题目：tRNA m1A modification ensures HSPC production via modulating Nrf1 translation in zebrafish

原文链接：https://doi.org/10.1038/s44319-026-00805-5

期刊：EMBO reports

摘要

在胚胎发生过程中，新生的造血干祖细胞（HSPCs）通过生血内皮细胞的内皮-造血转化（EHT）从生血内皮中产生。尽管这一过程由多种内在因子协同调控，但tRNA介导的翻译调控在内皮-造血转化中的作用仍知之甚少。本研究发现，tRNA m¹A58修饰是斑马鱼胚胎中决定造血干祖细胞命运的主要tRNA修饰类型。敲低trmt61a会导致主动脉-性腺-中肾（AGM）区域的造血干祖细胞生成受损，同时伴随tRNA m¹A58水平降低以及明显的p53依赖性细胞凋亡。机制研究表明，Trmt61a介导的tRNA m¹A58修饰可提高核呼吸因子1（Nrf1）的翻译效率，而Nrf1是线粒体生物发生的关键调控因子。因此，trmt61a缺乏会引发线粒体功能障碍，损害细胞存活，最终抑制造血干祖细胞的生成。本研究证实，tRNA m¹A58修饰通过维持翻译效率对造血干祖细胞的生成至关重要，为优化体外诱导造血干祖细胞的策略提供了新的思路。

引言

造血干祖细胞（HSPCs）通过自我更新、分化和静息这一精准平衡的三重机制维持终身的血细胞生成。在脊椎动物胚胎发育过程中，最早的造血干祖细胞源自生血内皮细胞（HECs），这类细胞位于主动脉-性腺-中肾（AGM）区域背主动脉（VDA）的腹侧壁，通过内皮向造血转化（EHT）过程产生（Boisset 等人，2010；Clements和Traver，2013年；Kissa和Herbomel，2010年）。这一过程显示出核糖体生物发生活性显著升高（Liu等人，2024年），表明在内皮细胞向造血细胞转化（EHT）过程中对蛋白质合成的需求增加。然而，蛋白质组的质量和特异性如何被重塑以指导这一精确的命运转变，目前仍不清楚。

tRNA修饰构成了翻译调控的关键层面（Schultz和Kothe, 2024）。tRNA是被修饰程度最高的RNA种类（Cappannini等人, 2024），这些修饰调控tRNA的稳定性、翻译保真性与效率、tRNA的加工成熟，以及tRNA片段的生物发生（Lin等人, 2018; Muthukumar等人, 2024; Ontiveros等人, 2020; Tuorto等人, 2015; Zhu等人, 2024）。N1-甲基腺苷（((m^{1} ~A))）是最常见的修饰之一。其中，m¹A58是位于tRNA T环58位的保守修饰，在维持tRNA结构稳定性和正常功能中发挥重要作用（Degut等人, 2016; Saikia等人, 2010; Xiong等人, 2018）。在细胞质tRNA中，(m' A 58)修饰由TRMT61A/TRMT6复合物（MTC）催化（Ozanick等人, 2005），这是一种由两个结构同源但进化来源不同的亚基组成的异四聚体复合物（Oerum等人, 2017）。TRMT6主要介导底物识别，使TRMT61A能够催化目标腺苷的甲基化（FinerMoore等人, 2015）。tRNA m¹A58修饰参与多种生物学过程，包括T细胞扩增与抗肿瘤活性、代谢以及造血干细胞稳态，其作用主要通过对关键调控蛋白的翻译调控实现（Liu等人, 2022; Miao等人, 2025; Wang等人, 2021; Zuo等人, 2024）。尽管已有这些研究进展，但对tRNA m¹A58在胚胎造血过程中的作用机制仍知之甚少。

本研究证实，Trmt61a介导的tRNA m1A58修饰对斑马鱼胚胎造血干祖细胞（HSPC）的生成至关重要。tRNA m1A58修饰的缺失会降低核呼吸因子1（Nrf1）的翻译效率，导致主动脉-性腺-中肾区（AGM）内皮细胞（EC）的线粒体生物发生受损和细胞凋亡，最终损害造血干祖细胞的生成。本研究揭示了tRNA修饰在造血干祖细胞个体发育过程中协调翻译调控的关键机制。

结果

Trmt61a 对斑马鱼造血干祖细胞的生成至关重要

为确定m¹A58修饰在造血过程中的功能参与情况，我们首先检测了受精后36小时（即造血干祖细胞产生的时间点）斑马鱼胚胎主动脉-性腺-中肾区的tRNA修饰水平，发现存在大量(tRNA m^{1} ~A)修饰（附录图S1A）。随后，我们检测了MTC基因trmt61a和trmt6在斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。整体原位杂交结果显示，这两个基因均存在母源表达且持续合子表达，与(m^{1} ~A)修饰的存在一致（附录图S1B）。对受精后36小时主动脉-性腺-中肾区内皮细胞和造血细胞的已发表单细胞转录组数据进行分析（Xia等人，2023；数据参考文献：Xia等人，2023）进一步发现，与内皮细胞相比，trmt61a和trmt6在生血内皮细胞和造血干祖细胞中高表达（附录图S1C）。接着，我们对来自受精后36小时Tg(kdrl:mCherry;runx1:en-GFP)胚胎的分选内皮细胞（kdrl⁺runx1⁻）和生血内皮细胞/造血干祖细胞（kdrl⁺runx1⁺）进行实时定量PCR分析，证实这两个基因在生血内皮细胞/造血干祖细胞中富集（图1A；附录图S1D、E），支持了它们在胚胎造血过程中的功能相关性。

为直接探究m1A58修饰的作用，我们首先利用靶向ATG的吗啉代寡核苷酸敲低了trmt61a的内源性表达（trmt61a MO）（附录图S2A）。蛋白质印迹和免疫荧光实验证实Trmt61a蛋白水平显著降低（附录图S2B、C）。值得注意的是，trmt61a缺陷型胚胎在整体形态上未表现出明显异常（附录图S2D），包括神经发生（elavl3和gad1b）、体节发育（myod1）以及血管发育（kdrl和fli1a）均无异常（附录图S2E）。 随后，我们着手研究Trmt61a是否对胚胎造血过程至关重要。原始红系基因（gata1a）和髓系祖细胞基因（pu.1）的表达未受影响（附录图S2F–H）。相比之下，trmt61a吗啉代寡核苷酸处理的胚胎中，确定性造血过程明显受损。整体原位杂交（WISH）和实时荧光定量PCR（qPCR）结果显示，在受精后36小时（hpf）、2天（dpf）和5天（dpf），主动脉-性腺-中肾区（AGM）和尾造血组织（CHT）中造血干祖细胞（HSPC）标志物runx1和cmyb的表达显著降低（图1B、C）。 此外，向红系（以gata1a和hbae1.1标记）、髓系（pu.1和lyz）和淋巴系（rag1）的分化也受到抑制（图1D、E）。通过Tg(kdrl:mCherry;cmyb:EGFP)转基因胚胎实验，我们发现trmt61a吗啉代寡核苷酸处理的胚胎在32 hpf和36 hpf时，AGM区域的造血内皮细胞（HECs）数量及新生的HSPCs显著减少，且2 dpf时CHT区域的cmyb+ HSPCs数量也随之降低（图1F、G）。这些发现表明trmt61a缺乏会破坏HSPC的生成。 一致的是，吗啉代寡核苷酸处理的胚胎中HEC标志物（gata2b和gfi1aa）的表达降低，而动脉标志物（dltc和dll4）的表达未发生改变（附录图S2I）。因此，Trmt61a是HSPC生成所必需的，但对动脉发育并非不可或缺。

为了确定观察到的造血干祖细胞表型的基因特异性，我们通过过表达经过工程改造的trmt61a信使核糖核酸（mRNA）来开展拯救实验，该mRNA可逃脱trmt61a吗啉代寡核苷酸的阻断作用（附录图S2A）。蛋白质印迹法验证了注射信使核糖核酸后Trmt61a的高效过表达（附录图S2J）。整体原位杂交和活细胞成像均显示，过表达trmt61a 能在受精后36小时（36 hpf）有效恢复trmt61a morphant中runx1和cmyb的表达，以及kdrl+cmyb+造血内皮细胞/造血干祖细胞（HEC/HSPCs）的数量（附录图S2K、L）。

综上，这些结果表明Trmt61a对胚胎造血干祖细胞的发育至关重要。

敲除 trmt61a 会消除造血干祖细胞的生成

为从遗传上验证 Trmt61a 在造血干祖细胞（HSPC）生成中的作用，我们利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 trmt61a 突变体。在第2外显子中引入了4个碱基的缺失，导致蛋白质从305个氨基酸截短为95个氨基酸（附录图S3A）。通过杂交 (trmt 61 a^{+/-4 b p}) 成年斑马鱼获得合子纯合 trmt61a 突变体（Ztrmt61a），但这些突变体无法存活至成年。蛋白质印迹实验显示，在受精后4天（4 dpf）的 Ztrmt61a 胚胎中，母源 Trmt61a 蛋白仍持续存在（附录图S3B）。值得注意的是，Ztrmt61a 突变体的造血干祖细胞发育相对正常（附录图S3C），这与 trmt61a 吗啉代寡核苷酸敲低胚胎中观察到的造血干祖细胞表型形成对比，这种差异可能由母源贡献导致。

为敲除母源 trmt61a 基因，我们采用了 CRISPR/Cas9 介导的卵母细胞特异性条件性敲除策略（Zhang 等人，2021）。在 Tg(zpc:zcas9) 背景下，将含有 U6 驱动的、标记有 EGFP 的 trmt61a 单导向 RNA（sgRNA）以及 I-Sce1 酶的构建体注射到单细胞胚胎中，该背景下 Cas9 仅在卵母细胞中特异性表达（附录图 S4A）。经筛选后，我们获得了一株能够实现卵母细胞基因编辑的成年雌性首建鱼。将该雌性与 trmt61a+/-4bp 雄性个体杂交，获得了母源合子型 trmt61a 突变体（Mtrmt61a；trmt61a4bp，占比低于1%），这些后代在EGFP中携带移码突变阳性后代（附录图S4B）。

WISH和免疫荧光实验证实trmt61a基因表达完全缺失，而血管发育正常（附录图S4C-E）。在Mtrmt61a; (trmt61a a^{-4 b p})胚胎中，整体tRNA m1A修饰水平显著降低（图1I）。与trmt61a吗啉代寡核苷酸处理的胚胎类似，在Mtrmt61a; (trmt61a a^{-4 bp})胚胎的AGM和CHT区域，runx1和cmyb的表达显著降低（图1J、K）。重要的是，trmt61a mRNA过表达可恢复Mtrmt61a; trmt61a4bp胚胎中的造血干祖细胞生成（图1L），证实造血缺陷是由trmt61a基因缺失特异性引起的。

综合来看，母源合子型 trmt61a 突变体的生成证实了 Trmt61a 在造血干祖细胞发育中的关键作用。

Trmt61a/Trmt6介导的tRNA m¹A⁵⁸甲基化以细胞自主方式维持造血干祖细胞的生成

为确定 Trmt61a 在造血干祖细胞生成中的作用是否依赖其酶促活性，研究人员进行了蛋白质序列分析，结果显示 Trmt61a 在不同物种间高度保守，关键催化残基天冬氨酸181完全保留（Finer-Moore 等人，2015）（附录图S5A、B）。为直接评估催化依赖性，研究人员利用 CRISPR/Cas9 介导的技术构建了催化失活的敲入品系 Ki(trmt61aD181A-EGFP)（Li 等人，2015）（附录图S5C；“方法”）。免疫荧光实验验证了敲入事件的特异性，结果显示绿色荧光蛋白与 Trmt61a 阳性细胞共定位（附录图S5D）。蛋白质印迹分析进一步证实，催化失活的 Trmt61a 蛋白表达水平与与野生型胚胎相比，trmt61a MO 注射后仍保持敏感（附录图 S5E）。随后，超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）分析显示，trmt61aD181A/D181A 胚胎的整体 tRNA m1A 水平显著降低（图 2A），表明 Asp181 是斑马鱼中的主要催化残基。值得注意的是，仍可检测到残留的 m1A 信号，这表明Trmt61a的其他残基也可能参与tRNA m¹A⁵⁸的催化作用。

图1. trmt61a缺乏导致造血发育异常。

从形态学角度来看，(trmt61a a^{D181A/D181A }) 胚胎发育正常，未出现包括神经系统、肌肉发育、血管发育或动脉分化在内的明显异常（附录图S5F-H）。随后我们检测了 trmt61aD181A/D181A 胚胎中的造血干祖细胞发育情况，并发现在主动脉-性腺-中肾区（36小时受精时）和尾造血组织（2天胚胎和5天胚胎阶段），runx1和/或cmyb的表达减弱（图2B、C）。红系、髓系和淋巴系分化也受到损害（图2D、E）。同样，Mtrmt61a; (trmt61a ^{D181A })胚胎显示(m^{1} ~A)水平降低，并存在造血缺陷（附录图S5I-K）。这些结果表明，Trmt61a通过其对tRNA m1A58修饰的催化作用促进造血干祖细胞的生成。

图2. trmt61a介导的tRNA m1A58修饰对造血干祖细胞的生成至关重要。

接下来，为了进一步确定(m^{1} ~A 58) MTC内不同组分的协同作用，我们随后阻断了RNA结合组分Trmt6的表达（附录图S6A）。WISH、qPCR和活体成像结果显示，trmt6缺陷会导致造血干祖细胞的生成受损（附录图S6B-D），这与trmt61a缺陷胚胎中的结果一致。此外，trmt6 morphant中runx1和cmyb的表达水平也有所下降通过trmt6 mRNA（从trmt6 MO阻断中逃逸）注射（附录图S6E）获救。这些发现表明Trmt6和Trmt61a通过它们作为异四聚体复合物的联合作用共同调节HSPC的发展。

最后，为了确定这种(m' A 58)修饰是否在ECs中本质上起作用，我们应用了fl1a启动子驱动的(trmt61a ^{WT })或(trmt61 a^{D181A })转录本的过表达（从trmt61a MO阻断中逃脱）（图2F）。EC特异性救援实验表明，(trmt61a ^{WT })但不是催化死亡的(trmt61a ^{D181A })变体，显著恢复了trmt61a缺陷胚胎中的runx1和cmyb表达（图2G）。总之，这些数据支持Trmt61a以EC自主和m1A58依赖的方式调节HSPC生成。

Trmt61a缺乏通过p53依赖性凋亡损害HSPC的产生

为了研究HSPC生成受损的机制，我们在36 hpf（附录图S7A）对来自未注射胚胎和trmt61a形态的AGM区域的kdrl+ECs进行了转录组分析。差异表达基因（DEG）分析确定了trmt61a缺陷胚胎中537个下调和525个上调的转录本（图3A）。基因本体论（GO）富集分析显示下调的基因与造血有关，而上调的基因主要与凋亡途径有关（图3B）。与这些发现一致的是，基因集富集分析（GSEA）证实了p53相关信号的显著上调和凋亡的内在途径（图3C）。

此外，WISH和qPCR验证了Mtrmt61a中(p53)表达的改变；trmt61a-4bp胚胎（图3D，E），表明trmt61a的缺失激活了(p53)介导的凋亡。TUNEL检测显示trmt61a敲除胚胎的VDA中凋亡显著增加（图3F），伴随着凋亡相关基因（baxa、baxb、boxa、boxb、badb、bcl2a和sival）的表达增加（图3G）。这些发现表明观察到的HEC/HSPC缺陷归因于改变的凋亡。

为了测试这一点，我们进行了p53功能丧失分析。TUNEL结果显示p53敲除后trmt61缺陷胚胎VDA中的凋亡信号减少（图3H）。关键的是，WISH、qPCR和实时成像结果显示p53敲除恢复了trmt61a缺陷胚胎中的HSPC产生（图3I-K）。这些结果表明trmt61a缺陷主要通过p53依赖性凋亡损害HSPC生成。

Trmt61a 缺失通过下调 Nrf1 损害线粒体生物发生

考虑到Trmt61a在翻译调控中的关键作用（Sun等人，2023年），我们接下来对未注射胚胎和trmt61a morphant在36小时pf（受精后小时）的AGM区域的(kdrl)内皮细胞进行了蛋白质组学分析（附录图S7A）。蛋白质组学分析显示，trmt61a敲低导致148种蛋白下调、33种蛋白上调（图4A），表明整体蛋白质合成减少。嘌呤霉素掺入实验证实了这一发现，该实验证明新合成的蛋白水平降低（附录图S7B）。具体而言，下调的蛋白显著富集于与氧转运、过氧化氢分解代谢、活性氧（ROS）相关的通路代谢和线粒体动力学相关指标出现异常（图4B），提示线粒体功能受损。基因集富集分析（GSEA）进一步显示，trmt61a基因敲除的胚胎中线粒体呼吸链复合物组装过程表达下调（图4C）。此外，流式细胞术分析证实内皮细胞（ECs）的线粒体含量减少（图4D），而实时荧光定量PCR（qPCR）结果显示线粒体生物发生相关基因的表达水平降低（图4E）。这些研究结果表明，trmt61a基因缺陷会导致内皮细胞的线粒体生物发生过程受损。

重要的是，蛋白质组学分析显示，trmt61a 缺陷会导致 Nrf1 蛋白水平显著降低（图4F），这一发现经蛋白质印迹实验得到了验证（图4G）。值得注意的是，NRF1 是线粒体生物发生的主要调控因子（Hu 等人，2022；Zhao 等人，2023）。NRF1 的下调会导致线粒体功能障碍（Wang 等人，2006）。因此，我们推测 trmt61a 缺陷会导致 Nrf1 缺失，这在造血干祖细胞生成过程中是造成线粒体生物发生受损的原因。为验证这一推测，我们开展了功能缺失分析。与对照胚胎相比，在反义寡核苷酸（ASO）注射的胚胎或瞬时突变体（即基因编辑突变体）中，Nrf1 缺陷同样会导致 Nrf1 蛋白减少（图4H）、线粒体生物发生相关基因的表达降低（附录图S7C）以及线粒体含量下降（图4I）。

接下来，我们旨在确定nrf1是否调控造血干祖细胞（HSPC）的生成。整体原位杂交（WISH）结果显示，从1细胞期到2天龄（dpf），斑马鱼胚胎中均存在nrf1的普遍表达（附录图S7D）。然而，将单细胞RNA转录组数据（Xia等人，2023；数据参考文献：Xia等人，2023）与定量聚合酶链反应（qPCR）分析相结合发现，在内皮细胞（ECs）向造血内皮细胞（HECs）转变、再向造血干祖细胞（HSPCs）转变的过程中，nrf1的表达呈渐进性上调（图4J；附录图S7E），这表明Nrf1可能在 definitive 造血过程中发挥潜在作用。值得注意的是，nrf1缺陷与trmt61a缺失表现出相似的表型，会导致36小时pf（hpf）时造血干祖细胞相关基因（runx1和cmyb）的表达显著下调（图4K、L），并且会使主动脉-性腺-中肾（AGM）区域内皮细胞的凋亡信号增强（图4M）。

综合来看，这些研究结果表明，trmt61a基因缺陷主要通过Nrf1依赖性的线粒体生物发生破坏来损害造血干祖细胞的生成。

Trmt61a 促进 Nrf1 翻译以维持造血干祖细胞的生成

为了评估 Trmt61a 介导的 tRNA-m¹A58 修饰如何调控翻译，我们采用了 tRNA 测序和核糖体谱分析测序（Ribo-seq）（附录图 S8A）。tRNA 测序分析表明，在 Trmt61a 缺陷型胚胎中，大多数 tRNA 的 (m^{1} ~A 58) 水平普遍降低（图 5A），而 tRNA 的丰度或片段化模式无显著变化（附录图 S8B-D）。Ribo-seq 分析显示，Trmt61a 缺陷会导致翻译效率（TE）整体下降（图 5B）。密码子依赖性分析发现，Trmt61a 缺陷后，翻译效率降低的基因优先使用被 (m^{1} ~A 58) 低修饰 tRNA 解码的密码子，这与翻译效率升高的基因形成对比（图 5C）。对翻译效率降低的基因进行功能富集分析，发现了多个过度代表的功能类别，包括有氧呼吸、蛋白质稳定以及其他信号通路（附录图 S8E）。总体而言，这些研究结果共同证明，tRNA 中 m¹A58 修饰的减弱会损害密码子偏好性转录本的翻译效率，这些转录本包括参与线粒体功能、蛋白质质量控制及其他信号传导过程。

图3. Trmt61a基因缺陷激活p53依赖性细胞凋亡。

图4. Nrf1介导的线粒体稳态对于HSPC的发展至关重要。

为了进一步确定 Nrf1 的翻译是否受 trmt61a 介导的 tRNA-A58 调控，我们进行了多聚核糖体谱分析在AGM区域。结果显示，尽管nrf1的mRNA丰度略有增加，但其与多聚体的结合显著降低（图5D、E）。这些结果表明，在缺乏功能性 （注：原文末尾未完整，翻译按现有内容完成）Trmt61a。为了验证Nrf1翻译受损是否是trmt61a缺陷表型的成因，我们设计了一种密码子优化的nrf1 cDNA变体，通过同义密码子替换，使其在缺乏功能性Trmt61a的情况下仍能高效翻译，并在内皮特异性fli1a启动子的驱动下对其进行表达（图5F）。将fli1a-nrf1WT-tdTomato和(flila-nrfl ^{MUT }) -tdTomato显微注射到trmt61a吗啉代敲低胚胎后，我们观察到两个样本中nrf1和tdTomato的mRNA表达水平相当（图5G）。关键的是，尽管在trmt61a吗啉代敲低胚胎中表达(flila-nrflwr)并未使Nrf1或tdTomato的蛋白水平发生显著变化，但密码子优化的(flila-nrfl ^{MUT })构建体却实现了高效表达（图5H）。正如预期的那样，这种密码子优化的nrf1构建体恢复了Nrf1蛋白的丰度，并显著挽救了trmt61a缺陷胚胎中造血干祖细胞生成的缺陷（图5H,I），而野生型nrf1构建体仅产生了轻微的蛋白表达增加但无功能恢复（图5H、I）。这些结果表明，Trmt61a 主要通过控制内皮细胞（ECs）中的 Nrf1 翻译来调节造血干祖细胞（HSPC）的生成。

综合来看，这些研究结果表明，内皮细胞中的Trmt61a对于维持正常造血干祖细胞发育所必需的Nrf1翻译至关重要。

图5. Trmt61a以m1A58依赖的方式调控Nrf1的翻译效率

讨论

在本研究中，我们发现tRNA (m^{1} ~A 58)修饰作为关键的翻译调控因子，可保障造血干祖细胞（HSPC）的生成。具体而言，Trmt61a/Trmt6介导的m1A58修饰能促进核呼吸因子1（Nrf1）的翻译，而Nrf1是线粒体生物发生的核心调控因子。这一机制通过维持……保护造血干祖细胞（HSPC）在胚胎造血过程（EHT）中维持线粒体完整性以避免细胞凋亡（图6）。这些发现揭示了tRNA m¹A58修饰在调控胚胎造血不可或缺的蛋白质合成方面具有此前未被发现的功能。

翻译控制使细胞能够绕过从头转录，同时维持大量蛋白质合成，从而快速适应发育信号（Giguere 等人，2024；Miao 等人，2025）。tRNA 修饰是这一过程中关键的表观转录组调控因子（Zhang 和 Lu，2025）。其中，tRNA (m^{1} ~A 58) 修饰是丰度最高且进化上高度保守的 tRNA 修饰之一。以往研究表明，TRMT61A/TRMT6 复合物通过 (m^{1} ~A) 依赖性翻译调控（Zuo 等人，2024）以及其他非经典功能（He 等人，2024）参与成体造血干细胞的生理过程。然而，其在胚胎造血过程中的作用仍不明确。本研究鉴定出 tRNA m¹A58 是胚胎造血干祖细胞（HSPC）发生特发性所需的翻译调控因子。此外，研究发现 trmt61a 缺陷不会改变斑马鱼胚胎中整体 tRNA 丰度、单个 tRNA 种类或 tRNA 来源片段的谱图。起始子 (tRNA ^{Met }) 水平未发生改变，进一步表明翻译起始过程基本得以保留。综上，这些研究结果支持这样一种模型：tRNA (m^{1} ~A 58) 可能在斑马鱼造血过程中对特定转录本（如 Nrf1）的翻译延伸进行精细调控。

在受影响的靶点中，Nrf1 成为关键的下游效应分子。尽管 Nrf1 的转录本水平基本保持不变，但其多聚体结合能力和蛋白丰度却trmt61a缺乏导致(m^{1} ~A 58)缺失后，该指标显著降低，这表明Trmt61a-Nrf1这一调控轴发生在翻译水平。由于Nrf1是调控线粒体基因表达和氧化还原平衡的转录因子（Chow等人，2019；Hu等人，2022；Scarpulla，2012），Nrf1蛋白的减少预计会引发下游的转录变化，包括激活应激反应程序，如p53依赖性凋亡通路。

在脊椎动物中，内皮-造血转化（EHT）伴随着向氧化磷酸化的代谢转变（Azzoni 等人，2021；Pv 等人，2024）以及线粒体生物发生的增强（Prakash 和 Inamdar，2025）。我们的研究结果表明，nrf1 的表达在 EHT 过程中逐渐增加，与线粒体含量和需求的增加相平行，而 Nrf1 翻译受损会破坏线粒体生物发生并降低线粒体含量。由于线粒体是内在凋亡的核心枢纽（Desagher 和 Martinou，2000；Nguyen 等人，2023），线粒体功能障碍可能会使造血内皮细胞（HECs）对应激诱导的细胞死亡更加敏感。因此，trmt61a 缺陷胚胎中升高的 p53 信号传导和凋亡代表了翻译诱导的线粒体失衡的下游结果。

总之，我们的研究结果明确了胚胎造血过程中的一种翻译调控机制，在该机制中，依赖tRNA m¹A58的选择性蛋白质合成调控能够保障线粒体完整性、抑制(p53)介导的细胞凋亡，并确保造血干祖细胞（HSPC）的正常产生。这些发现为体外诱导造血干祖细胞以及再生医学疗法提供了新的思路。

图6. 示意图展示Trmt61a介导的tRNA m¹A58修饰在造血干祖细胞生成中的潜在机制

方法

斑马鱼品系

成年斑马鱼（包括图宾根品系、Tg(kdrl:mCherry)、Tg(cmyb:EGFP)、Tg(fli1a:EGFP)、Tg(runx1:en-GFP)、由邵明提供的 Tg(zpc:zcas9)、(trmt61a a^{+/-4 bp})、(Ki(trmt61a ^{D181A }) -EGFP、Tg(fli1a: trmt61aWT-EGFP)、Tg(fli1a: trmt61aD181A-EGFP)）在标准条件下于28.5℃的系统水中饲养。斑马鱼胚胎和幼鱼通过自然产卵获得，其分期参照先前描述的方法（Kimmel 等人，1995），收集流程参照 Li 等人（2022）的研究。动物实验均严格遵循中国医学科学院血液学研究所伦理委员会批准的伦理准则进行。

吗啉代寡核苷酸、反义寡核苷酸、载体构建、mRNA合成与显微注射

本研究中的吗啉代寡核苷酸（MO）购自 Gene Tools 公司，被显微注射至单细胞期胚胎中（每个胚胎注射剂量：trmt61a MO 4 纳克、trmt6 MO 4 纳克、对照 MO 4 纳克、p53 MO 4 纳克，低剂量 trmt61a MO 2 纳克）。nrf1 反义寡核苷酸（ASO）及对照 ASO 由 GenePharma 公司合成，每个单细胞期胚胎注射 100 皮克。

在mRNA的合成与显微注射实验中，将trmt61a（ENSDART00000003517.9，可逃避trmt61a吗啉代寡核苷酸阻断）或trmt6 mRNA（ENSDART00000062092.7，可逃避trmt6吗啉代寡核苷酸阻断）的全长编码序列（CDS）克隆至pCS2质粒，随后利用mMESSAGE mMACHINE™SP6试剂盒（货号AM1340，Invitrogen公司）合成mRNA，并向1细胞期的胚胎中注射，每个胚胎注射量为100皮克。

为进行救援实验，利用HiFi DNA组装预混液（E2621S，NEBuilder）将trmt61a的全长CDS或突变的(trmt61a ^{D181A })序列克隆至带有fli1a启动子和EGFP的pDestTol2pA2载体中。将构建体（每个胚胎30-40皮克）与tol2 mRNA（每个胚胎30-40皮克）共同显微注射至1细胞期的胚胎中。

利用CRISPR/Cas9技术构建(trmt61a a^{-4 bp})突变体及母源trmt61a突变体

trmt61a突变体采用CRISPR/Cas9技术构建，方法如先前所述（Chang等人，2013年）。靶向外显子2的trmt61a单导向RNA（5’-TAGAGGATCTGCGTTCGGTG-3’）通过https://www.benchling.com/crispr网站设计。将Cas9蛋白（货号A36496，Invitrogen公司）与trmt61a单导向RNA共同显微注射至1细胞期胚胎中进行基因组编辑。通过PCR和桑格测序鉴定出4个碱基对缺失的trmt61a突变体，所用引物列于表EV1。通过杂交(trmt61a a^{+/-4 bp})成年斑马鱼，获得合子纯合trmt61a突变体（Ztrmt61a）。

为构建母源trmt61a突变体，在https://www.benchling.com/crispr网站设计了4条靶向trmt61a第2外显子的高效sgRNA（sgRNA 1：5’TCAGACTCAAACTCGCTACG-3’；sgRNA 2：5’-GCTCAGACTCAAACTCGCTA-3’；sgRNA 3：5’-TGCACCCTACACCAGAGCTG-3’；sgRNA 4：5’-AGGTTGATAGTCCACAGCTC-3’）。利用高保真DNA组装主混合试剂，将4个由U6启动子驱动的sgRNA表达模块进行连接，构建带有EGFP报告基因标签的pGGDestISceIEG-4sgRNA载体。将该载体与按照之前描述的方法（Zhang 等人，2021年），将 I-SceI 限制性内切酶（货号 R0694，购自 NEB 公司）显微注射到 Tg(zpc:zcas9) 背景的单细胞期胚胎中。鉴定母体 EGFP 表达并完成基因分型后，将可产生母体突变体的雌鱼与编号为 (trmt61 a^{+/-4 b p}) 的雄鱼进行回交，以获得 Mtrmt61a;trmt61a⁴ᵇᵖ 胚胎。随后，分别提取 EGFP 阳性胚胎的基因组 DNA 分析其基因型。用于验证母体 trmt61a 突变体的引物列于表 EV1 中。

利用CRISPR/Cas9技术构建(Ki(trmt61a ^{D181A } -EGFP))

为构建Ki(trmt61aD181A-EGFP)斑马鱼品系，通过https://www.benchling.com/crispr网站设计了靶向内含子2的sgRNA（5’-GAGTCATTTAAGGTTGTGGG-3’）。供体载体基于现有方法（Li等人，2015年）设计，并利用HiFi DNA Assembly Master Mix试剂盒构建。该载体包含三个核心组件：左臂、P2A-EGFP编码序列和右臂。为保留trmt61a的完整编码序列，左臂从内含子2中sgRNA靶向位点的上游区域开始，跨越包含特定位点突变（c.542 A>C；p.D181A）的整个外显子3，并终止于外显子4中trmt61a终止密码子前的最后一个碱基。右臂包含trmt61a的终止密码子和(3')非翻译区。此外，为便于成功编辑胚胎的鉴定，供体质粒整合了由myl7启动子驱动的心脏特异性EGFP报告基因。

供体构建体与sgRNA和Cas9蛋白共同注射到1细胞期胚胎中。筛选出表现出心脏EGFP表达的幼虫并培养至成年。通过荧光模式以及连接PCR结合测序验证，鉴定出具有种系传递的首建者，获得了稳定的(Ki(trmt61a ^{D181A }) -EGFP品系。连接PCR的引物列于表EV1中。

使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物生成nrf1脆饼

设计了靶向nrf1基因第2外显子的sgRNA。用于显微注射时，通过将nrf1 sgRNA、Cas9蛋白与KCl缓冲液（浓度通过CrispantCal测定（Burger等人，2016年））在37℃下孵育5分钟，制备了核糖核蛋白（RNP）复合物。总共向1细胞期胚胎注射了1纳升的复合物溶液。通过PCR和桑格测序，并使用表EV1中列出的引物，对突变进行了验证。

全 mounts 原位杂交（WISH）、荧光原位杂交（FISH）以及末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色

WISH实验按照标准方案进行（Zhang等人，2017年）。简要来说，反义探针的DNA模板被克隆到pGEM-T载体中。使用T7或SP6 RNA聚合酶，通过地高辛（Dig）标记的NTP混合物（货号11277073910，罗氏公司）进行体外转录，合成RNA探针。将固定并脱水的斑马鱼胚胎与RNA探针在65摄氏度下进行杂交。杂交完成后，将胚胎与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体（货号11093274910，罗氏公司）孵育，再用BM紫色底物（货号11442074001，罗氏公司）进行染色。

对于荧光原位杂交（FISH），将36小时受精后（hpf）的胚胎与地高辛（Dig）标记的kdrl探针杂交后，与过氧化物酶（POD）偶联的抗地高辛抗体（货号11633716001，罗氏公司）共同孵育。以TSA Plus荧光素溶液（货号NEL741E001KT，珀金埃尔默公司）作为底物。荧光原位杂交完成后，依据制造商的操作方案，使用原位细胞死亡检测试剂盒（货号12156792910，罗丹明红色，罗氏公司）进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色。

OP-嘌呤掺入实验

在35小时受精后（hpf），向Tg(kdrl:mCherry)转基因斑马鱼胚胎的卵黄囊注射O-炔丙基-嘌呤霉素（5微摩尔，货号HY-15680，购自MCE）。一小时后，使用荧光激活细胞分选术（FACS）分离(kdrl)细胞。将分选后的细胞离心，并用4%多聚甲醛（PFA）在室温下重悬。离心后，沉淀经洗涤，随后用Click-(iT=)细胞反应缓冲液混合物（货号C10269，购自Invitrogen）重悬。在室温下孵育后，通过流式细胞术检测染色后的细胞悬液。

采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量tRNA的N¹-甲基腺嘌呤（m¹A）水平

使用TRIzol试剂（15596018CN，赛默飞世尔科技）从斑马鱼胚胎的AGM区域提取总RNA。按照先前描述的方法（Liu等人，2022；Miao等人，2025），遵循制造商的方案，使用MEGAclear™试剂盒（AM1908，赛默飞世尔科技）纯化小RNA组分（(<200 nt)，<200个核苷酸，富含成熟tRNA物种）或其他RNA组分（((≥200 nt))）。对于Mtrmt61a；trmt61a (4bp)和(trmt61a a^{D181A/D181A })，产物经完全水解后，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UHPLC-MS/MS）进行分析，方法参考已建立的研究（Yang等人，2017）。对三个独立的生物学重复进行统计学评估。

线粒体检测

为评估线粒体含量，将36小时post-fertilization（hpf）时Tg(fli1a: EGFP)胚胎的腹主动脉-性腺-中肾（AGM）区域解离为单细胞悬液，于28.5℃、避光条件下用MitoTracker（货号M22426，Invitrogen公司）染色20分钟。所有样本均通过BD FACS Canto II流式细胞仪（BD生物科学公司）进行分析。利用Flow Jo v10软件（BD生命科学公司）对分选后的(fila ^{+})内皮细胞中，MitoTracker阳性细胞比例以及(MitoSOX)或5c9ddd3e-f08f-45c6-b093-711eac69bc64对应的平均荧光强度（MFI）进行定量分析。

蛋白质印迹法

按照既定方案进行蛋白质印迹分析（Zhang 等人，2017）。将斑马鱼胚胎的躯干区域在裂解缓冲液中匀浆，免疫印迹实验使用以下抗体：抗β-肌动蛋白抗体（4967S，细胞信号技术公司，1:1000）、抗Trmt61a抗体（PA5-88013，赛默飞世尔科技，1:750）、抗Trmt6抗体（PA5-65616，赛默飞世尔科技，1:750）、抗Flag标签抗体（F7425，西格玛奥德里奇公司，1:1000）、抗Nrf1抗体（12482-1-AP，普罗泰奇公司，1:1000）。

免疫荧光

对于整体免疫荧光实验，将1细胞期的斑马鱼胚胎用4%多聚甲醛固定，使用0.3% Triton X100透化，并用1%牛血清白蛋白封闭。随后，将胚胎与抗Trmt61a抗体（PA5-88013，赛默飞世尔科技，1:50）或抗(m^{1} ~A)抗体（D345-3，MBL，1:50）共同孵育。

按照之前描述的方法（Li 等人，2023年）对横切片进行了免疫荧光染色。简要来说，将36小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎进行冷冻保护处理，放入30%蔗糖中，用含0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤，包埋于最佳切割温度（OCT，4583，樱花公司）基质中，随后使用徕卡CM1900冷冻切片机进行切片。将切片固定在载玻片上，与抗-Trmt61a抗体（PA5-88013，赛默飞世尔科技，1:50）或抗-(m^{1} ~A)抗体（D345-3，MBL，1:50）共同孵育。

实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）

使用 TRIzol 试剂从斑马鱼胚胎的 AGM 区域（36 小时胚胎期）、CHT 区域（2 天胚胎期或 5 天胚胎期）（((n=30))）或 36 小时胚胎期 AGM 区域的分选细胞群中分离总 RNA。对于组织样本，使用 M-MLV 逆转录酶（M1701，Promega）进行第一链 cDNA 合成；对于分选细胞群，使用 RevertAid RT 试剂盒（K1691，赛默飞世尔科技）。随后，使用 SuperReal PreMix Plus（FP205，天根）配制 qPCR 反应体系，并在 QuantStudio3 实时荧光定量 PCR 系统（赛默飞世尔科技）上进行分析。所有实验均进行三次独立生物学重复。qPCR 所用引物列于表 EV1。

共聚焦显微镜技术

对于体内成像，将胚胎固定在1%低熔点琼脂糖中。对于FISH和TUNEL后的胚胎，将鱼胚胎安装在显微镜载玻片上。使用Andor Dragonfly 505共聚焦显微镜（牛津仪器）进行成像，随后使用ImarisViewer（牛津仪器）和ImageJ（美国国立卫生研究院）进行图像分析。

基于数据非依赖采集（DIA）的定量蛋白质组学

在受精后36小时，通过荧光激活细胞分选（FACS）从野生型或trmt61a吗啉寡聚核苷酸（MO）注射胚胎的主动脉-性腺-中肾（AGM）区域分离出内皮细胞（kdrl+）。将约(1 ×10^{5})富集的细胞裂解，并用磁珠选择性富集低丰度蛋白，随后进行胰蛋白酶消化。接着，在Vanquish Neo超高效液相色谱（UHPLC）系统（赛默飞世尔科技）上进行肽段分离，再使用Orbitrap Astral质谱仪（赛默飞世尔科技）进行数据非依赖性采集（DIA）质谱分析。利用DIA-NN软件（v1.8.1）处理原始DIA质谱数据，针对斑马鱼UniProtKB参考蛋白质组（分类学ID：7955）进行数据库检索和蛋白定量。蛋白倍数变化(change >1.5)（上调/下调）且(P value <0.05)的蛋白被认定为显著差异表达蛋白。差异表达蛋白的完整列表见数据集EV1。

RNA测序及分析

将kdrl+内皮细胞分选至含有RNase抑制剂（2313 A，Clontech）、Triton X-100溶液、dNTP混合物和寡聚-dT引物的细胞裂解缓冲液中。使用KAPA HiFi HotStart Ready MIX（KAPA Biosystems）进行逆转录和PCR预扩增。经AMPure XP磁珠（A63882，Beckman）纯化后，将cDNA片段结合在C1磁珠上，使用KAPA Hyper Prep Kit（KK8504，Roche）构建文库。将文库与NEB U型接头连接，并在Illumina Novaseq 6000平台上进行测序。

在进行RNA测序数据分析时，利用Hisat2（2.2.1版本）软件，采用默认参数将高质量测序序列比对到斑马鱼参考基因组（GRCz11版本）。使用Samtools（1.9版本）为每个样本保留质量值≥20且唯一比对的序列。通过HTSeq（0.13.5版本）对比对上的序列数量进行定量分析。采用DESeq2进行差异基因表达分析，设定显著性阈值为P值(value <0.05)和倍数变化绝对值(change ≥1.5)。trmt61a morphant中差异表达基因的相关信息列于数据集EV2中。利用metascape（3.5版本）进行基因本体（GO）富集分析，并通过ggplot2进行可视化。GSEA（4.0.3版本）分析使用了分子特征数据库（MSigDB 7.5版本）中的基因集。

tRNA测序与分析

使用 Zymo RNA 试剂盒（R1016，Zymo Research 公司）从总 RNA 中提取小 RNA（(<200 nt)，主要为成熟 tRNA）。将 1 微克小 RNA 在 0.1 摩尔/升 Tris-HCl（pH 9.0）中于 37 摄氏度孵育 30 分钟进行脱酰基反应。随后，将一半脱酰基后的小 RNA 与 AlkB 蛋白（R0639S，Beyotime 公司）进行体外去甲基化处理。去甲基化反应体系（20 微升）包含 0.3 微升 AlkB 酶、2 微升缓冲液 I 和 2 微升缓冲液 II，于 37 摄氏度孵育 2 小时。经提取和乙醇沉淀后，对去甲基化和未处理的 RNA 样本均进行文库制备流程。

在构建文库时，首先使用T4多核苷酸激酶（T4 PNK，货号M0201S，购自NEB）在37℃下对RNA进行去磷酸化处理1小时。随后使用T4 RNA连接酶1（货号M0204L，购自NEB）将3'端RNA接头（5'rAPP-AGATCGGAAGAGCGTCGTG-3'-SpC3）连接至RNA上。去除多余接头后，使用MyOne硅烷磁珠（货号37002D，购自Invitrogen）对RNA进行纯化。接着，将10微升纯化后的RNA与10皮摩尔逆转录引物（序列为ACACGACGCTCTTCCGATCT）混合，在80℃下变性2分钟，随后立即置于冰上骤冷。在含有Induro逆转录酶（货号M0681S，购自NEB）、1×逆转录缓冲液、3 mM (MgCl_{2})、1毫摩尔脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及1单位/微升核糖核酸酶抑制剂的反应缓冲液中，于55℃下进行逆转录反应2小时。之后，使用MyOne硅烷磁珠对得到的互补DNA（cDNA）进行纯化。利用T4 RNA连接酶1将5'端接头（5'-Phos-NNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-3'-SpC3）连接至cDNA的3'端，再通过MyOne硅烷磁珠完成纯化步骤。最后使用带索引的引物通过聚合酶链式反应（PCR）对文库进行扩增，并在8%三溴酚铋-硼酸（TBE）凝胶上纯化文库。测序工作在Novaseq 6000测序平台上完成，采用双端150碱基对（PE 150）的测序策略。

在进行 tRNA 测序分析时，使用 fastp（v0.24.0）对原始测序读长进行质量控制和预处理，参数如下：-U --umi_loc=read2 --umi_len=10 --umi_prefix=UMI --merge。随后对清洁读长进行反向互补处理。并使用默认参数的bwa-mem工具将其映射到来自GtRNAdb的斑马鱼成熟tRNA注释序列。利用默认设置的UMI-tools工具去除重复读数。随后，使用samtools mpileup将BAM文件转换为mpileup格式，并通过awk代码识别突变，同时排除插入和缺失突变。将(m^{1} ~A)位点定义为位于55-61位的A碱基，经AlkB处理后，突变率至少降低30%的位点突变率归为零。最后，将对应同一密码子的所有tRNA同工型进行合并，用于后续分析。

核糖体谱分析及检测

Ribo-seq 文库的制备参考既往研究并做了少量修改（Ferguson 等人，2023；Reid 等人，2015）。文库构建时，向样本中加入 250 微升裂解缓冲液。冰上孵育并离心后，收集上清液，加入双三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH 6.0）酸化裂解液。随后向裂解物中加入 P1 核酸酶，于 37 摄氏度下孵育 100 分钟。通过加入两倍体积的 TRIzol™LS（10296010CN，赛默飞世尔科技）提取 RNA，分离出小 RNA 片段。实验样本使用华大智造小 RNA 文库制备试剂盒（NR801，华大智造）构建文库，输入样本使用 RNA-Seq 试剂盒（12309ES24，翌圣生物），严格按照制造商的操作流程进行。

在RNA-seq分析中，使用fastp（v0.24.0）软件并采用默认参数对原始测序读长进行质量控制和预处理。随后使用STAR（v2.7.11b）软件并采用默认参数将过滤后的干净读长比对至参考基因组（GRCz11）。利用featureCounts（v2.0.3）软件并结合参数：-p --countReadPairs -s 2 -t exon 进行基因表达定量分析。 在Ribo-seq分析中，使用fastp（v0.24.0）软件并设置参数--length_required 20 --merge 对原始测序读长进行质量控制、接头切除，并将其合并为单端序列。首先将干净读长分别比对至从GtRNAdb和NCBI数据库下载的tRNA和rRNA序列。随后使用STAR（v2.7.11b）软件并结合参数：--outFilterMultimapNmax 1 --outSAMattributes NH HI AS nM --outSJfilterReads Unique，将未比对上的读长比对至参考基因组（GRCz11）。利用featureCounts（v2.0.3）软件对核糖体保护片段（RPF）进行定量分析，并使用xtail（v1.1.5）软件并采用默认参数进行差异翻译效率分析。将具有(P value <0.05)和绝对倍数(change ≥1.5)的基因视为翻译效率发生显著变化的基因。

多聚核糖体谱分析与定量聚合酶链式反应

采用改良方案开展多聚核糖体谱分析（Leesch 等人, 2023）。简要来说，将200个野生型或trmt61a吗啉代寡核苷酸注射的36小时post-fertilization胚胎的AGM区域置于含环己酰亚胺的培养基中孵育，随后在裂解缓冲液中进行匀浆。所得裂解物经孵育和离心处理后，将上清液铺加到添加了100微克/毫升环己酰亚胺和40单位/毫升核糖核酸酶抑制剂的10%-50%蔗糖梯度中。离心完成后，收集各组分并使用TRIzol试剂提取RNA。随后进行逆转录和实时荧光定量聚合酶链式反应分析，以评估靶基因的翻译效率。

密码子转换实验

在密码子转换实验中，将野生型 nrf1（编码序列为 ((n r f 1^{WT}))，对应 ENSDART00000138183.2）或经修饰的 nrf1（编码序列为 (n r f 1(n r f 1^{MUT}))）的编码序列克隆至含有内皮细胞特异性 fli1a 启动子和 tdTomato 基因的 pDestTol2pA2 质粒中。随后，将构建体（每个胚胎 40 皮克）与 tol2 mRNA（每个胚胎 35 皮克）共同显微注射至 1 细胞期的胚胎中。

统计分析

使用 ImageJ 软件并依据既定方案（Dobrzycki 等人，2020 年）对全胚原位杂交（WISH）结果进行定量分析。采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。定量数据以多次生物学重复的平均值±标准差（SD）表示。采用双侧非配对 Student's t 检验评估统计学显著性。