面临重大挑战。通过制备去免疫化形式，免疫反应问题已得到解决，而耐药性仍是尚未解决的问题。溶葡萄球菌酶在器械相关感染方面具有显著的治疗潜力。该酶清除表面生物膜的能力有助于预防难治性感染，也表明其有望作为预防剂发挥作用。

溶葡萄球菌酶由某些模仿葡萄球菌菌株产生，是其用于清除同一生态位内竞争葡萄球菌的强效武器。为了保护自身的肽聚糖，产溶葡萄球菌酶的菌株会将部分甘氨酸残基替换为丝氨酸，使交联桥对溶葡萄球菌酶产生抗性。这种免疫机制由质粒编码，使其易于水平转移，并推动溶葡萄球菌酶抗性在多种葡萄球菌物种（包括金黄色葡萄球菌）中传播。

为了应对溶葡萄球菌耐药性的挑战，我们寻找了一种具有溶葡萄球菌耐药性的酶，这种酶具有溶葡萄球菌的溶菌潜力，但能够裂解含有丝氨酸的交叉桥，这一特征赋予了溶葡萄球菌对溶葡萄球菌的耐药性。由于模拟葡萄球菌将丝氨酸纳入其肽聚糖交叉桥，我们假设它可能会产生一种肽聚糖水解酶，该酶对这些结构具有特异性，作为自溶素。我们已经确定了一种新的酶，LssR，能够裂解带有丝氨酸丰富的肽聚糖交叉桥的葡萄球菌菌株，从而发现了一种新的M23肽酶，该酶在模拟葡萄球菌基因组中具有所需的特异性，并证明了我们的假设是正确的。

LssR 在生物医学应用中的潜力

对新型抗菌药物的要求极具挑战性。尽管研究人员和制药行业在该领域付出了巨大努力，但近几十年来新注册的抗菌药物数量极少，这一点就体现了这一点。新型抗菌药物除了需具有低耐药率外，在快速编码任务中探索 Codex 的功能我们的数据表明，成熟酶（LssR_M）及其催化结构域（LssR_CD）对葡萄球菌菌株表现出鲁棒的裂解活性，即使是含有五甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸交叉桥的菌株。值得注意的是，交叉桥中丝氨酸的存在——一种已知的溶葡萄球菌素抗性机制——并没有实质性地损害LssR变体的裂解活性，将它们与溶葡萄球菌素和AuresinePLUS区分开来。

LssR_M的活性即使在复杂的生物基质如牛和人血清中也能持续存在，而溶葡萄球菌素和AuresinePLUS对丝氨酸取代的肽聚糖表现出显著的活性丧失。这种血清耐受性尤其相关，因为靶向金黄色葡萄球菌的治疗酶必须在血液和组织环境中保持活性。

新一代抗菌药物的另一个预期特征是其具有明确的、最好是较窄的特异性。

在多种细菌菌株中对LssR_M酶活性进行筛选，揭示了该酶的特异性与肽聚糖交联桥的组成及长度之间存在关联。这种选择性使该酶对葡萄球菌细胞具有极高的杀灭效果，而对其他细菌菌株则无影响。该酶对不同葡萄球菌物种的作用效果存在差异，这使其具备选择性清除致病菌株的额外优势。这一点对于开发靶向疗法尤为重要，这类疗法能够帮助重建皮肤微生物群的平衡，而特应性皮炎、银屑病等多种常见皮肤疾病会严重破坏这种平衡(50)。安全性评估证实，LssR_M 在浓度超过细菌裂解有效浓度时无毒性。对哺乳动物细胞系的体外测试以及使用斑马鱼胚胎的体内实验均未发现细胞毒性或发育缺陷的迹象，这支持了其在治疗应用中的潜力。

总体而言，这些研究结果凸显 LssR_M 是溶葡萄球菌素及相关内肽酶的一种极具潜力的替代物，尤其适用于治疗由葡萄球菌菌株引起的感染——这类葡萄球菌会将丝氨酸掺入其肽聚糖交联桥中，这是溶葡萄球菌素耐药性的一种已知机制（39）。该酶在生理相关的 pH 值、温度和离子条件下具有稳定性，同时具备血清耐受性和良好的安全性，这些特性彰显了其转化应用潜力。未来的研究将聚焦于 LssR 在感染模型中的体内疗效。

材料与方法

细菌菌株。本研究中使用的所有细菌菌株、其来源以及PGN（肽聚糖）组成均列于表2中。

基因鉴定。该基因在已发表的金黄色葡萄球菌模拟株基因组中被鉴定，其NCBI参考序列编号为NZ_CP014016.2。以甘氨酸-甘氨酸内肽酶LytM的催化结构域（CD）蛋白序列（21）为查询序列进行BlastP搜索。鉴定出一个由参考编码为KXA44996.1的基因编码的424个氨基酸的蛋白质。

克隆。从德国微生物和细胞培养物菌种保藏中心（DSMZ）购得斯氏泛菌（S. simulans，菌株号DSM 20322）。使用细菌基因组提取试剂盒（波兰格丁尼亚的A&A Biotechnology公司）提取其基因组DNA。通过SignalP-6.0软件（22）识别信号肽，并将其排除在克隆操作之外。利用表S1中列出的引物，通过聚合酶链式反应扩增出三种基因变体。使用两种经聚合酶链式反应线性化的表达载体：一种是带有N端组氨酸6标签（His6-tag）及烟草蚀纹病毒（TEV）酶切位点的pMCSG7载体，另一种是带有N端组氨酸6标签（His6-tag）、麦芽糖结合蛋白（MBP）及烟草蚀纹病毒（TEV）酶切位点的pMCSG9载体（均来自美国中西部结构基因组学中心）。通过无连接酶克隆法（LIC）将扩增得到的DNA片段克隆至上述载体中。对构建得到的质粒进行测序验证。

蛋白质的表达与初步纯化。本研究选用具有卡那霉素抗性的大肠杆菌BL21 Gold感受态细胞作为表达宿主。为进行纯化测试，将过夜培养的含氨苄青霉素-卡那霉素LB培养基菌液以1:20的比例稀释至5毫升新鲜培养基中复苏，于37℃培养3小时，至吸光度（(OD 600)）约为1。向培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，德国默克公司，美国），使其终浓度达到1 mM，随后于37℃继续培养3小时。4℃下以4000倍重力离心30分钟收集菌体，将菌体重悬于1毫升结合缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；500 mM 氯化钠；20 mM 咪唑）中，采用冻融裂解法破碎菌体。澄清后的裂解液与50微升经结合缓冲液平衡的HisTrap HP（美国通用电气医疗集团）树脂混合。与树脂结合的蛋白质先用0.5毫升结合缓冲液洗涤三次，再用100微升洗脱缓冲液（50 mM 三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH 8.0；500 mM 氯化钠；300 mM 咪唑）进行洗脱。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析纯化各步骤的样品，以评估蛋白质的质量与含量。根据初步纯化结果筛选用于大规模纯化的构建体，并进一步优化实验方案。

大规模蛋白质生产。对于大规模纯化，将蛋白质在大肠杆菌BL21 Magic细胞中于添加了100微克/毫升氨苄青霉素和50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中进行表达。当细菌培养物的吸光度约达到1.0时，将其冷却至18摄氏度，并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1毫摩尔。培养物在18摄氏度下持续振荡培养16小时。通过在4摄氏度下以4000倍重力离心30分钟收集细胞，并将细胞重悬于80毫升结合缓冲液（50毫摩尔MES，pH 6.2）中。500 毫摩尔氯化钠、20 毫摩尔咪唑）。加入核酸酶（Viscolase，波兰 A&A 生物技术公司），使其终浓度达到 12.5 单位/毫升。通过超声破碎细胞，4 摄氏度下以 100,000 倍重力离心 45 分钟，使裂解液澄清。上清液经 0.45 微米滤膜过滤后，通过 5 毫升预装的 HisTrap 层析柱（瑞典 BabyBio、Bio-Works 公司）。用 40 毫升结合缓冲液洗涤与树脂结合的分子。用 20 毫升洗脱缓冲液（50 毫摩尔 MES 缓冲液，pH 6.2；500 毫摩尔氯化钠；300 毫摩尔咪唑）洗脱目标蛋白。将洗脱后的蛋白在 4 摄氏度下于结合缓冲液中进行过夜透析，以降低咪唑浓度。同时，加入 TEV 蛋白酶，使其终浓度达到 0.05 毫克/毫升，从 LssR_FL 和 LssR_M 蛋白上切除 His6 标签，从 LssR_CD 蛋白上切除 His6 标签-MBP 融合蛋白。将蛋白混合物上样至 HisTrap 层析柱，以捕获所有未酶切的带标签蛋白和 TEV 蛋白酶。收集穿透液，转移至截留分子量为 10 千道尔顿的 Amicon Ultra 离心过滤管中，4 摄氏度下浓缩。将蛋白样品上样至经 SEC 缓冲液平衡的 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg 凝胶过滤柱（美国 GE 医疗保健公司），SEC 缓冲液成分为 20 毫摩尔 MES 缓冲液（pH 6.2）、200 毫摩尔氯化钠和 10% 甘油。合并含纯化蛋白的组分，使用 Amicon Ultra 离心过滤管（默克公司）进行浓缩。使用紫外分光光度计测定 280 纳米处的吸光度，从而计算蛋白浓度。摩尔消光系数 [ε] 采用以下方法计算：

ExPasy 服务器上的 ProtParam 工具（24），数值为 71740，标识符为 (71740 M^{-1} ×cm^{-1})，对应 (LssR_FL 64290 M^{-1})

(x cm^{-1}) 对应 LssR_M，(32890 M^{-1} ×cm^{-1}) 对应 LssR_CD。

用于对比实验的溶葡萄球菌素的制备方法如先前所述（9）。

酶活性和溶菌活性测定。通过浊度降低试验（TRA）监测细菌细胞悬液的光密度变化，并通过菌落形成单位（CFU）测定，来确定所研究蛋白不同形式的溶菌活性。

浊度降低测定法。所有以甘油管形式保存在-80℃的细菌菌株均在胰蛋白大豆肉汤（TSB）琼脂平板上复苏。从TSB琼脂平板上挑取单菌落，于37℃条件下在TSB培养基中过夜培养；对于金黄色葡萄球菌TF5303和TF5311菌株，培养基中添加30微克/毫升氯霉素，对于金黄色葡萄球菌RN4220ΔtagO菌株，培养基中添加2.5微克/毫升红霉素。将培养物复苏并在对数生长期收集，此时其浊度值约为0.6-0.8（对应编号(OD 595)）。

该实验在两种缓冲液中进行：一种是由 50 毫米甘氨酸（pH 8.0）组成的低离子强度缓冲液，另一种是由 50 毫米甘氨酸（pH 8.0）和 200 毫米氯化钠组成的高离子强度缓冲液。沉淀在反应缓冲液中重悬至 1.0 的 (OD 595)，将 100 微升该悬液转移到酶标板的每个孔中，并与 100 微升反应缓冲液中的待测酶（50 至 200 纳摩尔）混合。作为阴性对照组中，细菌悬浮于未添加酶的反应缓冲液中。在初始5秒混匀（T0）后，于室温下对(OD 595)进行指定时间的监测，至少每10分钟测量一次。结果以595纳米波长下测得的光密度降低值表示，计算为对照组（无酶）的百分比或归一化为指定值。每项测定均进行技术重复三次和生物学重复三次，生物学重复采用不同的细菌培养物。  菌落形成单位测定：按照浊度降低测定部分所述方法，对金黄色葡萄球菌8325-4和模仿葡萄球菌CCM3583的细菌细胞进行培养、收集和重悬。以50纳摩尔、100纳摩尔和200纳摩尔的浓度添加测试酶，反应体系于21摄氏度下孵育。在指定时间点收集样品。以添加无酶缓冲液的细菌悬液作为对照。制备反应混合物的系列稀释液，涂布于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上。37摄氏度过夜培养后计数菌落数，并计算每毫升菌落形成单位数。根据特定时间点对照组与样品之间的差异确定菌落形成单位降低率。该实验重复两次。

肽聚糖消化分析。基于de Jonge等人描述的方案，对金黄色葡萄球菌NCTC 8325-4和头状葡萄球菌CCM3583进行肽聚糖分离。将分离得到的物质重悬于50 mM、pH 8.0的甘氨酸缓冲液中，该缓冲液补充了100 mM氯化钠，随后在50℃条件下用0.5单位/微升的溶菌酶（A&A生物技术公司）处理24小时。接着，每种肽聚糖在室温下用1微摩尔的LssR_M处理24小时。  样品用含2.94毫克/毫升硼氢化钠的0.5 M、pH 9.0硼酸盐缓冲液进行还原处理。在室温下孵育30分钟后，用正磷酸将pH值调至2.0，随后将样品在室温下以20000倍重力离心5分钟。  将得到的上清液通过Acquity UPLC Protein BEH C4色谱柱（Waters公司）进行分离，洗脱梯度为含0.1%甲酸的(H_{2} O)与含0.1%甲酸的乙腈混合体系；并在Synapt G2质谱仪（Waters公司）上进行分析，该质谱仪采用正模式电喷雾电离和飞行时间分析器。使用MassLynx V4.1软件（Waters公司）分析质谱数据。

血清中的活性。通过处理后菌落形成单位（CFU）的测定，测定并比较了牛胎儿血清、人血清、马血清和兔血清（美国默克公司）中 LssR_M 酶的活性，同时将其与溶葡萄球菌素和 AuresinePLUS 嵌合酶（35）的活性进行对比。将初始菌落形成单位为 (10^{6}) 的金黄色葡萄球菌 TF5303、TF5311 菌株和模仿葡萄球菌 CCM3583 菌株，与 100 纳摩尔的酶在对照组（50 毫摩尔甘氨酸，pH 8.0、100 毫摩尔氯化钠缓冲液）或血清中于 37 摄氏度下孵育 4 小时。通过系列稀释平板涂布法测定细菌数量，结果以 (log _{10}) 的下降值（平均值±标准差）表示。

最佳pH值、温度及螯合剂分析。按照上述方法进行浊度降低测定，以评估pH值、温度和螯合剂对酶活性的影响。在电导率恒定为约2毫西门子/厘米、pH范围较宽的缓冲液中测试了pH值对酶活性的影响，所用缓冲液及对应pH值如下：柠檬酸盐缓冲液pH 5.4、MES缓冲液pH 6.0、Tris-HCl缓冲液pH 7.0、Tris-HCl缓冲液pH 8.0、Tris-HCl缓冲液pH 9.0、CAPS缓冲液pH 10.0以及CAPS缓冲液pH 10.9。在4℃、21℃、37℃和45℃条件下测定了温度的影响。为评估螯合剂的作用，检测了浓度范围为0.6至250毫摩尔的EDTA，以及浓度范围为0.12至2毫摩尔的邻菲啰啉。实验采用50毫摩尔甘氨酸缓冲液（pH 8.0）用于LsSR_CD，LssR_M则在上述缓冲液基础上额外添加100毫摩尔相关物质，两种酶的最终浓度均为100纳摩尔。

安全性评估

体外毒性试验：将小鼠成纤维细胞（NIH 3T3细胞系）和人角质形成细胞（HaCaT细胞系）置于添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco）和1%青霉素-链霉素（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）中培养。细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱（Memmert培养箱）的(CO_{2})环境中培养。细胞培养于9厘米直径的组织培养皿（VWR）中，每周传代2-3次。所有实验均使用(passages <7)来源的、汇合度约80%的细胞进行。MTT试验前，用10毫升磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma）洗涤细胞，再用1-2毫升胰酶表达液（Gibco）消化，随后轻轻拍打培养皿。待细胞脱落且培养皿表面无可见贴壁细胞后，加入等体积不含酚红和抗生素且添加10%FBS的DMEM培养基（Gibco，21063-029）。轻轻吹打细胞悬液以打散细胞团块。按照制造商的操作指南，使用Countess™台式细胞计数系统（Invitrogen）和EVE™细胞计数板（NanoEnTek）测定细胞数量和活力。将细胞密度调整为(5 ×10^{5} cells / ml)，置于添加10%FBS的不含酚红和抗生素的DMEM培养基中。取100微升细胞悬液接种至96孔板（NEST细胞培养板，聚苯乙烯，无热原）。背景对照组孔中加入等体积的培养基。次日，将培养基替换为新鲜过滤的（通过0.22微米注射器滤膜，Avantor）仅添加10%FBS的DMEM培养基（对照组），或添加10%FBS和300纳摩尔LssR_M的DMEM培养基（处理组），继续培养细胞22-24小时。为评估细胞活力，向每孔加入10微升噻唑蓝溴化四氮唑蓝（MTT，POL-AURA），使终浓度达到0.5毫克/毫升。将培养板在37℃下继续孵育2小时。随后，直接向每孔培养基中加入100微升二甲基亚砜（DMSO，POL-AURA），并将培养板在室温下孵育约30分钟。轻轻振荡。待甲臜晶体完全溶解后，使用 Multiscan FC 分光光度计（赛默飞世尔科技）在 570 纳米波长下测定吸光度。

体内毒性试验：野生型(ABOMD)斑马鱼（斑马鱼属）品系在波兰科学院莫萨科夫斯基医学研究所的鱼类设施中饲养繁育。所有实验均严格遵守国家法规以及欧盟2010/63/EU指令中规定的指导原则。本研究该阶段无需获得伦理批准，因为实验仅涉及斑马鱼的早期发育阶段（受精后5天内），这一阶段不在欧盟现行动物实验法规的管控范围内。通过茶漏收集自然群体交配产生的胚胎，用自来水清洗后，转移至含有E3培养基的培养皿中（E3培养基为标准斑马鱼培养基，由5毫摩尔氯化钠、0.17毫摩尔氯化钾、0.33毫摩尔氯化钙ef0975e-05a1-45d2-96d1-3d3773f6324b、0.33毫摩尔(MgSO_{4})的水溶液组成，pH值调节至7.0）。仅选择含有(>90%)枚受精且发育良好的卵的鱼群进行实验。将12枚高质量胚胎转移至直径3厘米的培养皿中，每个培养皿加入2毫升E3培养基。在胚胎发育至囊胚期前，将培养基更换为2毫升新鲜E3培养基（对照组）或2毫升添加300纳摩尔LssR_M的新鲜E3培养基（处理组）。随后将胚胎置于28摄氏度环境中培养四天。每日更换培养基（含或不含酶），并在体视显微镜（蔡司，Stemi 508）下观察胚胎的存活情况、发育延迟情况、凝血状况、心脏水肿及其他形态畸形情况。该实验共进行三次生物学重复。