标题：Neuropilin 1 (NRP1) conveys SEMA3A signals to restrict physiological angiogenesis

期刊：Angiogenesis

原文链接：https://doi.org/10.1007/s10456-026-10033-z

摘要

3类信号蛋白SEMA3A是一种分泌型糖蛋白，作为进化上保守的轴突排斥因子，被认为具有血管相关功能。在小鼠体内，SEMA3A对大脑、肢体或躯干血管的发育模式形成并非必需，但会抑制斑马鱼胚胎躯干的血管分支。尽管神经纤毛蛋白1（NRP1）被认为是小鼠体内SEMA3A的受体，但先前的研究发现，在斑马鱼躯干血管模式形成过程中，Plexin D1才是Sema3a的受体，且关于NRP1对斑马鱼血管模式形成的必要性，此前的基因敲低和基因敲除研究得出了相互矛盾的结果。为解决这些差异，我们优化了先前的基因敲低策略以减少脱靶效应，并构建了同时缺失NRP1a和NRP1b旁系同源基因的斑马鱼胚胎突变体，研究表明NRP1以Sema3a依赖的方式调控躯干血管的模式形成。与此一致的是，我们发现人内皮细胞中NRP1是SEMA3A诱导排斥反应所必需的。此外，我们证实SEMA3A通过NRP1发挥作用并不涉及FLT1的剪接调控，而这一调控机制此前被认为是Plexin D1下游的作用途径。相反，不依赖SEMA3A的持续NRP1激活会增加抗血管生成的可溶性FLT1（sFLT1）的表达，从而形成限制内皮细胞增殖的反馈机制。综上，这些研究结果揭示了NRP1在调控生理性血管形态发生过程中具有双重作用。因此，NRP1如同其在轴突导向中的作用一样，介导内皮细胞中SEMA3A的排斥信号，并通过以不依赖SEMA3A的方式促进sFLT1的释放，进一步抑制血管生成。

关键词 神经纤毛蛋白1 · 类3A信号素 · 血管生成 · 斑马鱼 · 人脐静脉内皮细胞

引言

血管将氧气、营养物质和免疫细胞输送至脊椎动物全身各处，是所有脊椎动物生存的必要前提。在胚胎发育过程中，一种被称为血管生成的过程使血管在器官形成时为其建立血液供应。在健康的成体中，血管生成可在损伤后或疾病期间被重新激活。在这两种情况下，微血管整合了多种促血管生成和抗血管生成信号，这些信号由内皮细胞（ECs）感知，其中促血管生成的血管内皮生长因子VEGFA诱导由内皮顶端细胞引导的血管出芽形成。

跨膜蛋白神经纤毛蛋白1（NRP1）定位于尖端细胞丝状伪足以调节血管生成出芽[3]。包括免疫沉淀在内的多项研究表明，NRP1的模块化胞外结构域既能与血管内皮生长因子A（VEGFA）结合，也能与3类轴突导向信号素SEMA3A相互作用，因此明确NRP1在不同情境下的确切血管生成作用一直颇具挑战。例如，VEGFA与NRP1的结合可促进小鼠出生后视网膜的血管生成，但对小鼠胚胎脑和躯干的血管生成并非必需。相比之下，外源性SEMA3A在鸡尿囊绒膜实验[7]和小鼠肿瘤模型中均表现出抗血管生成活性。尽管有研究报道内皮细胞中SEMA3A的缺失会以自分泌方式损害小鼠出生后视网膜内皮细胞尖端丝状伪足的形成，但这并未引发明显的血管生成缺陷。此外，内源性SEMA3A对小鼠胚胎脑、肢体和躯干的血管生成调控并非必需，且通过NRP1介导的信号素信号缺失也不会影响脑发育过程中的血管生成。不过，也有研究发现Sema3a可抑制斑马鱼胚胎中异位的躯干血管出芽。斑马鱼的NRP1同源物Nrp1a和Nrp1b并未参与这一过程，有研究认为该过程是由Plexin D1（PLXND1）通过上调可溶性VEGFA受体Flt1的亚型（sFlt1，也称为sVegfr1）介导的。与之相反，在小鼠体内，PLXND1作为SEMA3E的受体，可独立于NRP1限制躯干血管的出芽。小鼠与斑马鱼之间的另一项差异在于：有研究报道通过基因组编辑核酸酶构建的nrp1a纯合突变体，其躯干未出现明显的血管缺陷，但其他研究显示，吗啉代介导的nrp1a单基因敲低，或nrp1a与nrp1b双基因敲低，均会减少斑马鱼躯干的血管出芽。

为解决斑马鱼血管生成中 Nrp1 基因需求相关证据相互矛盾的问题，我们对先前基于吗啉代的敲低方法进行了优化和改进，以排除脱靶效应该研究非特异性地干扰了躯干发育，并构建了同时敲除nrp1a和nrp1b基因的斑马鱼双突变体。此外，我们通过对人类内皮细胞进行功能实验，补充了斑马鱼中的遗传互作研究，证实NRP1在血管形态发生过程中传递SEMA3A信号。

结果

Nrp1a和Nrp1b基因敲低会导致斑马鱼胚胎躯干出现异位的节间血管出芽现象

我们及其他研究人员证实，一种部分靶向nrp1b的nrp1a翻译阻断吗啉代寡核苷酸（nrp1a(/b)MO）会中断斑马鱼胚胎躯干中体节间血管（ISVs）的延伸。然而，由于这些研究中使用的吗啉代寡核苷酸剂量存在毒性]，我们试图采用旨在最大限度减少脱靶效应的优化方法，重新研究Nrp1a和Nrp1b的作用。首先，我们构建了nrp1a和nrp1b镶嵌靶向的嵌合斑马鱼胚胎，以避免全胚胎范围的吗啉代寡核苷酸毒性对体节间血管出芽产生非特异性影响。为此，我们在1-4细胞期向Tg(fli1a:EGFP)胚胎注射先前使用剂量的nrp1a(/b)-MO（0.6皮摩尔/胚胎），同时以模拟对照组即标准（Std）-MO处理，随后将这些胚胎的细胞移植到Tg(kdrl):mCherry囊胚期胚胎中。与以往在全胚胎中靶向nrp1a/b的敲除研究不同，嵌合胚胎中nrp1a(/b)敲除的内皮细胞（EGFP+）在受精后36小时（hpf）形成的体节间血管可延伸至躯干背侧，与由宿主内皮细胞（mCherry+）构成的体节间血管相似（图S1）。此外，位于体节间血管内的nrp1a(/b)敲除内皮细胞向体节延伸出异位出芽（图S1），而体节在该发育阶段通常无血管分布，这表明它们对排斥信号失去了敏感性。

接下来，我们通过分别滴定nrp1a(/b)-和nrp1b-MO来优化MO敲低方案，以进行毒性研究。在该研究中，我们评估了受精后2天（dpf）Tg(kdrl:EGFP)胚胎的整体形态，并评估其是否存在宏观解剖缺陷和心脏水肿。分别以0.025 pmol/胚胎及以下、0.9 pmol/胚胎及以下的剂量注射nrp1a(/b)-和nrp1b-MO，未引起明显毒性（图S2a、b）。随后，我们确定了两种MO的非毒性剂量——单独注射时不会改变ISV形态发生的剂量（亚临界剂量），并将它们共同注射到2 dpf Tg(kdrl:EGFP)胚胎中（图1a，所有测试组合见图S2c、d）。我们发现，联合使用0.01 pmol/胚胎的nrp1a(/b)-MO和0.9皮摩尔/胚胎的nrp1b-MO能有效降低Nrp1a和Nrp1b蛋白水平，并高发生率地引发异位跨过体节区域的ISV出芽形成（图1a-c、图S2c、d）。这些异位的ISV沿体节内侧边界在头尾方向与相邻ISV吻合，未穿透体节，从而在躯干和尾部形成桥状结构。综上，Nrp1a和Nrp1b双敲除Nrp1b 基因敲低阻止了血管节段间血管从体节区域发生排斥，这与嵌合胚胎的实验结果一致。

图1 神经纤毛蛋白1（Nrp1）斑马鱼同源物的双重敲低或敲除实验表明，Nrp1a和Nrp1b可阻止体节区域出现异位的节间血管（ISV）出芽。

对Nrp1a和Nrp1b进行基因靶向会导致斑马鱼胚胎躯干出现异位的节间血管出芽现象

在第三种方法中，我们通过结合的方式生成了同时缺失两种 Nrp1 旁系同源基因的双突变斑马鱼胚胎(n r p l a^{s a 1485}) 和(n r p 1 b^{f h 278})突变株，二者分别在Nrp1的a2结构域和a1结构域内携带一个提前终止密码子（图1d）。使用针对Nrp1 C端结构域的特异性抗体进行的蛋白质印迹分析证实，5天龄（dpf）的双突变体中缺乏全长Nrp1a和Nrp1b蛋白（图1e）。从双杂合子互交产生的双突变体，其出现频率略低于预期（图1f），这表明Nrp1a和Nrp1b同时缺失会导致适合度小幅下降。尽管如此，存活的双突变体仍能发育至成年且具有繁殖能力。与吗啉代寡核苷酸（MO）介导的敲低类似，在Tg(kdrl:mCherry)背景下同时缺失Nrp1a和Nrp1b，会在2天龄（dpf）时形成异位的节间血管（ISV）出芽（图1g、h），且外显率为100%（图1i）。

间充质间充体（ISVs）首先于受精后22至36小时通过背主动脉（DA）的初级出芽形成，随后于受精后32至48小时通过后主静脉（PCV）的次级出芽形成。因此，我们探究了异位的ISV出芽是否由初级ISV出芽缺陷引起。在受精后26小时，nrp1a和nrp1b双基因敲低 morphant 及双突变体的初级ISV均如对照组般向躯干背侧延伸；但与对照组不同的是，这些ISV在躯干中部和尾部区域均伸出布满丝状伪足的血管出芽，穿过体节区域（图2a–c、图S3a、b、视频M1、M2）。结合内皮细胞核标记系Tg(fli1a:nEGFP)与Tg(kdrl:mCherry)，我们发现双 morphant 和双突变体的ISV由显著更多的内皮细胞（ECs）组成（图2a–c、图S3a–c）。这一内皮细胞数量的增加在异位出芽向体节区域延伸之前，以及在尚未到达躯干背侧的新生出芽中均已观察到（图2a–c、图S3a–c）。由于在受精后26小时这一单一时间点，有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pHH3）阳性的内皮细胞数量过少，无法进行定量评分（图S3a–c），我们转而通过延时成像分析统计每个ISV中的内皮细胞有丝分裂事件，以此探究内皮细胞增殖情况（图2d、e、视频M3）。与对照组相比，双突变体的内皮细胞有丝分裂事件数量显著增加（图2d、e、视频M4）。尽管这一过程伴随着背主动脉或后主静脉向内皮细胞的招募减少，但至受精后40小时，双突变体的ISV内皮细胞数量仍多于对照组（图2f）。这些结果表明，双 morphant 或双突变体胚胎中穿过体节区域的异位ISV出芽，是由内皮细胞排斥作用的缺失以及每个初级ISV内部内皮细胞增殖增强共同导致的，二者共同为异位ISV出芽提供了细胞来源。

图2 神经纤毛蛋白1（Nrp1）的缺失会导致各节间血管（ISV）内内皮细胞（EC）增殖增加。a–f 对同时携带或不携带nrp1a和nrp1b无义突变的Tg(kdrl:mCherry);Tg(fli1a:nEGFP)斑马鱼胚胎进行躯干血管生成分析。a–c 26小时胚胎发育阶段（hpf）时，通过躯干中部的共聚焦z-stack最大强度投影代表性图像（a）；（b）为每个胚胎躯干中所有完全延伸的节间血管的内皮细胞数量对应定量分析；每个数据点代表单个胚胎的值，(n ≥3)）以及躯干尾部的共聚焦z-stack最大强度投影代表性图像（c）；数字标注各节间血管中不同的内皮细胞核。d 从26小时胚胎发育阶段开始，指定时间点的共聚焦z-stack最大强度投影代表性图像；时间显示格式为小时:分钟:秒。e、f 每个完全延伸的节间血管的有丝分裂事件、源自背主动脉（DA）或后主静脉（PCV）的内皮细胞募集情况定量分析（e）以及内皮细胞数量定量分析（f）；每个数据点代表单个胚胎的值((n=6))。在（a、c、d）中，红色箭头头、星号和箭头分别表示异位节间血管、内皮细胞有丝分裂和内皮细胞募集的示例；比例尺：20微米（a、c），50微米（d）。（b、e、f）中的图表显示平均值±标准差；*、(P<0.05)**、(P<0.01)，采用非配对t检验

斑马鱼胚胎躯干节间血管出芽过程中的Sema3a表达

上述互补的功能丧失策略均表明，Nrp1a和Nrp1b共同缺失导致的ISV扩张与异位出芽，与此前报道的Sema3ab缺失所引起的表型相似。此外，两个Sema3a旁系同源基因sema3aa和sema3ab均在15至24小时胚胎期（hpf）于体节中表达。为进一步探究两个Sema3a旁系同源基因与ISV形态发生的关系，我们在24至48小时胚胎期（此时Nrp1或Sema3ab缺失会引发异位ISV形成）对sema3aa和sema3ab进行了整体原位杂交检测。两个旁系同源基因均在体节的背侧和腹侧半区表达，其中sema3aa的信号分布更为弥散，且在48小时胚胎期几乎无法检测到；而sema3ab的信号在所有检测阶段均呈现体节特异性模式，贯穿体节的整个中外侧延伸范围（图3a-d、图S4a、b）。两个旁系同源基因在腹侧体节的表达量均显著高于背侧体节（图3a-d、图S4a、b）。具体而言，如先前报道，敲低Sema3ab会导致异位ISV出芽（图S4c、d），其表达模式更为明确，且在ISV形态发生的整个窗口期持续存在于体节中。这些表达模式表明，Sema3aa和Sema3ab可提供化学排斥信号，阻止表达Nrp1的ISV跨体节出芽。

神经纤毛蛋白1与信号素3a协同作用，独立于可溶性血管内皮生长因子受体1阻止节间血管异常出芽

为了评估神经纤毛蛋白1（Nrp1）和信号素3a（Sema3a）是否存在遗传相互作用，我们重点研究了Sema3ab旁系同源物，因为它在体节中的表达模式比Sema3aa更强、更持久（图3a-d、图S4a、b）。我们首先确定了sema3ab-MO的亚临界剂量，该剂量不会引起异位间侧静脉（ISV）生成或其他明显的形态缺陷。在野生型胚胎中，单剂量0.6皮摩尔/胚胎的sema3ab-MO会导致异位间侧静脉出芽（图S4c、d），而较低的0.3皮摩尔/胚胎剂量则不会（图S4e、3e、f）。在nrp1a和nrp1b双杂合突变体中，注射0.3皮摩尔/胚胎的亚临界剂量sema3ab-MO反而以75%的外显率引发异位间侧静脉生成（图3e、f），这在未处理的胚胎中（图1h、2d）或标准对照寡核苷酸（Std-MO）注射后均未出现（图3e、f）。同样，将0.3皮摩尔/胚胎的sema3ab-MO与0.01皮摩尔/胚胎的nrp1a(/b)MO和0.1皮摩尔/胚胎的nrp1b-MO亚临界组合共同注射，也会导致显著的异位间侧静脉生成（外显率72%；图S4e、f）。因此，我们的两种互补策略均表明，Nrp1与Sema3a协同作用，以防止斑马鱼胚胎躯干中的血管过度生长。

图3 共聚焦图像中，Nrp1与Sema3a发生遗传相互作用以防止异位节间血管生成；红色箭头头指示异位出芽的实例。a–d 斑马鱼节间血管中Sema3a表达的时间进程分析；卵黄延伸部。f 异位节间血管的定量分析；每个数据点代表单个胚胎的值（((n ≥18))）g–j 躯干血管生成过程中Tg(kdrl:mCherry);Tg(fli1a:nEGFP)斑马鱼胚胎的躯干血管生成分析。a、c 利用sema3aa（a）和sema3ab（c）反义探针进行的整体原位杂交代表性图片；绿色实心箭头头和蓝色轮廓箭头头分别指示Sema3a配体转录本在腹侧和背侧肌节的表达。b、d 肌节腹侧和背侧部分的sema3aa（b，(n ≥15)）和sema3ab（d，(n ≥8)）原位杂交信号定量；每个数据点代表单个胚胎的值。e、f 对nrp1a和nrp1b均携带无义突变的Tg(kdrl:mCherry)斑马鱼胚胎（在1–4细胞期注射指定剂量的对照标准（Std）-MO或sema3ab-MO）进行的躯干血管生成分析。e 2 dpf时胚胎躯干共聚焦z堆栈的最大强度投影；显示异位节间血管表型的胚胎频率以红色标注（(P<0.05) ** (P<0.001)：sema3ab-MO注射组，f）或未配对Student t检验（h、j）。g、i 48 hpf时躯干中央（g）和尾部（i）区域的胚胎躯干共聚焦z堆栈最大强度投影。h、j 每个胚胎躯干（h）和尾部（j）区域所有完全延伸的节间血管中内皮细胞数量的定量；每个数据点代表单个胚胎的值（(n=6)）；数字指示每个节间血管中不同的内皮细胞核。比例尺：a、c中为250 µm；e、g、i中为100 µm。b、d、f、h、j中，图表显示平均值±标准差；*，(la+/)；(I b^{+/})：采用双因素方差分析后进行Sidak多重比较检验（b、d）、Kruskal–Wallis检验（f）或未配对Student t检验（h、j）

当向双杂合突变体注射亚临界剂量的sema3ab-MO（0.3皮摩尔）时，我们发现2天龄胚胎躯干中可检测到异位节间血管（ISV）的区域，其内皮细胞（ECs）数量多于注射对照StdMO的双杂合突变体（图3g、h）。然而，在躯干尾部最新形成的ISV芽中，我们未观察到内皮细胞数量存在差异（图3i、j）；而在nrp1a和nrp1b双纯合突变体中，这些区域的内皮细胞数量却有所增加（图2c）。与这一观察结果一致的是，用弗林蛋白酶激活的重组人SEMA3A刺激培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs），在3天内使细胞增殖出现了小幅但显著的下降（图4a）；此外，通过先前验证过的小干扰RNA（siRNA）[30]在HUVECs中沉默NRP1（图4b），在敲低后2天（dpKD）并未影响细胞增殖（图4c），但在敲低后4天，细胞增殖速率持续显著升高（图4d），这与nrp1a和nrp1b双突变体的表型特征相符（图2）。

此前有研究假设，Sema3ab 可通过 Plxnd1 信号传导限制斑马鱼胚胎躯干中的血管出芽[13]，而 Plxnd1 又可通过促进 flt1 基因的可变剪接来表达 VEGFA 捕获蛋白 sFlt1，从而抑制血管扩张[14]。因此，我们检测了 2 天pf（dpf）突变体胚胎，或注射了 nrp1a(/b)-MO（0.01 皮摩尔/胚胎）与 nrp1b-MO（0.9 皮摩尔/胚胎）组合、或注射了可诱导异位节间血管（ISV）的单份 sema3ab-MO（0.6 皮摩尔/胚胎）的胚胎，其躯干中膜结合型（mflt1）和可溶型（sflt1）flt1 可变剪接异构体的转录本水平（图 1a、b，图 S4c、d）。使用抗基因组 DNA 引物的实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分析显示，sema3ab  morphant 中 sflt1 和 mflt1 转录本的水平均未受影响（图 5a、b）。相比之下，nrp1a 和 nrp1b 双突变体中两个 Nrp1 旁系同源基因的缺失导致sflt1 mRNA 在纯合突变体中的水平最低且存在显著差异（图5b），而双杂合突变体则表现出中间表型，其mRNA水平呈下降趋势但差异不显著（图5b）。同时敲低Nrp1旁系同源基因后，Nrp1a和Nrp1b蛋白水平有所降低但未被完全耗尽（图1c），这同样导致sflt1表达呈下降趋势，与双杂合子中每个单基因仅丢失一个等位基因的情况相当（图5b）。在nrp1a;nrp1b morphant和突变体中，mflt1转录本的变化趋势与sflt1相似，不过双突变体中的下降幅度更小且不显著（图5a）。与斑马鱼实验数据一致，敲低NRP1的人脐静脉内皮细胞在敲低后2天，sFLT1（以及mFLT1）的转录本水平也显著降低（图5c、d）；而用弗林蛋白酶激活的重组人SEMA3A刺激人内皮细胞过夜后，sFLT1或mFLT1的mRNA水平并未发生改变（图5e、f）。

结合我们的遗传互作实验（图3、图S4），这些结果支持这样一种模型：Sema3ab与Nrp1相互作用，通过不依赖Flt1调控的机制将ISV从体节区域排斥出去。尽管如此，Nrp1或许能促进sFlt1的表达，以限制内皮细胞的增殖；而已知sFLT1的靶标VEGFA会诱导内皮细胞增殖。

NRP1 介导人类内皮细胞中 SEMA3A 的排斥信号

为探究SEMA3A与NRP1协同调控血管形态发生的细胞及分子机制，我们将表达SEMA3A的人胚肾（HEK）293T细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行共培养（图6a）。当与转染空载体的HEK细胞共培养时，HUVECs形成致密的单层结构（图6b）。相比之下，与表达SEMA3A的HEK细胞共培养后，HUVECs在HEK细胞周围形成无细胞区域，且HUVECs的单细胞面积减小（图6b-d、图S5a、b）。我们使用可穿透细胞膜的核标记物Hoechst 33342，对分别与转染空载体或表达SEMA3A的HEK细胞共培养的、表达绿色荧光蛋白（GFP）的HUVECs的分裂事件进行追踪，结果显示HUVECs或HEK细胞的增殖均未出现任何差异（图S5c、d）。由此可见，在本共培养系统中，SEMA3A诱导的排斥作用独立于增殖变化发生（影片M5、M6）。与体内实验数据一致，敲低HUVECs中的NRP1（图6e）可显著抑制SEMA3A诱导内皮细胞排斥的能力（图6b-d）。这些研究结果表明，NRP1在内皮细胞中以细胞自主性的方式介导SEMA3A的化学排斥信号（图6f）。

图4 神经纤毛蛋白1（NRP1）和类轴突蛋白3A（SEMA3A）调控人内皮细胞（EC）的增殖。a 对经载体处理或500纳克/毫升重组人SEMA3A（rhSEMA3A）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行为期3天的增殖实验定量分析。每个数据点代表一次独立实验的平均值（共(n=3)次独立实验）；配对t检验。b 对用乱序小干扰RNA（siRNA）或靶向NRP1的siRNA敲低2天后（dpKD）的HUVECs中，以RPLP0为参照的NRP1转录本进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）表达分析。每个数据点代表2次独立实验中1次代表性实验的单个孔值（(n=3 wells))；非配对t检验）。c、d 对在敲低后1-2天（c）或2-4天（d）转染乱序siRNA或靶向NRP1的siRNA的HUVECs进行增殖实验定量分析。每个数据点代表2次独立实验（使用2批不同的HUVECs）中1次代表性实验的单个孔值（((n ≥4 wells ))；非配对t检验）。表达水平以平均值±标准差表示；*，(P<0.05) *，(P<0.01) ****，(P<0.0001)

图5 神经纤毛蛋白1（NRP1）和类轴突蛋白3A（SEMA3A）差异调控膜结合型Flt1（mFLT1）和可溶性Flt1（sFLT1）的转录丰度。a、b 对2天受精后（dpf）斑马鱼胚胎中膜结合型Flt1（mflt1，a）和可溶性Flt1（sflt1，b）的转录本进行实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）表达分析，以延伸因子1α样1（eef1a1l1）为内参；这些胚胎的nrpa和nrpb基因均存在无义突变（左图），或在1-4细胞阶段注射标准型吗啉代寡核苷酸（Std-MO）与组合型nrpa(/b)-吗啉代寡核苷酸（0.01皮摩尔/胚胎）（中图），或注射sema3ab2吗啉代寡核苷酸（0.6皮摩尔/胚胎）（右图）。c–f 对转染随机小干扰RNA（scramble siRNA）或靶向NRP1的小干扰RNA的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中膜结合型Flt1（mFLT1，c、e）和可溶性Flt1（sFLT1，d、f）的转录本进行RT-qPCR表达分析，以核糖体蛋白P0（RPLP0）为内参；或对经SEMA3A处理24小时的HUVECs进行上述分析（e、f）；dpf为受精后天数；dpKD为敲低后天数；doTx为处理天数。c、d中每个数据点代表来自一个独立实验的单个孔的数值，该实验使用两批不同的HUVECs（独立实验数）；采用非配对Student t检验。e、f中每个数据点代表一个独立实验中20个胚胎混合样本的数值（独立实验数）；采用配对Student t检验。表达水平以均值±标准差表示；*、***分别表示差异具有统计学意义（左图采用单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验；中图和右图采用配对Student t检验）。c–f 对转录本的RT-qPCR表达分析

讨论

我们的研究结果表明，在斑马鱼躯干血管形成过程中，Nrp1 的主要作用是介导信号以限制侧方血管出芽（见图6f的工作模型）。这些发现基于以下观察结果：双重敲低或敲除斑马鱼Nrp1直系同源基因会导致节段区域的节间血管排斥反应缺失（图1），进而引发节间血管过度生长（图2）。这一发现与以往在斑马鱼中采用敲低或敲除技术开展的研究结果相悖。具体而言，以往研究通过吗啉代寡核苷酸介导的敲低技术分别抑制Nrp1a同时针对Nrp1a和Nrp1b的研究均报道了背侧幼虫躯干的节间血管（ISV）延伸存在缺陷。我们此前发现，以往研究中用于同时靶向nrp1a和nrp1b的翻译阻断吗啉反义寡核苷酸（MO）最常用剂量会引发整体毒性，阻碍胚胎正常发育[22]，因此本研究对Nrp1敲低方法进行了优化，以避免脱靶效应：采用嵌合胚胎实现nrp1a和nrp1b的镶嵌式敲低（图S1），并联合使用两种不同吗啉反义寡核苷酸的亚临界剂量（图1、图S2）。在这两种实验条件下，躯干背侧的节间血管延伸均未受影响，而我们观察到节间血管发生异位延伸，跨越了体节区域（图1、图S1、图S2）。迄今为止，斑马鱼中Nrp1的敲除研究仅针对Nrp1a，除了主静脉中内皮细胞（EC）的集体迁移存在轻微受损外，未报道存在血管缺陷。与这些既往研究结果一致，且两个Nrp1旁系同源物均以相似的时空模式在节间血管中表达，我们发现Nrp1a和Nrp1b各自单独存在时，对节间血管的形成均非必需。然而，结合优化的双吗啉反义寡核苷酸敲低策略，双突变体中两个旁系同源基因同时缺失时，节间血管仍能正常向背侧延伸，但会发生体节区域的异位侵入（图1）。转录适应性是近年来发现的一种遗传补偿机制，即相关基因在突变体mRNA降解后被上调表达]。但每个Nrp1旁系同源基因的功能冗余性不太可能由转录适应性导致，因为本研究中使用的nrp1a突变并未使Nrp1b的表达水平升高（图1）[25]。

图6 NRP1是介导内皮细胞中SEMA3A排斥信号所必需的。a-e 采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与仅表达碱性磷酸酶（AP）或表达SEMA3A-AP的人胚肾293T（HEK 293T）细胞共培养的体外排斥实验。a 内皮细胞排斥实验的实验策略示意图。b 共培养的人脐静脉内皮细胞/人胚肾293T细胞共聚焦z-stack最大强度投影代表性图像；比例尺：100 µm。c、d 内皮细胞单层间隙面积（c）和单细胞面积（d）的定量分析；图表显示平均值±标准差；每个数据点代表每次独立实验中3个孔的平均值；共5次独立实验；**，***，采用双因素方差分析后进行图基多重比较检验。e 采用抗NRP1抗体或针对微管蛋白的抗体，对转染乱序小干扰RNA（siRNA）或靶向NRP1的siRNA的人脐静脉内皮细胞裂解物进行的蛋白质印迹法代表性结果。f 拟议的工作模型：体节来源的SEMA3A通过间充质静脉内皮细胞（ISV ECs）上的NRP1，将内皮细胞从体节区域排斥开；同时，NRP1可独立于SEMA3A增加人脐静脉内皮细胞可溶性FMS样酪氨酸激酶1（sFLT1）水平，进而抑制血管内皮生长因子A（VEGFA）诱导内皮细胞增殖（左图）。在受精后48小时（hpf），神经纤毛蛋白1（Nrp1）和SEMA3A功能缺失（LOF）策略均会导致间充质静脉内皮细胞异位穿过体节区域（右图）

目前已报道的Nrp1a缺失相关血管缺陷仅为共同主静脉中Sema3d诱导的内皮细胞集体迁移轻微受损。与Nrp1在躯干节间血管中介导信号蛋白信号传导的额外作用一致，我们观察到，在躯干区域表达信号蛋白3A同源物Sema3aa和Sema3ab的发育阶段，nrp1a和nrp1b双突变体及形态 morphant 均出现异位出芽（图3、图S4）。与NRP1作为SEMA3A受体的作用相符，斑马鱼的遗传互作实验表明，Nrp1a和Nrp1b通过与Sema3ab合作，阻止体节区域出现异位节间血管出芽（图3、图S4）；而Sema3ab这一信号蛋白3A旁系同源物此前被证实参与调控斑马鱼胚胎的血管排斥反应。在使用临界剂量sema3ab-MO、向nrp1a和nrp1b双杂合突变体注射亚临界剂量sema3ab-MO，或联合使用nrp1a(/)b-、nrp1b-和sema3ab-MO亚临界剂量的实验中，观察到的异位节间血管多集中在体节背侧区域（图3、图S4）。这一现象可能是由于在敲低实验中，Sema3ab在该区域的缺失效果最为显著所致。与体节腹侧半相比，这些区域的 sema3ab 转录本丰度更低（图3、补充图4）。

与在小鼠大脑和视网膜中观察到的主要促血管生成效应[3, 5, 22, 30, 33, 34]不同，我们发现神经纤毛蛋白1（Nrp1）在斑马鱼躯干血管形成过程中的主要作用是介导SEMA3A信号，从而限制血管出芽（图1、图3）。有趣的是，这一发现与小鼠胚胎中的研究结果不同，在小鼠胚胎中，SEMA3A对躯干血管模式形成并非必需。这种差异可能是由于小鼠胚胎体节中SEMA3A的表达比斑马鱼中更局限且更表浅，而斑马鱼中Sema3a的转录本则在体节的中外侧延伸区域均有积累（图S4）。研究还表明，SEMA3A或通过神经纤毛蛋白1（NRP1）进行的信号传导对小鼠胚胎后脑的血管形成也并非必需，与斑马鱼躯干中SEMA3A同源物强烈且高度定型的表达模式（图3、图S4）相比，小鼠后脑中SEMA3A的表达水平较低[36]。重要的是，为了佐证我们在斑马鱼中的研究结果，我们发现SEMA3A可通过NRP1排斥人内皮细胞（ECs）（图6），这与之前的一项研究结果一致，该研究表明SEMA3A以NRP1依赖的方式减少了内皮细胞向细胞外基质信号的迁移]。此外，我们的人共培养实验显示，内皮细胞中特异性表达的NRP1介导了SEMA3A的排斥信号（图6）。此前有假设认为，NRP1在内皮细胞自主负调控血管生成的这一作用，在病理状态下可部分通过SEMA3A对表达NRP1的单核细胞募集的影响来补充[38]。

此前有研究报道，SEMA3A 可在小鼠肾脏发育过程中[39]以及在体外培养的人内皮细胞中[40-42]抑制内皮细胞的增殖。与此一致，人脐静脉内皮细胞暴露于 SEMA3A 后内皮细胞增殖能力下降（图4）；而敲低 Sema3ab 并联合 Nrp1 敲低（图3），则会导致节间血管出现更多的内皮细胞，且这种现象仅出现在发生异位出芽的躯干区域（图3）。这些观察结果表明，因 Nrp1 介导的 Sema3a 排斥作用缺失而诱导产生的异位出芽，同样与内皮细胞增殖的增加相关，以此为不受限制的血管出芽延伸提供支持。值得注意的是，在 Nrp1 双突变体或吗啉代寡核苷酸敲低的斑马鱼胚胎中，Nrp1 的缺失会导致所有节间血管的内皮细胞增殖普遍增加，包括那些尚未出现异常模式和过度生长的节间血管（图2、图S3）。我们在体内的观察结果在体外 NRP1 沉默的内皮细胞中得到了验证，但这一结果仅在 NRP1 敲低4天后才出现（图4），这表明 NRP1 对细胞增殖的抑制作用发生在 NRP1 持续激活之后。进一步的研究或许能阐明 Nrp1 双突变体或吗啉代敲低的斑马鱼胚胎中内皮细胞增殖增加的机制。这也可能伴随着促血管生成生长因子（如血管内皮生长因子A）水平的升高。

此前有研究表明，Sema3a 可通过结合 Plxnd1 促进斑马鱼中节间血管的排斥反应，进而诱导 sFlt1 的上调[14]。然而，我们发现，在斑马鱼胚胎中敲除 Sema3ab 功能，或向培养的人内皮细胞添加 SEMA3A，均未改变 sFlt1 的 mRNA 转录水平（图 5）。因此，我们的研究结果表明，SEMA3A 可能与不同于 PLXND1 的丛蛋白家族成员形成复合物。例如，已有研究证实 PLXNA1 介导 SEMA3A 对人内皮细胞向细胞外基质迁移的抑制作用[37]，且 SEMA3A 可在淋巴内皮细胞中通过信号传导参与淋巴瓣膜的形态发生。此外，我们近期的研究还发现，PLXNA2 是人和小鼠内皮细胞中表达丰度最高的 A 类丛蛋白。尽管 PLXND1 的激活仍有可能调控 sFLT1 的表达，但我们的研究数据与“敲除 Flt1 的斑马鱼胚胎中节间血管初级（及次级）出芽无异常”的研究结果一致，这进一步支持了 SEMA3A-NRP1 相互作用诱导的内皮细胞排斥反应独立于 sFLT1 的释放这一结论。

与Sema3a敲低以及用SEMA3A处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的情况相反，斑马鱼胚胎中两个Nrp1旁系同源基因的缺失以及人脐静脉内皮细胞中NRP1的沉默实验表明，NRP1是促进抗血管生成的VEGFA诱饵受体sFLT1表达所必需的（图5），这与近期一项研究结果一致，该研究显示用NRP1特异性抑制剂EG00229处理后，人脐静脉内皮细胞中的sFLT1水平降低。有趣的是，已有研究证实，小鼠全身VEGFA过表达以及用VEGFA处理人脐静脉内皮细胞后，sFLT1的mRNA和蛋白水平均会升高，而sFLT1水平升高会导致内皮细胞增殖减少]。因此，我们关于NRP1持续激活会导致内皮细胞中sFLT1上调并使其增殖减少的数据，与内皮细胞自主的负反馈机制（用于限制VEGFA的促血管生成作用）相符。VEGF触发sFLT1的产生，而sFLT1又会结合并中和VEGF，这种VEGFA-sFLT1负反馈环路此前已在先兆子痫研究中得到证实，且被认为是导致妊娠并发症的原因之一。综上，我们的研究结果表明，NRP1可能在这一具有临床意义的过程中发挥了此前未被发现的关键作用。

除了3类信号素外，NRP1的模块化胞外结构域还能与VEGFA等其他配体相互作用，斑马鱼中Vegfa信号传导对于促进肠下静脉（ISVs）的出芽和伸长至关重要。然而，在我们优化的敲低和敲除策略中，Nrpl缺失并未减少肠下静脉向躯干背侧的伸长（图1）。尽管不同研究表明NRP1是血管的正向调控因子尽管 Nrp1 在斑马鱼 Vegfa 信号传导中的作用有限，但这与小鼠胚胎中的先前观察结果一致——即缺乏与 NRP1 结合的 VEGFA 的突变体不会出现明显的血管缺陷，而 Nrp1 参与小鼠的形态发生过程。

总之，我们的研究结果阐明了Nrp1在斑马鱼血管生成中基因需求方面此前存在的相互矛盾的报告，证明了在体内生理性血管形态发生过程中，NRP1在介导内皮细胞对内源性SEMA3A排斥信号的响应中发挥关键作用，这一功能在人类中也同样保守存在。此外，我们发现NRP1还可通过生长因子介导的负反馈环路释放sFLT1，进一步抑制血管生成，这一全新机制对先兆子痫的病理生理学研究具有潜在的临床意义。