题目：cGAS attenuates hypoxia-inducible factor signaling via chaperone-mediated autophagic degradation of HIFα

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2026.117377

期刊：Cell Reports

摘要

环GMP-AMP（cGAMP）合酶（cGAS）是先天免疫反应的关键组成部分，在一种古老的应激反应中启动干扰素基因刺激蛋白（STING）依赖性信号传导。缺氧诱导转录因子1α和2α调控缺氧反应，这是另一种古老的应激反应。该反应调控参与缺氧适应的基因。我们发现，缺氧诱导的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI ((PIP_{2}))）耗竭导致cGAS从质膜重新定位，从而抑制缺氧信号传导。从机制上讲，cGAS增强HIFα与HSC70/LAMP2A的结合，进而引发HIFα的分子伴侣介导的自噬（CMA）。长时间缺氧会增强cGAS的低聚化，降低cGAS促进HIFα降解的能力。在小鼠和斑马鱼中敲除cGAS会导致缺氧诱导基因上调，这种变化提高了机体对缺氧的耐受性。这些结果表明，cGAS通过促进HIFα的CMA降解来减弱缺氧信号传导。

引言

环GMP-AMP合酶（cGAS）被鉴定为胞质DNA的先天免疫感受器，这是先天免疫领域的一个里程碑。1 cGAS可检测异常的基因组、线粒体及微生物双链DNA（dsDNA），并催化2′,3′-环GMP-AMP（2′3′-cGAMP）的生成，激活干扰素基因刺激蛋白（STING）衔接蛋白，进而诱导抗菌及炎症反应。反应。此外，cGAS 还与调控调控DNA损伤修复、衰老、老化、自噬，细胞代谢以及抗肿瘤活性。

本研究发现cGAS靶向HIFα，促进其通过分子伴侣介导的自噬降解，从而减弱缺氧信号通路。

结果

缺氧诱导cGAS从质膜上发生移位

近日，有研究表明缺氧会快速且暂时性地消耗4-磷酸磷脂酰肌醇（PI4P）和磷从质膜上解离的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PI ((PIP2))）。值得注意的是，cGAS 与 PI (PIP) 相互作用以定位于质膜。因此，我们研究了低氧是否能通过诱导 cGAS 从质膜上的异位分布来消耗 (PIP)。为验证该理论，我们对THP-1细胞中的cGAS和PI (PIP _{2})进行了免疫荧光染色。由于尚无市售抗cGAS抗体可通过免疫荧光染色检测内源性cGAS，9我们通过慢病毒感染构建了稳定表达Myc-cGAS的THP-1细胞。我们通过免疫印迹验证了THP-1细胞中Myc-cGAS的表达（图S1A）。如先前报道，PI (PIP)在低氧条件下从质膜解离（图1A）。类似地，被抗Myc抗体染色的cGAS也从质膜解离并分散于整个细胞（图1A）。常氧条件下，细胞骨架标志物F-肌动蛋白与cGAS在质膜共定位（图S1B）。然而，cGAS分散于THP-1 细胞缺氧条件下的细胞质（图S1B）。在H1299细胞中也获得了相似结果（图S1C和S1D）。

图1.在THP-1细胞中，cGAS在缺氧条件下从质膜离域（A）共聚焦显微镜图像显示在正常氧（21%(O_{2}))）或缺氧（1%(O_{2}))）下THP-1细胞中用抗-Myc和抗-PI(PIP)抗体免疫荧光染色检测到的过表达的cGAS和内源性PI(PIP)6小时（((n=5))（B）在正常氧（（2））或缺氧（1%(O_{2} ))）下THP-1细胞中用抗-HIF1α和抗-Myc抗体免疫荧光染色检测到的内源性HIF-1α和过表达的Myc-cGAS 6小时（((n=5))（A）和（B）中的数据代表三个生物学重复。标尺条，10μm。

为了确认缺氧条件已经实现，我们通过免疫荧光染色检查了内源性HIF1α的存在（图1B）。cGAS与HIF1α部分共定位。然而，在缺氧条件下，HIF1α主要分布在细胞核中（图1B）。为了验证这一发现，我们使用适用的软件检查了cGAS（德克萨斯红）和HIF1α（荧光素异硫氰酸酯[FITC]）信号，发现它们匹配得非常好（图S2A和S2B）。在HEK293T细胞中获得了类似的结果（图S2C-S2E）。

这些数据表明，由于PI(PIP)的耗尽，缺氧触发了cGAS从质膜的离域化，它将cGAS锚定在质膜上。此外，cGAS可能会在缺氧条件下与HIF1α发生相互作用。

图2. cGAS减弱缺氧信号（A）在H1299细胞中过表达的FLAG-cGAS的免疫印迹（IB）。（B-F）在正常氧（21%(O_{2})）或缺氧（1%(O_{2}))）下转染或不转染FLAG-cGAS的H1299细胞中BNIP3（B）、GLUT1（C）、LDHA（D）、VEGF（E）和EPO（F）mRNA的定量实时PCR（实时qPCR）分析（21%8261cba2-a63a-4109-9729-9f26cf5151be）或缺氧（1%00fcdca8-ccda-47f0-b13f-9e7dcdee9cd0）18小时。（G）(cGAS ^{+/+})和(cGAS ^{-1-})H1299细胞中内源性cGAS的IB。（H-L）野生型或cGAS缺陷H1299细胞（((c G A S^{+/+}or c G A S^{-1-}))在正常氧（21%(O_{2})）或缺氧（1%(O_{2}))）下18小时的BNIP3（H）、GLUT1（I）、LDHA（J）、VEGF（K）和EPO（L）mRNA的实时qPCR分析。（M和N）在正常氧（21%(O_{2})或缺氧（1%(O_{2} ))）下用或不用PX478（200μM）处理18 h的野生型或cGAS缺陷H1299细胞（((CGAS ^{+/+})或(cGAS ^{-1-1})）中BNIP3（M）和PDK1（N）mRNA的实时qPCR分析。（O）在转染小干扰RNA（siRNA）对照（Control）或HIF1αsiRNA的(cGAS ^{+/+})或(cGAS ^{-1-})H1299细胞中HIF1α的IB 48 h，然后在正常氧（21%(O_{2})）或缺氧（1%(O_{2} ))）下4 h。（P）转染siRNA对照（Control）或HIF1αsiRNA 48 h，然后在正常氧（21%(O_{2})）或缺氧（1%(O_{2} ))）下18 h的(cGAS ^{-1-})H1299细胞中BNIP3 mRNA的实时qPCR分析。（Q）在常氧（21%(O_{2})）或缺氧（1%(O_{2} ))）下转染或不转染FLAG-cGAS的(HIF1 beta^{+/+})或(HIF 1 beta^{-1-})H1299细胞中GLUT1 mRNA的实时qPCR分析。(HIF1 beta^{+/+})和(HIF 1 beta^{-1-})H1299细胞中HIF-1β的（R）IB。（B）-（F）、（H）-（N）、（P）和（Q）中的数据显示为平均值±SD；每个点代表来自三个独立实验的代表性实验的技术复制。统计意义由双向方差分析确定。（O）和（R）中的数据代表三个生物重复。

cGAS 减弱缺氧信号通路

缺氧条件下cGAS从质膜的易位促使我们提出假设，即cGAS可能会影响缺氧信号通路。为验证这一假设，我们过表达cGAS并检测了典型缺氧应答基因的表达情况（图2A-2F）。有趣的是，在缺氧条件下，cGAS的过表达显著降低了这些基因的表达（图2A-2F）。相反，在H1299细胞中敲除cGAS则导致缺氧条件下这些基因的表达上调（图2G-2L）。用缺氧模拟剂(CoCl_{2})处理后也得到了相似的结果（图S3A-S3D）。此外，在缺氧条件下的H1299细胞（((c G A S^{-/-}))）中，加入HIF1α抑制剂PX478[14]可消除cGAS敲除引起的BNIP3和PDK1表达上调（图2M）。同时，通过小干扰RNA（siRNA）敲低HIF1α，也能消除缺氧条件下H1299细胞（((c G A S^{-1-}))）中cGAS敲低导致的BNIP3表达上调（图2O和2P）。

为验证 cGAS 是否通过缺氧信号通路影响缺氧诱导基因表达的减弱，我们使用了 HIF1β 缺失的 H1299 细胞，据信该细胞中的经典缺氧信号通路处于失活状态。有趣的是，在 HIF1β 缺失的 H1299 细胞（((H I F 1 beta^{-1-}))）中，cGAS 的过表达并未抑制 GLUT1 的表达（图 2Q 和图 2R）。

综合来看，这些数据表明cGAS会减弱缺氧信号通路。

cGAS 与 HIF1α 相互作用并促进其降解

随后我们研究了cGAS是否能与HIF1α相互作用。免疫共沉淀实验显示，外源性cGAS与外源性HIF1α存在相互作用（图3A和图3B）。在THP-1细胞中，内源性cGAS在低氧条件下与内源性HIF1α相互结合（图3C和图3D）。此外，细菌表达的cGAS也与细菌表达的HIF1α存在相互作用，这表明cGAS可以直接结合HIF1α（图3E）。结构域定位分析显示，cGAS的全长序列是高效结合HIF1α所必需的，而HIF1α的C端足以与cGAS结合（图S4A和图S4B）。

有趣的是，cGAS 过表达以剂量依赖性方式诱导 HIF1α 降解（图3F）。相反，在缺氧条件下，THP-1 细胞中 cGAS 的敲低会增加 HIF1α 蛋白水平（图3G）。值得注意的是，cGAS 敲低细胞中增加的 HIF1α 蛋白在缺氧条件下会发生动态变化；在缺氧 4 小时后其水平达到峰值，并随着暴露时间延长而下降（图3H）。

为确定cGAS介导的HIF1α降解是否依赖于PHD/VHL系统和FIH，我们检测了两种HIF1α突变体，即双脯氨酸残基突变体（P402A/P564A）（HIF1α-DM）和三突变体（P402A/P564A/N803A）（HIF1α-TM）。cGAS的过表达诱导了两种突变体的降解（图3I-3K）。在VHL缺陷型（((VHL^{-1-}))）H1299细胞中，cGAS同样促进了HIF1α的降解（图3L）。此外，在p65敲低的H1299细胞中，cGAS敲低仍导致HIF1α蛋白水平升高（图S5）。此外，cGAS对HIF1α的降解似乎不依赖于STING（图S6A和S6B）。

与共转染FLAG空载体对照相比，共转染FLAG-cGAS导致HIF1α的降解速度更快，即使添加环己酰亚胺以阻断新蛋白质的合成也是如此（图3M和图3N）。

这些数据表明cGAS直接绑定到HIF1α，pro moting其降解独立于PHD/VHL系统。

cGAS促进伴侣介导的HIF1α自噬降解

为了研究cGAS介导的HIF1α降解的潜在机制，我们使用了各种抑制剂，包括proteasome抑制剂（MG132）、早期自噬抑制剂（3-MA）和溶酶体降解抑制剂（氯喹[CQ]），以确定哪一种可以阻止cGAS诱导的HIF1α降解。CQ的加入有效地阻止了由过表达的cGAS诱导的HIF1α的降解，但不能阻止MG132或3-MA诱导的HIF1α的降解（图4A）。此外，只有CQ在(cGAS ^{+/+})和(cGAS ^{-1-})H1299细胞中维持内源性HIF1α的水平（图4B）。此外，所有HIF1α的赖氨酸到精氨酸突变体都被cGAS过表达降解（图S7），这证实E3连接酶/泛素/蛋白酶体蛋白降解系统不参与cGAS诱导的HIF1α降解。因此，cGAS可能诱导HIF1α的溶酶体降解。

图3. cGAS与HIF-1α相互作用以诱导HIF-1α降解(A和B) 过表达的cGAS与过表达的HIF1α相互作用的免疫共沉淀（CoIP）实验。(C和D) 缺氧条件（1% (O_{2} ))）下处理4小时，THP-1细胞中内源性cGAS与HIF1α相互作用的免疫共沉淀实验。(E) GST下拉实验用于研究细菌表达的GST-HIF-1α蛋白与His-cGAS蛋白的相互作用。(F) HEK293T细胞中过表达的FLAG-cGAS对Myc-HIF1α蛋白稳定性的影响。(G) 内源性HIF1α的免疫印迹（IB）分析。常氧条件（21% (O_{2})）或缺氧条件（1% (O_{2}))）下处理4小时，野生型或cGAS敲低（KD）的THP-1细胞中内源性HIF1α的免疫印迹分析。(H) 常氧条件（21% (O_{2} ))）或缺氧条件（1% (O_{2}))）下，野生型或cGAS敲低的THP-1细胞中内源性HIF-1α的免疫印迹分析。(I) 转染FLAG-cGAS的HEK293T细胞中野生型HIF1α及其突变体P402A和P564A的免疫印迹分析。(FLAG-cGAS) (J) 转染不同剂量FLAG-cGAS的HEK293T细胞中外源HA-HIF1α-DM（编码HIF1α双突变[P402A/P564A]）的免疫印迹分析。(K) 转染不同剂量FLAG-cGAS的HEK293T细胞中外源HA-HIF1α-TM（编码HIF-1α三突变[P402A/P564A/N803A]）的免疫印迹分析。(L) 转染不同剂量FLAG-cGAS的(V H L^{+/+})和(VHL^{-1-}) H1299细胞中内源性HIF1α的免疫印迹分析。(M) H1299细胞中用环己酰亚胺（CHX，20 μM）处理不同时间（分钟）后，与FLAG空载体或FLAG-cGAS共转染的外源性HIF1α的免疫印迹分析。(N) (M)中相对HIF1α蛋白水平的定量分析。(A)–(M)中的数据为三次生物学重复的代表性结果。

图4. cGAS促进分子伴侣介导的HIF1α自噬降解（A和B）蛋白质溶酶体降解抑制剂氯喹（CQ）能够阻断cGAS诱导的HIF1α降解。（B）野生型（WT）或cGAS缺陷型H1299细胞（((c G A S^{+/+}or c G A S^{-1-}))）在常氧（21% (O_{2} ))）或低氧（1% (O_{2})）条件下分别用二甲基亚砜（溶剂对照）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，10 mM）、巴弗洛霉素A1（10 nM）、MG132（20 μM）或CQ（50 mM）处理6小时。（C）野生型或cGAS缺陷型H1299细胞（(CGAS+/+)或(cGAS ^{-1-})）在常氧（21% (O_{2}))）或低氧（1% (O_{2})）条件下处理3小时后内源性HIF1α的免疫印迹分析；细胞经血清饥饿或在正常培养基中培养24小时。（D和E）野生型、cGAS敲低（KD）、cGAS/HSC70双敲低（D）或cGAS/LAMP2A双敲低的THP-1细胞在常氧（21% (O_{2})）或低氧（1% (O_{2} ))）条件下处理4小时后内源性HIF1α的免疫印迹分析。（F和G）(cGAS ^{+/+})或(cGAS ^{-1-})的H1299细胞在低氧（1% (O_{2} ))）条件下处理3小时。（H）转染递增剂量FLAG-cGAS的HEK293T细胞中外源性野生型HIF1α或其双突变体（编码HIF-1α双突变体[Q573A/L574A]）的免疫印迹分析。（I）HEK293T细胞转染野生型HIF1α或其双突变体Q574/L574A后，在有血清或无血清条件下培养16小时，再继续培养8小时。（J）HEK293T细胞共转染野生型HIF1α或Q574/L574A与HA-HSC70，同时添加或不添加Myc-cGAS培养24小时，随后用CQ处理8小时。（A）-（J）中的数据为三次生物学重复的代表性结果。

既往研究表明，分子伴侣介导的自噬（CMA）会靶向HIF1α进行溶酶体降解。16-18 因此，我们探究了cGAS是否促进CMA对HIF1α的降解。CMA依赖分子伴侣HSC70的活性，该蛋白可与靶标结合并介导其与LAMP2A的相互作用。随后，LAMP2A将靶标转运至溶酶体进行降解。19 与预期一致，cGAS能够与HSC70和LAMP2A结合（图S8A-S8C）。内源性LAMP2A仅在缺氧2小时时与内源性cGAS结合，4小时后则解离（图S8C）。此外，在缺氧时间延长的情况下，cGAS与HSC70的结合会减弱（图S8C）。因此，我们推测cGAS可能促进CMA对HIF1α的降解。

如前所述，血清饥饿增加了HIF1α的CMA降解。16为了测试cGAS是否可以促进CMA介导的HIF1α降解，我们在正常血清培养基或血清饥饿缺氧条件下比较了(cGAS ^{+/+})和(cGAS ^{-1-})H1299细胞中的HIF1αpro tein水平。在正常血清培养基中，(cGAS ^{-1-})H1299细胞中的HIF1α水平高于(cGAS ^{+/+})H1299细胞（图4C）。然而，在血清饥饿时，(cGAS ^{-1-})和(cGAS ^{+/+})H1299细胞中的HIF1α水平相似（图4C）。因此，cGAS确实促进了CMA介导的HIF1α降解。

在缺乏HSC70或LAMP2A的情况下，HIF1α在缺氧下不会被cGAS降解（图4D和4E）。此外，我们观察到HSC70或LAMP2A与HIF1α的结合减少(cGAS ^{-1-}) 型 H1299 细胞相较于 (cGAS ^{+/+}) 型 H1299 细胞。这研究表明，在缺氧条件下，cGAS 可能会增强 HIF1α 与关键 CMA 因子 HSC70 及 LAMP2A 的结合。

据报道，STUB1/CHIP 是 CMA 介导 HIF1α 降解所必需的[17]。为了确定 STUB1/CHIP 是否参与 cGAS 促进的 CMA 对 HIF1α 的降解，我们检测了 cGAS 对缺失经典类 KFERQ 基序（ΔNEFKL）的 HIF1α 突变体降解的影响，该突变体预计不会发生 STUB1/CHIP 介导的 CMA 降解。令人意外的是，cGAS 过表达仍诱导了该突变体的降解（图 S9A）。此外，有研究表明，STUB1 介导的 HIF1α K63 连接泛素化是 CMA 降解 HIF1α 的信号[18]。然而，我们发现 cGAS 并不促进 HIF1α 的多聚泛素化或 K63 连接的多聚泛素化（图 S9B）。因此，STUB1/CHIP 不参与 cGAS 促进的 CMA 对 HIF1α 的降解，且 HIF1α 中的 N529EFKL533 类 KFERQ 基序并非 cGAS 介导 CMA 降解的作用靶点。

为确定HIF1α中负责cGAS促进的CMA降解HIF1α的类KFERQ基序，我们进行了逐步结构域定位分析。研究发现，位于HIF1αC端附近的一段由9个氨基酸组成的保守区域（567-PMDDDFQLR-575）是cGAS促进HIF1α降解所必需的（图S10A-S10C）。我们利用KFERQ基序查找工具（https://rshine.einsteinmed.edu/）在HIF1α中搜索类KFERQ基序，共鉴定出7个候选基序²⁰（图S10D）。有趣的是，基序6（QLRSF）位于这一9个氨基酸的保守区域内（图S10B）。随后我们构建了突变体（Q573A/L574A）并检测了cGAS对其稳定性的影响。cGAS的过表达并未诱导该突变体的降解（图4H）。此外，血清饥饿可诱导野生型HIF1α的降解，但对Q573A/L574A突变体无此作用（图4I），表明该突变体对CMA降解具有抗性。在CQ存在的情况下，cGAS增强了野生型HIF1α与HSC70的结合，却未增强突变体与HSC70的结合（图4J）。上述结果表明，573-QLRSF-577这一类KFERQ基序是cGAS增强HIF1α与HSC70结合并促进CMA降解HIF1α的关键基序。

有趣的是，在BECN1和ATG5缺陷的HEK293T细胞中，cGAS过表达仍能促进HIF1α降解（图S10E），这表明经典自噬通路并不参与cGAS介导的HIF1α降解过程²¹。

综合来看，这些数据表明cGAS通过一个类KFERQ基序增强HIF1α与HSC70的结合。这会促进低氧条件下HSC70介导的伴侣分子介导的自噬（CMA）对HIF1α的降解，进而减弱低氧信号通路。

缺氧诱导cGAS发生低聚化，而cGAS低聚化程度的增强会降低其促进HIF1α降解的能力

为了更好地理解cGAS在促进CMA降解HIF1α过程中的作用，我们检测了先前报道的cGAS突变体，包括酶活性缺失突变体（Δ171–174、R176A、E225/D227A、R255A、E236A、D319A、R349E、K350E、R353E、R384A、K394E、E398A、K407A、K411A和S435A）22-24、DNA结合缺陷突变体（N210A/Y214A/K384A）22以及核泛素化缺陷突变体（K427/428A）、25个磷酸化缺陷突变体（T68E和S213D）、26个棕榈酰化缺陷突变体（C404/405S）、27个以及质膜结合缺陷突变体（R71/75A）、9个单ISG化缺陷突变体（K187R）、28个和DNA长度依赖性激活突变体（L195R）。在检测的24个突变体中，仅K187R、K394E、C404/405A和K427/428A未诱导HIF1α降解（图S11A和S11B）。我们进一步证实，这四个突变体在缺氧条件下未诱导内源性HIF1α降解（图S11C）。显然，cGAS独立于其酶活性诱导HIF1α降解。

值得注意的是，187位赖氨酸残基的两种不同突变（K187R和K187N）在体内促进cGAS寡聚化和活性方面似乎发挥着不同的作用。28 K187R通过促进cGAS寡聚化来增强细胞抗病毒免疫，而K187N则无此作用。28 与K187R不同，我们发现K187N会诱导HIF1α降解，这与野生型cGAS的作用相似（图S11D）。已知cGAS是通过双链DNA诱导的寡聚化被激活的。29 这些现象促使我们验证低氧是否能诱导cGAS寡聚化，以及cGAS寡聚化是否与其促进CMA降解HIF1α的能力相关。低氧处理确实促进了cGAS寡聚化，且该效应随低氧时间延长而增强（图5A）。正如预期的那样，鲱鱼精巢DNA（HT-DNA）处理也引发了cGAS寡聚化，其水平在4小时达到峰值后急剧下降（图5A）。

有趣的是，敲低HIF1β可减少缺氧诱导的cGAS寡聚化（图S12A和S12B），这表明缺氧诱导的cGAS寡聚化可能依赖于HIF信号通路。敲除HIF1β会破坏HIF下游信号通路，而在缺氧条件下敲除PHD2则不影响HIF信号通路。为进一步验证这一观点，我们在常氧条件下使用FG4592阻断三种PHD酶，结果出现了与缺氧诱导模式相似的cGAS寡聚化（图S12C）。一致地，VHL敲除也在常氧条件下引发了cGAS寡聚化（图S12D）。这些数据表明，缺氧条件下的cGAS寡聚化可能至少部分由HIF信号通路驱动。

为了确定 HT-DNA 是否影响缺氧信号通路，我们开展了额外的实验分析。无论是否存在 cGAS，HT-DNA 对 HIF1α 的稳定性均无明显影响（图 S12E）。同样，HT-DNA 的加入也不影响缺氧响应基因的表达（图 S12F）。有趣的是，缺氧能够在小鼠组织中诱导 cGAS 寡聚化（图 S13）。

一项cGAMP活性测定进一步表明，低氧并未诱导cGAMP的产生，而HT-DNA处理则可以（图S14）。因此，尽管低氧可诱导cGAS寡聚化，但其机制可能与DNA病毒感染的机制不同。

有趣的是，K187R 的低聚化程度相较于野生型 cGAS 和 K187N cGAS 有所提高（图5B）。由于野生型和 K187N cGAS 会诱导 HIF1α 降解，而 K187R cGAS 则不会，我们推测在低氧条件下，某些 cGAS 突变会增强其低聚化，进而导致功能丧失关于诱导HIF1α的CMA降解的能力。为验证这一理论，我们选取了四种与野生型cGAS类似、能诱导HIF1α降解的突变体：Δ171–174、N210A/Y214A/K384A、E225A/D227A以及D319A。我们还选取了另外四种丧失诱导HIF1α降解能力的突变体（K187R、K394E、C404/405A和K427/428A）。我们进行了半变性采用**硫代十二烷基麦芽糖苷琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）**分析低氧条件下的聚集情况。与预期一致，低氧会使四种丧失诱导HIF1α降解能力的突变体发生低聚化，而不会使四种保留该能力的突变体发生低聚化（图5C）。

图5. 低氧诱导cGAS发生寡聚化，而cGAS寡聚化程度的增强会降低其促进HIF1α降解的能力(A) 低氧诱导cGAS发生寡聚化。用低氧（1% 1% (O_{2})）或HT-DNA（3 μg/mL）刺激THP-1细胞0-8小时，通过半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）分析检测cGAS的寡聚化情况。(B) 低氧（1% (O_{2} ))）处理4小时后，野生型（WT）cGAS及其突变体（K187N或K187R）在HEK293T细胞中寡聚化的免疫印迹（IB）结果。(C) (cGAS ^{-1-}) H1299细胞转染野生型cGAS及其突变体（Δ171–174、K187R、N210A/Y214A/K384A、E225A/D227A、D319A、K394E、C404/405S和K427/428R），经低氧处理4小时后，对cGAS进行SDD-AGE分析（上图）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析（下图）。(D和E) 转染野生型cGAS及其突变体（Δ171–174、K187R、N210A/Y214A/K384A、E225A/D227A、D319A、K394E、C404/405S和K427/428R）的(cGAS ^{-1-}) H1299细胞用氯喹（CQ，50 mM）处理6小时后，通过免疫共沉淀（CoIP）检测内源性HSC70（D）或LAMP2A（E）与内源性HIF-1α的相互作用。(F和G) 低氧（1% (O_{2})）处理4小时后，转染野生型cGAS及其突变体（Δ171–174、K187R、N210A/Y214A/K384A、E225A/D227A、D319A、K394E、C404/405S和K427/428R）的(cGAS ^{-1-}) H1299细胞中，通过免疫共沉淀（CoIP）检测内源性HSC70（F）或LAMP2A（G）与内源性HIF-1α的相互作用。(A)-(G)中的数据均为三次生物学重复的代表性结果。

图6. 小鼠中敲除cGas可通过增强缺氧信号传导提高缺氧耐受性(A) 低氧（10% 氧气）处理0–2.5小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠（7周龄）的图像。(B) 低氧（10% 氧气）处理3小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠（每组(n=3)只）血清中促红细胞生成素（Epo）的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果。(C) 常氧（21% 氧气）或低氧（10% 氧气）处理3小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠大脑中指定蛋白的免疫印迹（IB）结果。低氧（10% 氧气）处理3小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠大脑中血管内皮生长因子A（Vegfa）、促红细胞生成素（Epo）和磷酸甘油酸激酶1（Pgk1）mRNA的实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。(D和E) 常氧（21% 氧气）或低氧（1% 氧气）处理4小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）(D)和骨髓来源树突状细胞（BMDCs）(E)中指定蛋白的免疫印迹（IB）结果。常氧（21% 氧气）或低氧（1% 氧气）处理18小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）(D)和骨髓来源树突状细胞（BMDCs）(E)中促红细胞生成素（Epo）、血管内皮生长因子A（Vegfa）和葡萄糖转运蛋白1（Glut1）mRNA的实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析。(F) 常氧（21% 氧气）或低氧（1% 氧气）处理4小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠胚胎成纤维细胞（MLF细胞）中指定蛋白的免疫印迹（IB）结果。(G和H) 低氧（1% 氧气）条件下，加入50 mM氯喹（CQ）处理4小时后，(cGas ^{+/+})和(cGas ^{-1-})小鼠胚胎成纤维细胞（MLF细胞）中内源性热休克同源蛋白70（Hsc70）(G)或溶酶体相关膜蛋白2a（Lamp2a）(H)与内源性缺氧诱导因子1α（Hif1a）相互作用的免疫共沉淀（CoIP）结果。(B)和(C)–(E)中除左侧免疫印迹外的数据以平均值表示，每个点代表来自三次独立实验中代表性实验的技术重复。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）确定统计学显著性。(F)–(H)中的数据为三次生物学重复的代表性结果。

为进一步探究这两组突变体的潜在作用机制，我们旨在确定其促进HIF1α与HSC70及LAMP2A结合的能力。在常氧条件下，我们加入CQ抑制HIF1α降解，并在cGAS突变体存在的情况下检测HIF1α与HSC70或LAMP2A的相互作用。如预期的那样，四个能够诱导HIF1α降解的突变体增强了HIF1α与HSC70或LAMP2A的结合，这与其诱导HIF1α降解的能力一致。相反，四个不能诱导HIF1α降解的突变体则无此效果（图5D和图5E）。在低氧条件下，过表达四个可诱导HIF1α降解突变体的(cGAS ^{-1-}) H1299细胞中，HIF1α蛋白水平低于过表达四个不可诱导HIF1α降解突变体的(cGAS ^{-1-}) H1299细胞。HIF1α之间的关联且在过表达这四种可诱导HIF1α降解的突变体的(cGAS ^{-1-}) H1299细胞中，与HSC70或LAMP2A的结合水平更高过表达这四种可诱导HIF1α降解的突变体的细胞中（图5F和5G）

我们设计了阴性对照和阳性对照来验证cGAS及其突变体在低氧信号通路中的功能。在低氧条件下，过表达绿色荧光蛋白（GFP，阴性对照）对低氧诱导基因的表达无影响。在(cGAS ^{-1-})的H1299细胞中。相比之下，过表达SHARP1（阳性对照）如预期般显著抑制了缺氧诱导的基因表达（图S15A和S15B）。30 在同一组实验中，cGAS显著抑制了GLUT1和VEGF的表达；然而，cGAS突变体K187R并未抑制其表达，这与其无法诱导HIF1α降解的结果一致。

综合来看，这些数据表明缺氧可诱导cGAS寡聚化。然而，长期缺氧导致的cGAS寡聚化增强可能会降低HIF1α与HSC70或LAMP2A的结合能力。这会减弱cGAS促进CMA降解HIF1α的作用。

在小鼠体内敲除cGAS可增强缺氧信号通路并提升机体的缺氧耐受性

为了确定cGas是否在体内减弱缺氧信号通路以及cGas介导的减弱作用所引发的生物学后果，我们利用CRISPR-Cas9技术在小鼠中敲除了cGas（图S16A-S16D）。正如先前研究报道的那样，(cGas ^{-1-})小鼠以预期的孟德尔频率出生，且未表现出明显的发育异常。我们将三只体重和性别（雄性）相近的(cGas ^{+/+})小鼠和三只(cGas ^{-1-})小鼠置于缺氧工作站（10% (O_{2})）中并观察它们的行为。在基线（0小时）时，(cGas ^{+/+})小鼠和(cGas ^{-1-})小鼠之间未观察到差异（图6A；（视频S1）。缺氧2.0小时后，一只编号为(cGas ^{+/+})的小鼠试图跳到用纱布封口的烧瓶瓶口，以吸入更多氧气，因为工作站的空气会通过瓶口进入烧瓶（图6A；视频S2）。缺氧2.4小时后，另一只编号为(cGas ^{+/+})的小鼠开始跳跃（图6A；视频S3）。尽管所有编号为(cGas ^{-1-})的小鼠在缺氧状态下都表现出不适，但没有一只在编号为(cGas ^{+/+})的小鼠之前跳跃。这可能是因为如此低的氧浓度对它们来说并非如此紧急（图6A；视频S2和S3）。因此，编号为(cGas ^{-1-})的小鼠可能比编号为(cGas ^{+/+})的小鼠更耐缺氧。

促红细胞生成素（EPO）检测结果显示，(cGas ^{-1-}) 小鼠的 EPO 水平显著高于 (cGas ^{+/+}) 小鼠（图 6B）。随后，我们通过实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分析，检测了缺氧条件下小鼠大脑、骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）以及树突状细胞（BMDCs）中缺氧诱导基因的 mRNA 表达水平。与 (cGas ^{+/+}) 小鼠相比，(cGas ^{-1-}) 小鼠的大脑和细胞中所有检测的缺氧诱导基因均出现上调（图 6C-6E）。这些数据表明，在小鼠中敲除 cGas 确实能促进缺氧信号通路的激活。

我们进一步使用小鼠肺成纤维细胞（MLF）来探究体内cGas的缺失是否会影响Hif1α与Hsc70或Lamp2a之间的结合。在缺氧条件下，当CQ阻断Hif1α的降解时，Hif1α之间的相互作用且在(cGas ^{-1-})细胞中，HIF1α与HSC70或LAMP2A的结合要弱得多在 (cGas ^{+/+}) 细胞中（图6F–6H）。因此，cGas 增强了 Hif1α 与 Hsc70 或 Lamp2a 之间的结合。

综合来看，这些数据表明，通过cGas减弱缺氧信号通路可能具有生理相关性。

敲除斑马鱼中的cGas可增强低氧信号通路并提升低氧耐受性

cGAS 在哺乳动物和斑马鱼之间具有进化保守性（图S17）。此外，斑马鱼cGAS会诱导斑马鱼hif1αa的降解，而这一过程会被氯喹（CQ）阻断（图S18A）。对应于人类HIF1α突变体Q573A/L574A的斑马鱼hif1αa突变体Q535A/L536A，同样对cGAS诱导的降解具有抗性（图S18B）。另外，斑马鱼hif1α可与斑马鱼hsc70和lamp2结合，斑马鱼cGAS也可与斑马鱼hsc70和lamp2结合（图S18C-S18F）。值得注意的是，伴侣介导的自噬（CMA）已被证实存在于斑马鱼中³²。因此，我们进一步利用斑马鱼模型，通过促进CMA介导的HIF1α降解来验证cGAS的生理功能。我们采用CRISPR-Cas9技术在斑马鱼中敲除了cgas基因（图S18G-S18J）。与cGAS缺陷型小鼠相似，cGAS缺陷型斑马鱼的出生比例符合孟德尔遗传规律比例正常，且未表现出明显的发育异常。暴露于低氧环境（2% 氧气，对应编号 (O_{2} ))）18小时后，编号 (cgas ^{+/+}) 的受精后3天（dpf）斑马鱼幼虫的死亡率高于编号 (cgas ^{-1-}) 的幼虫（图7A和图7B）。低氧诱导基因pai1、phd3和vegfa在编号 (cgas ^{-1-}) 的斑马鱼中的表达水平高于编号 (cgas ^{+/+}) 的斑马鱼（图7C至图7E）。

图7. 斑马鱼中cgas的敲除通过增强缺氧信号传导提高了缺氧耐受性(A) 常氧（21% 氧气）或低氧（2% 氧气）条件下cgas+/+和cgas−/−斑马鱼幼鱼（3天龄，每组5条）的图像。死亡幼鱼（红色箭头标记）表现为无运动、无血液循环且身体退化。(B) (cgas ^{+/+})和(cgas ^{-1-})斑马鱼幼鱼（3天龄，每组5条）在低氧（2% 氧气）条件下暴露18小时的存活曲线。采用对数秩检验确定统计学显著性。(C–E) (cgas ^{+/+})和(cgas ^{-1-})斑马鱼幼鱼在低氧（2% 氧气）条件下暴露6小时后，pai1 (C)、phd3 (D)和vegfa (E) mRNA的实时定量PCR分析。(F–H) cgas+/+和(cgas ^{-1-})成年斑马鱼（3月龄，每组4条）在低氧（5% 氧气）条件下暴露0小时(F)、2小时(G)和4小时(H)的图像。红色箭头指示濒死斑马鱼。(I–K) (cgas ^{+/+})和(cgas ^{-1-})成年斑马鱼（3月龄）在低氧（5% 氧气）条件下暴露3小时后，大脑中pai1 (I)、phd3 (J)和cite2 (K) mRNA的实时定量PCR分析。(L和M) (cgas ^{+/+})和(cgas ^{-1-})斑马鱼幼鱼（48小时龄）在常氧（21% 氧气）或低氧（8% 氧气）条件下暴露10小时后，红细胞中功能性血红蛋白的邻茴香胺染色。(N) (cgas ^{-1-})斑马鱼幼鱼（48小时龄）在低氧（8% 氧气）条件下暴露10小时后，红细胞数量较(cgas ^{+/+})斑马鱼幼鱼（48小时龄）增加（每组3条）。(O) Tg (gata1: (eGFPY/cgas ^{+/+}))和Tg (gata1: (eGFP/cgas ^{-1-}))斑马鱼的荧光图像显示，(cgas ^{-1-})斑马鱼幼鱼（48小时龄）在低氧（8% 氧气）条件下暴露10小时后，gata1阳性红细胞数量多于(cgas ^{+/+})斑马鱼幼鱼（48小时龄）。(B)–(E)、(I)–(K)和(N)中的数据以平均值±标准差表示；每个点代表来自三次独立实验中代表性实验的技术重复。采用双因素方差分析确定统计学显著性。

我们将受精后3个月（mpf）、体重相同的成年斑马鱼(cgas ^{+/+})和(cgas ^{-1-})放入低氧工作站（5% (O_{2} ))）中观察其行为。最初在0小时，(cgas ^{+/+})斑马鱼与(cgas ^{-1-})斑马鱼之间未观察到差异（图7F；视频S4；图S19A和S19B）。低氧处理2小时后，(cgas ^{+/+})斑马鱼开始朝着培养瓶口跳跃（图7G；视频S5）。4小时后，7条(cgas ^{+/+})斑马鱼（((n=9))）死亡，而8条(cgas ^{-1-})斑马鱼（((n=9))）仍存活（图7H；视频S6；图S19A–S19C）。

编号为 (cgas ^{-1-}) 的斑马鱼对低氧的耐受性似乎更强高于(cgas ^{+/+})的斑马鱼。一致的是，低氧诱导基因pai1、phd3和cited2的表达在(cgas ^{-1-}) 斑马鱼的含量高于低氧条件下的a5f450f5-98e0-4f33-9459-50f670931fa 斑马鱼条件下（图7I-7K）。

随后我们通过邻茴香胺染色法比较了(cgas ^{+/+})斑马鱼幼鱼的红细胞数量，以及(cgas ^{-1-}) 采用邻-dianisidine染色法对斑马鱼幼鱼进行染色。低氧条件下，(cgas ^{-1-}) 斑马鱼幼鱼的红细胞数量高于 (cgas ^{+/+}) 斑马鱼幼虫（图7L-7N）。这一结果在 gata1-GFP 标记的斑马鱼幼虫中得到了验证（图7O）。

这些数据表明，cGAS 会减弱斑马鱼体内的缺氧信号通路。

cGAS 可促进 HIF2α 经分子伴侣介导的自噬降解

我们探究了cGAS是否也能促进分子伴侣介导的HIF2α自噬降解。HIF2α与cGAS相互作用，且CQ可阻断cGAS诱导的HIF2α降解（图S20A-S20C）。因此，cGAS可能也会促进HIF2α的分子伴侣介导自噬降解。有趣的是，cGAS在HIF1α上靶向CMA降解的位点（Q573/L574）在HIF2α中是保守的（Q541/L542）（图S20D）。我们构建了HIF2α突变体（Q541A/L542A）并检测了cGAS对其的影响。令人意外的是，cGAS仍能诱导该突变体的降解（图S20E），这表明HIF2α中另一个类KFERQ基序可能是cGAS介导的促进了CMA的降解。我们使用KFERQ基序查找工具（https://rshine.einsteinmed.edu/）在HIF2α中鉴定出一个经典的类KFERQ基序（LDKFQ）（图S20F）。然而，该基序仅在哺乳动物的HIF2α中保守存在，而在斑马鱼的hif2α中则不保守（图S20G）。我们构建了HIF2α突变体（K587A/F588A/Q589A），发现cGAS无法诱导其降解（图S20H）。因此，尽管cGAS对HIF2α的靶向位点与对HIF1α的不同，但cGAS也可能促进HIF2α的分子伴侣介导的自噬降解。

基于这些结果，我们提出了特定细胞类型中缺氧信号调控的工作模型。在常氧条件下，cGAS 被 (PIP) 锚定在质膜上。HIFα 经经典的 PHD/VHL 通路降解。在缺氧条件下，由于 PI (PIP _{2}) 耗竭，cGAS 从质膜释放。缺氧可诱导 cGAS 低聚化至一定水平，促进 HSC70 与 HIFα 的 KFERQ 样基序结合并形成复合物。随后该复合物与溶酶体受体 LAMP2A 结合，导致 HIFα 的溶酶体降解，从而减弱缺氧信号。长时间缺氧会使 cGAS 低聚化程度更高，降低其在 HIFα 与 HSC70 或 LAMP2A 结合过程中的促进作用。

讨论

在自然界中，动物持续暴露于各种生物和非生物应激源之中。生物应激源包括寄生虫、细菌和病毒等各类病原体。非生物应激源包括低氧水平（缺氧）、极端温度和极端大气压。在生物进化的全过程中，动物进化出了多种信号通路来应对这些应激。缺氧信号通路是一种由低氧水平触发、受HIFα调控的古老应激反应。另一种古老的应激反应是先天免疫应答信号通路，该通路由病原体相关分子模式（PAMPs）触发，并受NF-κB、IRF3和IRF7等多种转录因子调控。33 这两种通路之间存在串扰，尤其是缺氧信号通路的关键因子对先天免疫应答的调控方面。33–38 本研究发现先天免疫DNA感受器cGAS可调控缺氧信号通路，这为为这两条古老的应激信号通路之间存在显著的串扰提供了更多证据。

基于(PIP)将cGAS定位于人THP-1细胞质膜的研究，9我们推测cGAS可能会在缺氧刺激下从细胞质膜上解离，这随后可能会影响缺氧信号通路。我们在本研究中验证了这一假设。然而，缺氧可诱导cGAS低聚化，而低聚化会促进CMA降解HIF1α。这似乎与cGAS的细胞质膜定位无关，因为PI (PIP _{2})以及细胞质膜结合缺陷突变体（R71/75A）仍能诱导HIF1α的降解。因此，cGAS促进的CMA降解HIF1α作用可能并非仅限于巨噬细胞。由于cGAS主要存在于在细胞质和细胞核中，9,22,25,39 有可能cGAS调控无论HIF1α的亚细胞位置如何，cGAS均能使其降解。然而，低氧诱导的cGAS低聚化是否是cGAS激活以及HIFα随后与HSC70和LAMP2A结合所必需的，目前仍不清楚。显然，长时间的低氧会诱导更多的cGAS低聚化，这可能会降低其促进HIFα降解的能力。这可能反映了低氧条件下cGAS调控HIF1α的一种负反馈机制。鉴定出在低氧诱导下低聚化能力降低或完全丧失的cGAS突变体（与野生型cGAS相比），可能有助于解决这一问题。此外，cGAS促进HIFα与HSC70和LAMP2A结合的机制仍不明确。由于浓缩的cGAS低聚化会降低其促进HIFα与HSC70和LAMP2A结合的能力，因此cGAS的空间结构和构象变化似乎对促进HIFα与HSC70和LAMP2A的结合至关重要。

PHD/VHL系统对HIFα的氧依赖性降解是缺氧信号通路的重要调控机制。尽管HIF1α/2α蛋白在缺氧条件下的稳定性远高于常氧条件，但为了在不同缺氧条件下发挥不同功能，其稳定性也必须受到精细调控。然而，缺氧条件下HIFα稳定性的调控机制在很大程度上仍不明确。本研究发现，cGAS在缺氧条件下可与HIFα、HSC70以及LAMP2A结合，这会将HIFα招募至溶酶体中进行降解，从而揭示了一种调控缺氧条件下HIFα蛋白稳定性的机制。

CMA是首个被研究的自噬形式，这表明细胞内成分的溶酶体降解具有选择性¹⁹。本研究发现，低氧条件下HIF1α和HIF2α中类KFERQ基序介导了cGAS促进的CMA对HIF1α的降解。用于CMA靶向的类KFERQ基序，其保守性和调控严格程度似乎不及PHD/VHL系统等其他系统的靶标。STUB1/CHIP与cGAS在HIF1α上的介导靶标存在差异，且cGAS在HIF1α和HIF2α上的靶标也各不相同。因此，类KFERQ基序的独特性究竟由蛋白质本身、靶蛋白序列还是介导因子的特异性决定，目前仍不明确。

缺氧似乎会同时启动两种反应：一种是依赖HIF的反应，该反应会导致cGAS低聚，有利于HIF1α的稳定性；另一种是不依赖HIF的反应，该反应会导致cGAS从质膜上脱离，对cGAS依赖性HIF1α的降解。这些相反的交流似乎平行于缺氧依赖性抑制稳定HIF的PHD活性，随后增加抑制HIF稳定性的PHD2和PHD3表达有几行证据支持缺氧耐受（或适应）与缺氧信号通路之间的关系。然而，增强或抑制该通路对缺氧耐受的影响仍然存在争议。大多数时候，增强该通路有利于耐受，但有时抑制该途径也会促进耐受性因此，维持低氧信号通路的稳态对于减少动物体内低氧诱导的损伤可能至关重要。本研究中，cGAS 可减弱低氧信号通路；敲除 cGAS 则能提高低氧耐受性。这一发现支持了在特定情况下增强低氧信号通路可提升耐受性的观点。

值得注意的是，低氧可通过低氧反应性微小RNA（miRNA）-25/93抑制cGAS的表达。我们发现cGAS会减弱低氧反应性基因的表达，这表明cGAS与低氧信号通路之间存在潜在的负反馈环路。

有趣的是，有研究报道cGAS可作为微核自噬受体来清除微核⁵⁰。这表明cGAS可能具有除调控先天免疫之外的其他功能。鉴定cGAS在微核自噬或分子伴侣介导的自噬中参与自噬的其他靶标，或有助于我们全面理解cGAS的功能。此外，在缺氧条件下，cGAS敲低细胞中的HIF1α蛋白水平仍能动态变化。这说明除cGAS外的其他因子可能调控HIF1α的稳定性。鉴定这些因子，可为缺氧条件下缺氧信号通路的精准调控提供新的见解。

另一方面，低氧信号对cGAS-STING信号通路的影响已被发现。低氧可通过诱导RNASEH2A抑制cGAS-STING的激活。同样，低氧还能沉默STING，进而导致免疫抑制。相反，通过缺失VHL增强低氧信号则会激活抗病毒DNA感知通路。这些发现表明低氧对cGAS-STING的作用存在争议。此外，这也可能意味着低氧信号与cGAS-STING信号通路之间的串扰机制较为复杂。进一步研究二者的相互作用，将为揭示这两种古老细胞信号通路之间关系的潜在机制提供新的见解。