题目：Functional implications of the conformational landscape of a multidrug transporter revealed by Zebrafish Abcb4 structures

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-026-73751-4

期刊：Nature Communications

摘要

人类ABC转运蛋白ABCB1（hP-糖蛋白）介导多药耐药性的特征是识别并外排多种不同的药物，但其多特异性的精确机制仍未阐明。在斑马鱼等水生动物中，hP-糖蛋白的功能同源物Abcb4在动物抵御环境有毒物质的过程中发挥关键作用。本研究发现，斑马鱼Abcb4（DrAbcb4）的基础ATP酶活性及药物刺激下的ATP酶活性与hP-糖蛋白相当。通过冷冻电镜技术，我们解析了五种DrAbcb4的向内开放构象，其两个结构域叶瓣间的间距各不相同，直观展现了该蛋白的开合运动特征。这种间距范围超过已发表的P-糖蛋白结构中观察到的结果，后者的构象似乎受到限制。这种整体的开合运动与单个螺旋的运动相耦合，形成了构象高度灵活的底物结合口袋。这些动态变化很可能是底物识别多特异性的基础，其对应的非常规蛋白-配体相互作用也得到了与P-糖蛋白抑制剂他立喹达、埃拉西达尔以及底物长春新碱结合的DrAbcb4结构的支持。

引言

ATP结合盒（ABC）转运蛋白是最大的膜蛋白超家族之一，存在于所有生命界，可促进内源性和外源性化合物跨细胞膜转运。ABC转运蛋白具有由两个结构域组成的共同模块化结构，每个结构域均由保守的细胞内核苷酸结合结构域（NBDs）和跨膜结构域（TMD）构成（图1A）。NBDs结合并水解ATP的过程与TMDs的构象变化相偶联，从而使底物能够在膜的两侧结合并释放²。在人体中，ABC转运蛋白功能异常可引发多种复杂疾病，包括囊性纤维化³以及多种肝脏和视网膜疾病。此外，这些转运蛋白的过度表达，尤其是癌细胞的过度表达，与癌症的多药耐药性（MDR）的发展有关。

ABC转运蛋白介导的多药耐药性（MDR）是通过将多种药物主动外排至细胞外来实现的，这会降低细胞内药物浓度并削弱药物疗效。ABC转运蛋白ABCB1，也被称为MDR1或P-糖蛋白（P-gp），是一种已被证实可在哺乳动物细胞（包括癌细胞9）中介导多药耐药性的ABC转运蛋白，也是目前研究最为广泛的转运蛋白。除了在多药耐药中的作用外，P-gp还存在于血脑屏障（BBB）、血胎盘屏障（BPB）和肠上皮等生理屏障中，在保护重要器官免受外源性物质侵害的同时，限制治疗性药物的渗透。P-gp以及ABCG2、ABCC1等其他ABC多药转运蛋白，在药物从肝脏排泄至胆汁、从肾脏排泄至尿液的过程中也发挥着关键作用。P-gp基因敲除小鼠的表型正常且可育，但对化学物质高度敏感，且血脑屏障功能存在缺陷，这充分体现了P-gp的这种保护作用。P-gp研究的一个核心目标是阐明其底物多特异性的潜在机制，而结构研究是探索这一机制的有效途径。事实上，通过X射线晶体学和冷冻电镜技术获得的大量P-gp结构，已揭示了其在结合底物方面的显著多样性（参见综述2,13,14）。然而，大多数已解析的P-gp药物结合结构均是在少数特定条件下获得的，导致这些结构仅集中于少数离散的向内开放构象。这些构象受到结合特异性单克隆抗体、嵌入纳米圆盘、晶格堆积或与底物共价结合等因素的限制，仅代表了P-gp为结合多种底物所采取的构象状态中的一部分。

近年来，在体内（例如在血脑屏障中）对P-糖蛋白（P-gp）功能进行建模的研究已转向斑马鱼（斑马属）等生物，斑马鱼拥有多种与哺乳动物转运蛋白同源的ATP结合盒式（ABC）多药转运蛋白。与人类不同，水生动物长期接触水中的化学物质和有毒物质，在其整个生命周期中显然需要更高效的解毒机制。事实上，斑马鱼的基因组编码了更多数量的ABC外排转运蛋白，其中包括一种P-糖蛋白同源物，命名为Abcb4，该转运蛋白广泛分布于其胚胎、成年血脑屏障以及消化系统与人类P-糖蛋白24-26相似。与主要作为脂质转运体的人类ABCB4不同，斑马鱼Abcb4（DrAbcb4）与人类P-糖蛋白（ABCB1，人P-糖蛋白）具有功能同源性，包括几乎相同的底物特异性谱和64%的序列一致性。因此，斑马鱼是研究P-糖蛋白功能（包括药物跨血脑屏障转运和体内多药耐药性）的有前景的脊椎动物模型。

我们利用野生型斑马鱼Abcb4（DrAbcb4），证实了其可作为研究P-糖蛋白（P-gp）结构与作用机制的模型系统。结构分析显示，该蛋白存在多种不同的内吞构象，其两个结构域之间的分离距离差异显著，这表明它能够形成功能所需的多种构象。这些构象很可能是DrAbcb4发生自发开合运动的瞬时状态，而这种运动是P-gp转运功能的关键过程。此外，这种开合运动与单个跨膜螺旋（TMHs）的复杂运动相关，包括旋转、倾斜、扭曲、解旋甚至平移。这种动态偶联改变了细胞膜内由跨膜螺旋构成的底物结合口袋（SBP）的表面形貌。相关分析表明，已发表的P-gp结构会因交联修饰、晶体接触、构象选择性抗体或纳米圆盘包埋等因素而呈现出聚集特征，这反映了其构象受到限制。相比之下，DrAbcb4展现出更广泛的构象范围，结合他利达奎尔、埃拉西达和长春新碱的DrAbcb4结构也证实了其构象可被底物接近。值得注意的是，我们发现这些化合物的结合而非核苷酸的结合，会促使其两个结构域相互靠近。灵活的底物结合环境不仅允许不同底物的结合，也允许同一底物以不同构象结合，这可能是P-gp具有多特异性，能够识别并转运多种物质的基础。

结果

斑马鱼Abcb4具有与P-糖蛋白相似的ATP酶活性谱

我们在毕赤酵母中表达了重组DrAbcb4蛋白，并将其纯化至均一。经尺寸排阻色谱法（补充图1A）和电子显微镜（补充图2A）验证，该蛋白在纯化条件下的溶液中呈单分散状态。此外，纯化后的蛋白可与单克隆抗体C219发生交叉反应，该抗体已知可识别多种哺乳动物P-糖蛋白29（补充图1A，插图），这与先前的研究结果一致。

为进一步评估 DrAbcb4 的活性，我们在去污剂胶束和脂质-去污剂双脂质层环境中测定了其基础及药物刺激的 ATP 酶活性（补充图1B）。在十二烷基-D-麦芽糖苷（DDM）胶束中，DrAbcb4 的基础 ATP 酶活性约为 10.6 纳摩尔无机磷/分钟/毫克蛋白，在脂质双脂质层中则为 5.9 纳摩尔无机磷/分钟/毫克蛋白，与此前报道的人类和鼠类 P-糖蛋白（P-gp）活性相当。维拉帕米以浓度依赖的方式调控 ATP 酶活性，呈现出典型的偏态钟形曲线。在低浓度维拉帕米条件下，去污剂溶液中的 ATP 酶活性被激活至原有水平的 2 倍，而脂质双脂质层环境中则约激活至 15 倍；但在高浓度下，ATP 酶活性则受到抑制（补充图1B）。这些结果证实，DrAbcb4 所展现的基础 ATP 酶活性及维拉帕米调控的 ATP 酶活性与人类和鼠类 P-糖蛋白（P-gp）相似。

一项针对长春新碱（一种用于癌症治疗的长春花生物碱类抗微管剂）的类似分析显示，其对ATP酶的刺激作用微弱（补充图1C），这与此前利用昆虫细胞表达的DrAbcb4进行的研究结果一致24。Tariquidar和elacridar均为已知的第三代P-糖蛋白（P-gp）抑制剂，可抑制其ATP酶活性19，另有研究表明二者也能有效阻断DrAbcb4在人胚肾293细胞（HEK293）中的转运活性26。在去污剂条件下对分离的毕赤酵母表达的DrAbcb4进行ATP酶活性检测时，elacridar表现出中等程度的抑制作用，而tariquidar则几乎无影响（补充图1C）。这些研究结果这与之前的报告一致，即 DrAbcb4 与 hP-gp24-26 具有相同的底物/抑制剂特异性谱，这进一步支持了其作为 P-gp 结构和机制研究体外模型的适用性。

图1. 斑马鱼Abcb4（DrAbcb4）及其与药物复合物的冷冻电镜结构与构象。(A) (IFNar)构象下DrAbcb4的两个正交取向电镜密度图及其衍生的带状模型。电镜密度的局部分辨率按右侧色条进行颜色编码。两条水平线勾勒出转运蛋白的跨膜（TM）区域。(B) 按(D COM)值排列的DrAbcb4数据集五类电镜密度图，标注了各图的分辨率。作为参照，展示了开放构象（OF）下人P-糖蛋白（hP-gp，PDB:6C0V）、嵌入纳米圆盘并结合MRK16的闭合构象间开放态（IF-Occluded）hP-gp（PDB:7A65）、晶格中封闭构象（IF）小鼠P-糖蛋白（mP-gp，PDB:5KPD）以及晶格中封闭构象（IF）甲基化小鼠P-糖蛋白（甲基化m-Pgp，PDB:5KPJ）的结构，并标注了各自的(D COM)值。(C) 基于每个数据集的三个高分辨率重建模型构建的DrAbcb4带状模型，展示了其与药物结合模式（DCOM）的关系。从上至下依次为：无药物结合的DrAbcb4、结合他立喹达、埃克拉瑞达和长春新碱的DrAbcb4。

野生型斑马鱼 Abcb4 的构象景观

对纯化的DrAbcb4进行表征后发现，该重组蛋白在溶液中呈单分散状态，具有生物化学活性，且适用于结构研究。我们旨在获得不受突变、纳米圆盘包埋、抗体捕获或晶格限制影响的DrAbcb4结构。利用冷冻电镜技术，我们在ATPγS和Mg²⁺存在的条件下对DrAbcb4进行了分析。研究得到了五种向内开放构象（图1B、补充图2及补充表1），每种构象均具有独特的分离距离（DCOM），该距离定义为(NBDs ^{27})两者的质心之间的距离。这些构象很可能捕捉到了DrAbcb4分子在溶液中进行开合运动的瞬时状态。

三种主要类别均以高分辨率重建，分辨率分别为 3.29 埃、(3.29 AA) (3.39 AA) 和 (3.59 AA)（图 1B 和补充表 1）。这些类别分别显示出独特的 (D COM) 值，分别为 (60.6)（干扰素α）、(66.3 AA)（干扰素介质）和 (74.2 AA)（干扰素宽域）。值得注意的是，这些 (D COM) 值大于此前报道的结构对应数值（表 1 和表 2）。两种分离范围较窄的次要类别因代表更瞬时状态的粒子数量较少，未达到高分辨率。在三种高分辨率结构中，跨膜结构域（TM）的解析度始终高于核苷酸结合结构域（NBD），展现出更高的局部分辨率，可用于从头模型构建（图 1A、补充图 2B、3A 和 3B）。核苷酸结合结构域（NBD）的建模方法为：对接源自鼠源 P-糖蛋白（mP-gp，PDB:5KO2）的同源 NBD 模型，随后进行序列替换，并基于电子显微镜密度图进行人工精修（补充图 3C）。尽管核苷酸结合结构域 1（NBD1）和核苷酸结合结构域 2（NBD2）的电子显微镜密度图整体质量相对较低，但核苷酸结合位点周围的密度轮廓清晰，可可靠放置结合的 (ATP gamma S / Mg^{2+})（补充图 3D）。

DrAbcb4 的整体结构与 P-糖蛋白（P-gp）高度相似，核心结构包含两个不同的结构域（图1A）。每个结构域均由一个跨膜区构成结构域（TMD1或TMD2）和一个核苷酸结合结构域（NBD1或NBD2）。此处的结构域是基于结构而非序列来定义的。与人和鼠源P-糖蛋白（Pgps）类似，连接NBD1与TMD2的连接子（F636-K690）仍处于无序状态，尽管它比鼠源P-糖蛋白（mP-gp）或人源P-糖蛋白（hP-gp）的连接子短七个氨基酸残基（补充图4）。每个跨膜结构域（TMD）包含六个跨膜螺旋（TMHs），其中四个螺旋来自其序列的一半，另外两个结构域交换螺旋（TMD2中的TMHs 4和5，以及TMD1中的TMHs 10和11）来自另一半。在所有三种主要构象中，两个NBD均结合了(ATP gamma S / Mg^{2+})，且可对其密度进行可靠建模，同时两个NBD仍保持良好的分离状态。这表明在我们的实验条件下，仅核苷酸结合并不能在NBD二聚化状态下获得足够数量的颗粒以完成分类和三维重构。相比之下，去污剂溶液中结合(ATP/Mg2+)（PDB：8AVY，L335C+E/Q突变）的鼠源P-糖蛋白结构²¹，以及嵌入纳米圆盘且结合(ATP gamma S / Mg^{2+})（PDB：9CTG）的人源P-糖蛋白结构³⁰，均为外向构象（OF），且二者均是在无底物的条件下获得的。

研究人员构建了DrAbcb4蛋白近乎完整的原子模型，仅缺失两个区域：连接跨膜螺旋1（TMH1）与跨膜螺旋2（TMH2）的胞外环1（ECL1，氨基酸残基80-114），以及连接两个结构域的连接肽（氨基酸残基639-690）（图1）。值得注意的是，与其他全长或截短连接肽的P-糖蛋白（P-gp）结构类似，DrAbcb4中连接肽密度的缺失很可能源于其固有的柔性特征。尽管在结构上未被解析，该连接肽却是转运功能的关键。P-糖蛋白中任何使该区域刚性化或缩短的改变，都会导致转运蛋白失去活性，这表明两个结构域的大开合能力是其发挥生物学功能所必需的。

药物存在下斑马鱼Abcb4的结构

本研究旨在探究在与无药物状态相同的溶液条件下，DrAbcb4 与特定药物结合后发生的结构变化。我们选择了长春新碱（VCR）、他利喹达（TQR）和埃拉西达（ELA），因为 DrAbcb4 可通过其外排活性使斑马鱼胚胎对长春新碱产生耐药性24，而这种耐药性可被他利喹达或埃拉西达逆转26。此外，选用这些化合物便于与人类 P-糖蛋白（hP-gp）进行直接对比，因为已有与这些药物结合状态下的人类 P-糖蛋白结构，以及apo 形式的结构已被报道与单克隆抗体 (MRK16 ^{19}) 的 Fab 片段形成复合物。值得注意的是，这些 hP-糖蛋白（hP-gp）结构呈现出向内开放（IF）构象，其双重开放构象模型（DCOM）约为 (38 AA)，在此构象中，无论底物结合口袋（SBP）是空的还是结合了药物，均从胞质侧被弯曲的跨膜螺旋 4（TMH4）和跨膜螺旋 10（TMH10）封闭，这被定义为向内开放封闭状态¹⁹（参见图 1B 中的 PDB:7A65）。

我们参照无药物 DrAbcb4 研究中的类似工作流程，获取了他替瑞林、依利达隆或长春新碱存在下 DrAbcb4 的冷冻电镜数据集（补充图 5、6 和 7）。DrAbcb4/TQR 和 DrAbcb4/ELA 数据集的重建分辨率高于无药物的 DrAbcb4，而 DrAbcb4/VCR 数据集的重建分辨率相对较低（补充表 1）。每种化合物均获得了三种具有不同 DCOM 间距的主要构象：DrAbcb4/TQR 对应 (56.8)、(63.5 AA,) 和 (66.7 AA)（分别命名为 TQR-(IF ^{Nar})、TQR-(IFMed) 和 TQR-IFWide）；DrAbcb4/ELA 对应 (55.7 AA)、(60.8) 和 (68.0 AA)（分别命名为 (ELA-IFNar)、(ELA-IFMed) 和 ELA-IFWide）；DrAbcb4/VCR 对应 (57.4A)、(61.0 AA) 和 (69.3 AA)（分别命名为 (VCR-IF ^{Nar })、(VCR-IFMed) 和 VCR-IFWide）（表 1、表 2 和补充表 1）。与无配体数据集相比，在药物存在的情况下，DrAbcb4 的整体构象特征（以进入不同 DCOM 值结构的标准化粒子数分布为代表）持续向两个结构域之间更窄的间距偏移（补充图 8A），这表明药物结合可能会影响构象平衡。

DrAbcb4 伴随开合运动的协同结构变化

在无药物或有药物存在的情况下获得的 DrAbcb4 十二个高分辨率结构，显示出两个结构域间存在不同的分离距离（DCOM），这代表了 DrAbcb4 发生自发开合运动的瞬时状态。基于第一个结构域对这十二个结构进行比对后，我们发现第二个结构域的运动遵循特定轨迹——通过 DCOM 测量可知，DrAbcb4 的两个结构域不仅在侧向逐渐张开得更宽，还会发生角度运动，NBD2 的相关变化也证实了这一点（图 2A）。这种“张开同时扭转”的运动方式能够这在 cryoSPARC 的三维变异性分析中得到了直接可视化（补充视频1和2），从中可以解析出连续的构象变化³¹。DrAbcb4 自发的开合运动可能是转运体在静息状态下主动筛选潜在配体的一个重要特征，也可能构成基础ATP酶活性的基础。

3D变异性分析还显示，在开合运动过程中，DrAbcb4的每个结构域并非作为由柔性连接子连接的刚性体运动，而是发生显著的局部构象变化，对于跨膜螺旋（TM螺旋）而言尤其如此。这些局部变化可通过结构叠合进行检测。以(IFWide)和([D COM =74.2 dot{A}])为参照，对DrAbcb4的跨膜结构域1（TMD1）或跨膜结构域2（TMD2）进行成对比对后，我们观察到以均方根偏差（RMSD）表示的结构差异是动态中心偏移差值（ΔDCOM）的函数（图2B）。具体而言，动态中心偏移值（DCOM）相近的模型，其两个跨膜结构域的均方根偏差均较低；而动态中心偏移值差异极大的模型，均方根偏差则更高。值得注意的是，所有四种结合底物或抑制剂的结构均表现出异常大的均方根偏差，这反映出它们倾向于维持小型(D COM)对应的构象。这一观察结果也适用于以 mP-gp 结构（PDB:5KPD，DCOM）为参考进行的叠加分析(=47.2 AA) = 47.2埃）作为参考（补充图8B）。因此，我们得出结论，mP-糖蛋白和DrAbcb4的结构具有可比性。

值得注意的是，随着两个叶瓣张开角度增大且DCOM数值升高，我们观察到以下关键的局部运动：(1) TMH1和TMH2在膜外侧的末端发生解旋，延伸出无序的ECL1环（图2C和图3A、补充视频2）。TMH1和TMH2还进一步远离中心伪二重对称轴，尤其是在膜外侧区域，这使得两个TMD之间出现明显的不对称性（补充图8C）。hP-糖蛋白的ECL1环是构象敏感性单克隆抗体MRK16和UIC2识别的表位的一部分，表明这些抗体可能对hP-糖蛋白的不同构象具有响应性。(2) TMD1的两个耦合螺旋TMH10和TMH11均发生大幅位置偏移，其膜外侧部分重新定位并更靠近中心轴（图3B、补充图8C）。(3) 相比之下，TMD2的耦合螺旋对TMHs 4/5中仅TMH4朝向中心轴发生类似的位置变化中心轴（图3C及补充图8C）。DrAbcb4的TMH 4和TMH 10的运动使底物结合口袋完全打开，这与P-糖蛋白内部闭合状态中TMH 4和TMH 10发生扭曲导致底物结合口袋闭合的情况形成鲜明对比（补充图8D）。后者促成了已提出的底物门控机制¹⁸。（4）此外，TMH 4的中段发生解旋，在两个中段（残基S233-G238和T245-T250）处逐渐断裂，形成三个不连续的短螺旋（补充图8D）。同样，TMH 12中段（残基F992-Y996）的密度逐渐减弱，解旋为环状结构，连接了TMH 12的上半部分和下半部分（图2C）。（5）包含底物结合口袋的体积DrAbcb4 的膜部分随 DCOM 增加而上升，当 DCOM 达到约 (66 AA) 或更宽的数值后，该部分逐渐趋于平稳。

随着DrAbcb4的两个结构域开口更大，观察到的螺旋位置变化涉及跨膜结构域中跨膜螺旋的重排（补充图8C），这与此前描述的hP-糖蛋白经历内向构象向外向构象转变时的螺旋重排相似³²。螺旋重排还会导致底物结合口袋的体积发生突变。可以想见，螺旋的重排与解旋涉及蛋白质折叠过程中相当大的能量变化³³，但这可能是为获得足够空间以容纳更大底物而做出的重要能量投入。驱动这一过程的能量来源尚未确定，而开合运动与单个螺旋重排及解旋的耦合或许是解决该问题的一部分。

图2. DrAbcb4的耦合结构变化作为打开和关闭运动的函数。（A）DrAbcb4的两个叶在进行打开和关闭运动时遵循定义的轨迹。具有不同DCOM的DrAbcb4的12个结构基于它们的N端叶对齐，轨迹由C端叶NBD2中的螺旋（残基1263-1273）的位置指示。（B）使用Apo(IFWide)作为将12个DrAbcb4结构成对叠加的参考，将rms偏差（RMSD）与DCOM（DCOM）的变化绘制，揭示了协调运动的正相关指示。（C）TM螺旋中与打开和关闭运动相关的结构变化。显示了窄开IF遮挡构象（PDB：6QEX）中hP-gp的结构以及来自四个数据集的12个DrAbcb4的高分辨率EM密度图。螺旋TMH1和TMH2分别为粉红色和品红色。TMH4为青色，TMH12为黄色。

内向构象中跨膜螺旋的构象可塑性

在DrAbcb4的结构中观察到的跨膜螺旋构象可塑性伴随不同的DCOM值，让我们联想到此前报道的关于无结合药物的mP-糖蛋白晶体结构的研究，在该研究中埃瑟尔等人也观察到了DCOM与单个螺旋的相对旋转及倾斜之间的耦合运动。每个螺旋的运动与开合运动的耦合关系较为复杂；不过，如之前报道的那样，我们可通过测定每个螺旋的平均螺旋旋转角（<HRA>，单位为度）和平均螺旋倾斜角（<HTA>，单位为度）并绘制其与DCOM的关系图，对该耦合关系进行部分描述。为了覆盖为了获得更大的DCOM范围，我们还在该图中纳入了mP-糖蛋白、甲基化mP-糖蛋白（mP (gpME)）的晶体结构，以及少数mP-糖蛋白和人P-糖蛋白的电镜结构（图3D、表1、表2和补充图9）。显然，DCOM与螺旋平均旋转/倾斜角度之间存在强相关性，相关系数在0.6-0.9范围内。我们注意到，部分螺旋的<HRA>和<HTA>值与趋势线偏离明显，这表明它们可能在药物结合或与特定构象状态相关的螺旋重排中发挥作用。

为PDB中可用的P-糖蛋白（P-gp）结构绘制<HRA>和动态构象度量（DCOM）图谱，显示出有趣的结构聚类现象（图3E）。部分结构与趋势线偏差较大，若将其纳入计算，会显著降低相关系数。该聚类与这些结构的测定条件相关。例如，结晶态小鼠P-糖蛋白（mP-gp）的所有结构聚为一类，其DCOM和<HRA>范围非常狭窄；结合单克隆抗体并嵌入纳米盘的人P-糖蛋白（hP-gp）冷冻电镜结构，以及处于外向构象（OF）的结构也呈现类似聚类特征，这表明实验条件或功能状态导致了构象限制。

单个螺旋的运动，结合两个结构域的开合运动，有望导致药物结合位点的表面构象发生动态变化，从而实现与不同药物的结合。为了直观呈现药物结合位点的动态变化，我们选取了位于DrAbcb4跨膜结构域1（TMD1）中的Y951残基作为研究对象。该残基在鼠源和人源P-糖蛋白（P-gp）中完全保守，且与几乎所有结合P-糖蛋白的化合物存在相互作用（补充图10）。我们以Y951为中心，将每种DrAbcb4结构的周围环境以静电表面电势的形式进行了可视化呈现（图3F）。显然，不同DCOM值的DrAbcb4结构之间存在的表面差异，印证了我们的发现：单个螺旋的协同运动与两个结构域的开合运动，可能使DrAbcb4在药物结合口袋中形成多种电化学和空间构象环境，进而与不同大小和组成的药物发生相互作用。

图3. TM螺旋构象变化与开闭运动之间的耦合。（A）无序ECL1残基的数量作为(D COM)的函数。（B）TMD1的耦合螺旋TMH10和TMH11随DCOM变化发生的位置偏移。对齐四个结构的N端半区：mP-糖蛋白（5KPD）、(VCR-IF ^{Nar })、无配体结构(IFWide)以及TQR结合体(IFWide)。mP-糖蛋白结构以完整带状图展示，其余结构仅以管状物展示TMH10和TMH11。与mP-糖蛋白和VCR结合体(IF ^{Nar})相比，无配体结合体(IFWide)和TQR结合体(IFWide)的TMH10和TMH11胞外部分发生了位置偏移。（C）TMD2的TMH4随DCOM变化发生的位置偏移，展示方式与（B）一致。与mP-糖蛋白和VCR结合体(IFNAR)相比，无配体开放构象（Apo-IFWide）和TQR结合体(IFWide)的TMH4胞外部分发生了位置偏移。（D）散点图展示耦合螺旋TMH11（TMD1）和TMH5（TMD2）的DCOM与平均旋转角<HRA>及平均倾斜角<HTA>之间的相关性。mP-糖蛋白的晶体结构（5KPD、5KPI、4KOY、5KO2）和甲基化mP-糖蛋白的晶体结构（4Q9H、4XWK、5KPJ）分别以黑色和粉色星号表示。鞘脂纳米颗粒中hP-糖蛋白的冷冻电镜结构（9CTF）以灰色六边形表示，彩色圆点则代表DrAbcb4。红色虚线趋势线包含拟合方程和(R^{2})数值。mP-糖蛋白的螺旋（紫色）和无配体DrAbcb4的螺旋(IFWide)（绿色）以卡通形式展示，等效芳香族残基以棍状模型展示。（E）TMH10的<HRA>随DCOM变化的散点图，展示了不同条件下获得的P-糖蛋白结构的聚类情况。除（D）中的结构外，还纳入了以下已发表的结构：去污剂中mP-糖蛋白的冷冻电镜结构（7ZK4、7ZK5、7ZK6、7ZKA、8AVY）、去污剂中hP-糖蛋白的结构（6C0V）、纳米圆盘/Fab中hP-糖蛋白的结构（6QEX、7A65、7A69、7A6C、7A6E、7A6F）、鞘脂纳米颗粒中hP-糖蛋白的结构（9CTC、9CTG、9CR8）以及纳米圆盘/Fab中嵌合hmP-糖蛋白的结构（6FN1、6QEE）。虚线趋势线排除了(IFClosed)和外向构象（OF）结构。（F）不同DCOM下DrAbcb4中底物结合环境的变化，以保守残基Y951（棍状模型）为中心的静电表面电势表示。正电势为蓝色，负电势为红色，中性为白色。

药物与DrAbcb4的多重结合方式

可以想象，药物结合表面的流动性也应使底物在蛋白质-药物相互作用过程中结合于多个位点和/或以不同构象存在。这一假设得到了我们在结合药物的DrAbcb4结构中鉴定出的多种抑制剂/底物构象或结合姿势的支持。在药物存在下获得的最终高分辨率DrAbcb4图谱中，在完成蛋白质模型构建后，于两个跨膜结构域（TMDs）之间观察到了额外的电子显微镜（EM）密度，其等高线水平与蛋白质的等高线水平相近。使用这两个半图谱进行基于最大似然法的精修后，这些密度的可解释性得到了提升。

在三个具有不同DCOM间距的DrAbcb4/TQR图谱中，仅TQR-(IF ^{Nar})（DCOM = 56.8埃）和TQR-(IFMed) ((D_{COM}=63.5 dot{A}))图谱中发现了结合的他喹莫德分子。对于TQR-(IFNar)图谱，两个他喹莫德分子以背靠背的方式构建于药物结合腔中央的连续密度中，彼此轻微接触（图4）。事实证明，这种结合分子的背靠背排列似乎是一个共同特征，尽管两个分子不必完全相同。在建模的两个他喹莫德分子（命名为TQR-1和TQR-2）中，TQR-1朝向药物结合腔的TMD1侧，而TQR-2位于TMD2侧（图4C和补充图10）。在这种特定的DrAbcb4构象下，TQR1在距离截止值(3.5 AA)范围内与10个残基接触，所有残基均为疏水性，其中4个为芳香族残基。TQR-1四氢异喹啉部分的两个甲氧基与Y951的羟基相距约(3.6 AA)，形成潜在的氢键。TQR-1另一端的喹啉甲酰胺基团由两个芳香族残基（F77和Y981）固定（图4D）。TQR-2与13个残基相互作用；其中10个为疏水性（包括5个芳香族残基），3个为亲水性。其喹啉部分楔入一对跨膜螺旋4和5之间的间隙，与跨膜螺旋4上的A234、A235和K239以及跨膜螺旋5上的T307残基接触（图4D）。TQR-2可能与Y315、T307和K239形成三个氢键。必须注意的是，TQR-1和TQR-2具有截然不同的构象。

对于TQR-(IFMed)的模型图，仅在结合腔的TMD1侧将一个他利喹达（TQR-3）建模到电子显微镜密度图中（图4B和4C）。与呈现延伸构象的TQR-1和TQR-2不同，TQR-3采取更紧凑的构象，被九个主要为疏水性的残基包裹（图4D）。在结合腔的TMD2侧发现了一个胆固醇分子（CLR），它与TQR-3相邻并接触其二甲氧基四氢异喹啉部分。这些结果表明，DrAbcb4能够以不同的蛋白质构象（不同的DCOM值）结合化合物，利用结合腔的多个可用结合位点，甚至能处理药物的多种构象体。

对 DrAbcb4/elacridar 和 DrAbcb4/vincristine 的重建也观察到了类似现象。DrAbcb4/elacridar 样品的数据集生成了三个重建结果，其中只有 (ELA-IF ^{Nar }) 图谱显示抑制剂结合在药物结合腔的 TMD1 侧，这一点由额外的密度峰佐证，该密度峰与样品制备中使用的胆酸盐分子拟合度最佳（图4D）。结合的 elacridar 周围环绕着八个残基，大多为疏水性残基，其末端的大型吖啶酮部分嵌入在六个芳香残基中。

在 VCR-IFNar 结构中，发现一个长春新碱分子占据了整个结合腔。结构。由于其分子量大（825道尔顿），长春新碱与跨膜结构域（TMDs）中的总共八个残基发生相互作用，其中大部分为疏水性残基（图4）。具体而言，其较大的文多灵部分占据空腔的跨膜结构域1侧，而较小的长春花碱基团则与结合位点的跨膜结构域2部分相互作用。与带有并列辅因子的TQR-(IFMed)和ELA (IFNar)结构不同，VCR-(IFNar)结构无额外密度，也没有为长春新碱的结合提供额外的支撑。值得注意的是，部分结合药物可通过差异密度图显示的两种不同构象进行建模，这些密度图在重建结构中呈现出分支密度。这很可能是由3D分类无法区分的、具有微小差异的瞬时构象混合导致的。

图4. 药物结合的多功能性。(A) 他喹达、依拉西达和长春新碱的化学结构。(B) DrAbcb4 结构揭示的结合药物。展示了四个带状图形式的 DrAbcb4 结构：从左到右依次为结合了两个他喹达（TQR）分子的 TQR-(IFNar)、结合了一个他喹达和一个胆固醇（CLR）的 (TQR-IFMed)、结合了一个依拉西达（ELA）和一个胆酸盐（CHD）的 ELA-(IFNar)，以及结合了一个长春新碱（VCR）的 VCR-(IFNar)。结合药物的电镜密度以橙色显示，(ATP gamma S / Mg^{2+})的密度以蓝色显示。两条平行线代表膜双层结构。(C) 为(B)中红色矩形标注的药物结合腔的放大视图。展示了跨膜螺旋6和12（灰色）的带状结构与重叠的电镜密度，以及结合的药物（橙色）。(D) 为Ligplot示意图，描绘了结合药物的构象及其所处的蛋白质环境。结合的药物以球棍模型呈现，碳原子为黑色，氮原子为蓝色，氧原子为红色。与结合药物紧密接触的残基以红色睫毛图标表示，可能形成氢键的残基以棍状模型展示。

DrAbcb4 药物结合位点的结构保守性

为了了解 DrAbcb4 与 P-糖蛋白之间底物特异性谱的显著保守性，我们对氨基酸残基的序列保守性进行了检测参与药物结合过程。我们首先调研了15个已发表的P-糖蛋白（P-gp）结合各类化合物的结构，包括人源P-糖蛋白（hPgp）和鼠源P-糖蛋白（mP-gp）]。这些结构共涵盖四种不同的P-糖蛋白内向（IF）构象以及59个药物相互作用残基（补充图10）。后者的序列一致性和相似性分别为73%和97%，高于整体的66%和80%。

我们接下来探究了有限数量的结合抑制剂的DrAbcb4结构如何扩大了参与底物结合的残基种类。在四种不同构象的DrAbcb4结构中，共有五种结合的化合物，我们共发现了31个与药物相互作用的残基。其中，23个残基与Pgp中发现的残基重叠，而本研究还额外鉴定出了8个残基，使药物相互作用残基的总数达到67个（补充图10）。药物结合残基的序列保守性保持不变。

总体而言，TMD2 对药物结合的贡献更大，因为 67 个药物结合残基中有三分之二来自 TMD2。其中，DrAbcb4 的 TMH5 区域中保守的残基 Y315（小鼠 P-糖蛋白中为 Y306、人 P-糖蛋白中为 Y310）位居首位，在 19 个被检测的结构中有 18 个结构中该残基与多种化合物相互作用。紧随其后的是 TMH12 区域的 Y981（小鼠 P-糖蛋白中为 F979、人 P-糖蛋白中为 F983）和 TMH6 区域的 F348（小鼠 P-糖蛋白中为 F339、人 P-糖蛋白中为 F343），它们分别出现了 16 次和 15 次。DrAbcb4 中观察到的更大间距为药物结合提供了更多的残基。高度保守的药物结合口袋很可能是 P-糖蛋白和 DrAbcb4 底物/抑制剂特异性谱在很大程度上重叠的基础。因此，斑马鱼 Abcb4 不仅是人 P-糖蛋白的功能同源物，还表现出显著的结构相似性，尤其是在药物结合区域，使其成为研究 P-糖蛋白结构和作用机制的合适模型系统。

讨论

在多种生理屏障上对P-糖蛋白（P-gp）功能进行建模，以及解析其底物多特异性的机制，一直是研究的热点。与哺乳动物体内的P-糖蛋白类似，斑马鱼Abcb4蛋白（DrAbcb4）通过其外排活性参与斑马鱼胚胎对外源物质的抗性。研究表明，该蛋白与P-糖蛋白功能等效，具有重叠的底物特异性和组织定位特征24-26。本研究中，二者的相似性不仅体现在功能和序列层面，还延伸至结构与作用机制——这一点可从无药物结合和有药物结合状态下的DrAbcb4结构得到印证。在(ATP gamma S / Mg^{2+})存在的条件下，DrAbcb4始终处于内向构象（IF），其两个结构域之间存在一定间距，且两个核苷酸结合结构域（NBDs）均具有清晰的电子密度（图1及补充图3D）。值得注意的是，这些结构的解析未在样品制备过程中引入突变、构象选择性抗体、交联处理、纳米圆盘包埋或晶体接触等手段。这些结构展现了无限制状态下DrAbcb4可采取的构象谱，也揭示了药物结合等因素如何塑造这一构象谱。此外，两个结构域的开合运动与跨膜螺旋（TMHs）的个体运动相耦合，这与DrAbcb4的多药转运功能相符。P-糖蛋白与DrAbcb4之间的结构相似性，尤其是在底物结合结构域（SBP）上的高度相似，解释了二者共有的底物/抑制剂特异性特征，并表明二者存在同源的转运机制。

除了在结构、功能和机制上的相似性之外，DrAbcb4 作为研究 P-糖蛋白（P-gp）的体内或体外模型，还具备多项额外优势。DrAbcb4 可在斑马鱼体内进行基因敲除和突变操作³⁵，它在血脑屏障（BBB）中发挥关键作用，并决定肠道对多种药物的摄取以及肾脏和肝脏对这些药物的排泄²²,²⁴⁻²⁶。针对药物结合相关残基、多特异性与 P-糖蛋白功能的潜在机制以及抑制性药物筛选所开展的研究观察，均可在中等通量的动物模型中便捷地进行验证。此外，DrAbcb4 易于在毕赤酵母表达系统中表达，可获得大量均一的蛋白，且其溶液性质良好，非常适合冷冻电镜（cryo-EM）分析。

冷冻电镜解析DrAbcb4结构揭示的构象景观

此前报道的P-糖蛋白（P-gp）的内向-facing（IF）结构显示，核苷酸结合结构域（NBD）的分离距离（Dcom）集中在(38 AA)和(60 AA)之间（表1、表2和图1）。例如，小鼠P-糖蛋白（mP-gp）的所有晶体结构的DCOM均集中在46埃左右(46 AA^{15,27})；甲基化小鼠P-糖蛋白（methylated mP-gp）的所有晶体结构集中在61埃左右(61 AA^{17,27})；而Fab结合的人P-糖蛋白（Fab-bound hP-gp）则集中在(38 AA^{18-20})附近，这表明这些实验条件可能限制了其两个结构域的运动。相比之下，盘尾丝虫ABC转运蛋白4（DrAbcb4）的结构未出现此类集中现象，其DCOM值分布在(45 AA)和(74 AA)之间（图1B）。冷冻电镜（cryo-EM）数据集还会对溶液中（网格上）的所有颗粒进行检测，最大程度减少不受控的实验偏差。尽管对样品制备中存在去污剂存在担忧，但多项证据表明，在无限制的DrAbcb4结构中观察到的两个结构域更大间距可能具有功能相关性。首先，将连接子缩短34个残基不会改变P-糖蛋白的结构，但会消除其药物转运活性和药物刺激的ATP酶活性27,28，这说明使P-糖蛋白能够大幅开放的连接子柔性对其功能至关重要。其次，为支持这一假设，近期一项针对细菌ABC转运蛋白MsbA的研究发现，这种构象在大肠杆菌活细胞的各种内向-facing构象中占主导地位，该蛋白曾被认为其大开度的内向-facing结构是人工假象，而该构象可能允许大底物进入结合腔36。第三，对P-糖蛋白的双电子-电子共振（DEER）研究在其无配体、底物结合或核苷酸结合状态下均观察到了类似的大开度内向-facing构象((>70-80 AA ))37。第四，原子力显微镜（AFM）对膜双层中嵌入的人P-糖蛋白进行的实时研究显示，其两个结构域以“极端内向-facing”构象存在的概率为28%38。因此，开合运动可能是P-糖蛋白类ABC转运蛋白从膜中捕获底物的一种常见机制。

近期对 MsbA 的冷冻电镜重构研究表明，该转运蛋白的向内开放构象，无论是大开还是窄开状态，均受去污剂或纳米圆盘的调控39。相比之下，空载 DrAbcb4 存在多种向内开放构象，这说明十二烷基麦芽糖苷（DDM）等去污剂并未限制 DrAbcb4 的构象灵活性（图 1）。不过，我们无法排除不同去污剂可能改变其构象分布的可能性如对药物结合样品所观察到的那样，DrAbcb4 的构象构象（图2，补充图8A）。

图5. 提出的P-糖蛋白（P-gp）中底物识别及ATP酶活性调控机制。膜上的P-糖蛋白或斑马鱼Abcb4蛋白会发生两个结构域的自发开合运动。两个同源的核苷酸结合结构域（NBD）为绿色和紫色矩形，结合的ATP以红色“Ts”标注。两个跨膜结构域（TMD）分别以粉色和黄色的棒状结构表示。由整个跨膜结构域围成的药物结合腔可与底物发生相互作用。“内侧闭合构象状态”以底物结合腔闭合（而非核苷酸结合结构域闭合）为特征，该状态会通过“内侧闭合构象状态”（核苷酸结合结构域闭合）进一步发生ATP水解。在无底物存在时，蛋白从开合运动向“内侧闭合构象状态”和“核苷酸结合结构域闭合状态”的转变过程可能较为缓慢，从而产生基础ATP酶活性（上图）。在以五个相连圆圈代表的底物存在时，蛋白与药物均发生构象变化，加速向“内侧闭合构象状态”和“核苷酸结合结构域闭合状态”的转变，随后ATP水解被激活（中图）。通过阻断蛋白两个结构域的开合运动或任意构象转变过程，或通过占据结合位点或高亲和力特异性结合的方式，均可抑制P-糖蛋白的功能（下图）。

此外，卢（Loo）和克拉克（Clark）采用双半胱氨酸突变对跨膜6区（L339C）和跨膜12区（V982C）进行交联。在ATP存在的情况下，交联产物的量有所减少。另一对半胱氨酸突变将跨膜6区（F343C）与跨膜12区（V982C）交联，结果则相反：在(ATP40)存在时，交联产物的量有所增加。研究人员认为，其中一个或两个螺旋的旋转必然参与了这一过程。对不同DCOM间距下的人P-糖蛋白（hP-gp）、小鼠P-糖蛋白（mP-gp）和果蝇Abcb4（DrAbcb4）结构进行分析发现，除了螺旋旋转外，L339C与V982C这对突变位点之间的交联仅在P-糖蛋白的两个结构域间距Dcom大于(65 AA)时才会发生。

开合运动与单个跨膜螺旋运动的耦合赋予底物多特异性

尽管已有研究报道ABC转运蛋白结构中存在跨膜螺旋的相对重排或螺旋重构现象，尤其是在内向构象（IF）向外向构象（OF）的转变过程中³²，但我们的研究发现，单个跨膜螺旋在开放型内向构象（IF open）的开合运动中会发生相对位移，这一发现要求我们重新审视传统认知——即跨膜结构域（TMDs）是作为具有刚性疏水核心的刚性体进行运动的。此外，这些螺旋的复杂运动（包括旋转、倾斜、扭转和位置移动）被证实与两个结构域的开合运动相耦合，这一点从电镜数据的三维变异性分析（补充视频1和2）以及跨膜螺旋旋转和倾斜与动态构象变化矩阵（DCOM）的相关性分析中可清晰看出（图3D和补充图9）。这种相关性分析还能将特定限制条件下获得的结构归为一类，例如晶格堆积产生的作用力或单克隆抗体片段（Fab）结合导致的构象固定。这表明，这些结构不仅动态构象变化矩阵（DCOM）值处于较小的范围内，其跨膜螺旋旋转和倾斜角度的平均值也具有相似性（图3E）。我们在冷冻电镜分析中观察到的耦合开合运动与单个跨膜螺旋的运动，不可避免地形成了一个动态的底物结合表面，该表面在转运过程中其形状、大小和静电性质会持续发生变化。循环（图3F）；这也解释了为何将底物交联至特定的跨膜螺旋（TMH）残基能使P-糖蛋白（P-gp）停滞在单一构象21。

此前，卢（Loo）和克拉克（Clark）通过交联实验提出了人P-糖蛋白（hP-gp）功能循环中单个跨膜（TM）螺旋的相对旋转机制⁴⁰，后续基于小鼠P-糖蛋白（mP-gp）的结构研究，又报道了该旋转与蛋白整体开合运动的偶联关系²⁷。这种偶联关系催生了一种假说：单个底物可在P-糖蛋白结合腔的多个位点结合，这些位点涉及不同的氨基酸残基，且底物可呈现不同的构象构象，这可能是P-糖蛋白多特异性的结构基础（(P-gp ^{41})）。蛋白结合表面与底物构象的这种动态特性，与传统用于解释酶-底物特异性的经典“锁钥模型”形成鲜明对比。P-糖蛋白药物结合腔并非存在刚性结合位点，其动态变化的结合表面能够容纳多种不同底物的结合；而配体也可通过调整自身构象来匹配结合口袋的动态变化。事实上，他拉喹达在结合不同中间构象（IF）状态的斑马鱼Abcb4（DrAbcb4）或P-糖蛋白时呈现的不同构象，就印证了这种协同关系（图4及补充图11）。值得注意的是，五个他拉喹达分子各自呈现出不同的构象；埃拉瑞达和紫杉醇也观察到了类似现象（图4及补充图11）。此前的研究也为此提供了佐证：利用普罗帕酮类化合物对P-糖蛋白进行光亲和标记实验发现，至少有四种跨膜螺旋上共价结合了多种药物⁴²。

底物多特异性及受调控ATP酶活性的潜在机制

DrAbcb4和P-糖蛋白结构所揭示的构象动力学与构象图景，以及跨膜螺旋的协同运动，解释了P-糖蛋白广泛的底物特异性。在没有药物存在时，P-糖蛋白的两个结构域会持续进行开合运动，这使得药物结合腔能够在不同构象状态间切换，以等待潜在药物的进入。当转运蛋白在(IFWide)和(IF ^{Nar})两种状态之间反复进行开合运动时，两个结构域偶尔会转变为前文所述的“内侧闭合状态”，此时结合腔对膜的两侧均呈封闭状态¹⁹，随后最终进入活性状态。ATP水解。该过程相对缓慢，周转速率约为每秒一个ATP，这被称为基础ATP酶活性（图5A）。

基于这一观点，部分配体可通过加速或减缓构象转变来调节ATP酶活性，而构象转变最终会导致ATP水解。底物通过跨膜结构域1（TMD1）与跨膜结构域2（TMD2）之间的间隙进入结合口袋，随后使两个结构域靠拢，促进其更快转变至“内侧开放-闭合构象”，进而刺激ATP酶活性（图5B）。该模型的一个关键特征是P-糖蛋白（P-gp）可结合范围广泛的底物。药物可在多种内侧开放构象中发生结合，且可单药或多药以不同构象同时结合19-21,43。一个关键问题是P-糖蛋白如何阻止结合的底物从结合腔中逃逸？一种可能的解决机制是通过前述的“内侧开放-闭合构象”（图5）19，在此构象中，底物结合结构域（SBP）被弯曲的跨膜螺旋4和10从胞质侧封闭30,44。尽管本研究中尚未捕获到斑马鱼Abcb4（DrAbcb4）处于内侧开放-闭合构象的状态，但DrAbcb4很可能拥有类似的门控机制。可以推测，当两个结构域闭合时，结合的化合物会接触到更多氨基酸残基，并与两个结构域的残基形成更多相互作用，同时化合物也会相应调整其构象（图4及补充图11），直至形成“内侧开放-闭合构象”。

P-糖蛋白两个结构域的运动减弱可能会导致其ATP酶活性降低。某些化合物（如他立喹达）在特定的向内面向外开放（IF）构象下可与P-糖蛋白以更高的亲和力结合，这很可能会阻断其开合运动并降低ATP酶活性（图5C），而这一点也得到了相关证据的支持——其活性会降至基础活性以下¹⁹。因此，P-糖蛋白两个结构域的运动减弱可能是其抑制机制之一。类似的机制也适用于通过药物交联跨膜（TM）螺旋来抑制P-糖蛋白的情况²¹。通常在低浓度下能促进ATP酶活性的亲和力相对较弱的化合物，若以高浓度存在，也可能通过堵塞转运体来抑制其构象转换。

方法

在毕赤酵母中表达DrAbcb4

按照EasySelect毕赤酵母表达试剂盒（赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州）所述的方案，在毕赤酵母中表达DrAbcb4蛋白。将编码该蛋白的DrABCB4基因（UniProt登录号E7F1E3）从含有全长DrAbcb4的pcDNA3.1载体质粒26中亚克隆至毕赤酵母表达载体pPICZ-A（赛默飞世尔科技公司），并在其C端添加多聚组氨酸标签（构建得到pPICZDrAbcb4-hexahis）。转染前对质粒序列进行了验证。

使用限制性内切酶 PmeI（新英格兰生物实验室公司）对质粒 pPICZ-DrAbcb4-六组氨酸进行线性化处理，随后通过电穿孔法将其导入巴斯德毕赤酵母菌株 KM71H 中。转化子首先在缓冲型最低限度甘油培养基（100 毫摩尔/升磷酸钾，pH 6.0，1.34% 酵母氮源基础，4×10 (4 ×10^{-5} %) 生物素以及 1% 甘油）中于 30℃ 培养，直至 600 纳米处的光密度值（OD600）达到 6。随后收集细胞沉淀，重悬于缓冲型最低限度甲醇培养基（100 毫摩尔/升磷酸钾，pH 6.0，1.34% 酵母氮源基础，4×10 (4 ×10^{-5} %) 生物素以及 0.05% 甲醇）中，使 OD600 数值接近 1。重悬后的细胞在 30℃ 下培养 24 小时，之后以 4000×g 的离心力离心 25 分钟以收集细胞。细胞沉淀于 -80℃ 保存，直至使用。

从毕赤酵母中分离膜组分

将冷冻的细胞沉淀在4℃下解冻，使用手持杜恩匀浆器重悬于匀浆缓冲液（100毫摩尔 三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔 蔗糖、100毫摩尔 6-氨基己酸、1毫摩尔 乙二胺四乙酸、2毫摩尔 苯甲基磺酰氟、2毫摩尔 二硫苏糖醇，pH值7.5）中。将重悬后的细胞以900巴的压力通过微流仪（微流体国际公司）进行三次循环处理，以裂解细胞。通过3500倍重力离心20分钟，将不溶性细胞碎片与上清液分离。为分离上清液中的粗制细胞膜，进行多次100000倍重力的超速离心步骤，每次仅保留沉淀。在首次90分钟的超速离心后，将沉淀重悬于相同的匀浆缓冲液中，再次进行匀浆，随后通过第二次超速离心使沉淀重新沉降在100,000倍重力加速度下超高速离心90分钟。随后，将沉淀重悬于洗涤缓冲液（25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、200毫摩尔/升氯化钠和5毫摩尔/升β-巯基乙醇，pH值7.5）中，再在100,000倍重力加速度下进行第三次超高速离心30分钟。第三次超高速离心后的沉淀重悬于储存缓冲液（25毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、30%甘油、5毫摩尔/升β-巯基乙醇，pH值7.5）中，于-80摄氏度保存备用。

从分离的膜中纯化DrAbcb4

将冷冻膜在4℃下解冻。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（赛默飞世尔科技）测定膜中总蛋白浓度后，用溶解缓冲液（10 mM 三羟甲基氨基甲烷、30 mM 咪唑、75 mM 氯化钠、15% 甘油、5 mM β-巯基乙醇，pH7.5）将蛋白浓度调节至5 mg/ml。在冰上搅拌的同时，缓慢加入20%的十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM，Anatrace公司）储备液，使其终浓度达到2%，以溶解膜蛋白。搅拌1小时后，将溶解后的膜制品以100,000×g的转速进行超速离心30分钟。同时，用添加了30 mM咪唑的A缓冲液（20 mM 三羟甲基氨基甲烷、75 mM 氯化钠、15% 甘油、2 mM β-巯基乙醇、0.0675% 十二烷基-β-D-麦芽糖苷、0.04% 胆酸钠，pH7.5）处理镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）树脂（凯杰公司）。超速离心后的上清液与预平衡的Ni-NTA树脂在4℃下混合2小时，随后装入重力流层析柱。用10倍柱体积的添加30 mM咪唑的A缓冲液洗去未结合的蛋白，并用添加300 mM咪唑的A缓冲液洗脱结合的DrAbcb4蛋白。洗脱液经100 kDa截留分子量的Amicon离心过滤管（赛默飞世尔科技）进一步浓缩后，上样至用尺寸排阻色谱（SEC）缓冲液（20 mM 三羟甲基氨基甲烷、75 mM 氯化钠、2% 甘油、2 mM β-巯基乙醇、0.0675% 十二烷基-β-D-麦芽糖苷、0.04% 胆酸钠，pH7.5）预平衡的Superdex™ 200 Increase 10/300 GL层析柱（思拓凡公司）。流速维持在0.5 ml/min，收集各洗脱组分。采用P-糖蛋白单克隆C219抗体（赛默飞世尔科技旗下英维特根公司，货号#MA1-26528，稀释比例1:500）进行蛋白质印迹分析。

ATP酶活性

通过定量孔雀绿、钼酸盐与从DrAbcb4的ATP水解45,46中释放的无机磷酸形成的绿色复合物，测定了DrAbcb4的ATP酶活性。在测定缓冲液（50 mM HEPES、10 mM氯化镁、4 mM ATP和5 mM二硫苏糖醇，pH 7.5）中加入4-8纳克蛋白质，配制总体积为50微升的反应体系，于30℃下孵育。40分钟后，立即加入800微升终止液（由0.045%孔雀绿和1.4%四水合钼酸铵以1:3的比例溶解于4 N盐酸中新鲜配制而成）终止反应。60秒后，加入100微升34%柠檬酸钠并混匀。将混合物在室温下孵育10分钟，随后加入16微升20%吐温-20以溶解所有沉淀物。采用一系列已知浓度的磷酸二氢钾（10-100微摩尔）溶解于测定缓冲液中，按相同步骤绘制标准曲线。测定所有样品在660纳米波长下的吸光度，并根据标准曲线计算出释放的无机磷酸含量。

为测定重构入脂质体的DrAbcb4的ATP酶活性，将大豆总脂质提取物溶解于50 mM HEPES缓冲液（pH7.5）中，浓度调至20 mg/ml，轻柔超声处理至溶液澄清。在测定前，将DrAbcb4与脂质溶液按1:1的质量比在冰上孵育1小时。维拉帕米刺激的ATP酶活性测定方法为：先将DrAbcb4在补充了一系列浓度维拉帕米的相同测定缓冲液中，于30℃预孵育5分钟，随后加入ATP启动反应。

DrAbcb4 的冷冻电镜网格制备与数据收集

从尺寸排阻色谱法收集到的浓度为6毫克/毫升的DrAbcb4蛋白峰值级分，在冰上与10毫摩尔的(ATP gamma S)以及10毫摩尔的氯化镁共同孵育约30分钟，随后对无药物的DrAbcb4样品进行冷冻制样。对于药物结合的样品，将溶解在二甲基亚砜中的化合物储备液加入体系，使他喹莫德的终浓度为0.28毫摩尔、埃立克达的终浓度为0.24毫摩尔、长春新碱的终浓度为0.45毫摩尔，同时加入5毫摩尔的(ATP gamma S)和5毫摩尔的氯化镁。这些样品在冰上孵育2小时，随后在4摄氏度、20817倍重力加速度条件下离心30分钟，以在网格冷冻前去除所有沉淀物。

在制膜过程中，使用 PELCO easiGlow 装置对 Quantifoil R 0.6/1 200 目铜网或 UltrAuFoil R 0.6/1 300 目金网进行辉光放电，放电时间为 60 秒，电流为 15 毫安。将温度设置为 95% 湿度、4°C 的 Vitrobot Mark IV（赛默飞世尔科技）置于其中，向新鲜辉光放电的网格上滴加 2.5 微升样品，以 20 的吸附力吸附 3 秒后，迅速 plunge 冷冻于液态乙烷中。冷冻电镜数据在马里兰州贝塞斯达的美国国家癌症研究所/美国国立卫生研究院转化研究计划冷冻电镜中心收集，使用的是 300 千伏加速电压的 TITAN Krios 透射电子显微镜（赛默飞世尔科技），该设备配备了 20 电子伏特能量狭缝。数据以超分辨率模式在 Gatan Bioquantum K3 相机上记录为 50 帧堆叠图像（每个像素对应 (0.415 AA)），名义散焦范围为 -0.7 至 -2 微米，总曝光剂量为 54.5 电子/平方埃（对应 (54.5 e^{-} AA^{-2})），曝光时间为 2.5 秒。

冷冻电镜数据处理

数据处理在 CryoSPARC 软件中完成。导入影片并通过增益参考进行校正。通过多通道补丁运动校正对每部影片进行帧对齐，在像素尺寸为 0.83 埃/像素的条件下，将 F-crop 因子设为 1/2。通过多通道补丁 CTF 估计估算对比传递函数（CTF）。使用斑点拾取器进行初始粒子拾取，随后进行二维分类。选取优质的二维类别及对应的粒子堆栈来训练 Topaz 拾取器。所有图像均使用训练好的 Topaz 拾取器重新拾取，得到的粒子堆栈规模远大于斑点拾取器的结果。

为去除无效颗粒，进行了多轮二维分类，选取优质二维类别对应的颗粒进行从头模型构建。在非无效颗粒的从头模型中观察到不同的核苷酸结合结构域（NBD）间距，这已揭示了构象灵活性。为进一步筛选无效颗粒并分析构象灵活性，开展了多轮异质性精修和非均匀精修（NUR）。在2-3轮异质性精修后，对相对干净的颗粒栈进行三维变异性分析（3DVA），以可视化DrAbcb4的构象空间。对于每个数据集，均得到三种具有不同核苷酸结合结构域（NBD）的主要构象在异质和非均一精修结束时，当进一步的精修轮次不再提升分辨率，得到了分离距离。

为进一步提升图谱质量，研究人员使用 RELION 中的贝叶斯抛光或 CryoSPARC 中的基于参考的运动校正（BETA），对每种构象的粒子堆栈进行了逐粒子、基于参考的运动校正。研究人员借助 UCSF PyEM（https://zenodo.org/records/3576630）将粒子元数据从 CryoSPARC 导出至 RELION。随后，在 CryoSPARC 中开展了整体和局部对比传递函数（CTF）精修，接着进行最后一轮非均匀精修。所有图谱的局部分辨率均在 CryoSPARC 中进行估算。四个数据集的完整数据处理流程详见补充图 2、5、6 和 7。

模型构建与精修

使用ModelAngelo49自动生成初始模型，随后在COOT50中对其进行检查和手动调整。利用PRODRG51生成了elacridar、tariquidar和长春新碱分子的拓扑文件。借助这两个半密度图，我们在Refmac/Servalcat软件包34中进行了精修，通过加权Fo-Fc图更清晰地显示配体密度。最终模型使用PHENIX实空间精修模块52在实空间中完成精修和能量最小化。利用Molprobity53进行结构验证。模型精修的统计数据见补充表1。结构图像使用ChimeraX54和PyMOL（PyMOL分子图形系统，Schrödinger公司）绘制。