标题：Photoswitchable COX-2-Selective Inhibitors as Light-Regulated AntiInflammatory Agents

期刊：JACS

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c03529

摘要

尽管非甾体抗炎药（NSAIDs）应用广泛，但其治疗潜力仍受不良副作用的显著限制。这一局限性主要源于选择性不足，因为目前的非甾体抗炎药不仅会抑制炎症部位的诱导型环氧合酶-2（COX-2）亚型，还会抑制健康组织中的组成型环氧合酶-2，且常常同时抑制环氧合酶-1。为解决这一问题，我们研发了可光开关的非甾体抗炎药，该药物兼具COX-2选择性与光控活性，可实现治疗效应对炎症部位的时空精准调控。研究人员通过计算设计与筛选塞来昔布（应用最广泛的COX-2选择性非甾体抗炎药）的偶氮芳香衍生物文库，合成了三种可光开关类似物，这些类似物展现出可逆且高效的反式-顺式光转化特性。体外实验证实，这些化合物可实现光控且选择性的COX-2抑制；从初始暗适应的反式异构体光异构化为顺式构象后，其在巨噬细胞实验中的效价最高提升至5倍。最优候选药物在急性炎症斑马鱼模型中展现出体内疗效，光诱导的顺式异构体给药可减少伤口部位的白细胞募集。这些研究结果表明，可光开关的非甾体抗炎药有望成为治疗炎症及相关疾病（包括癌症）的传统药物替代方案。

引言

炎症是人体的一种基本保护机制，由免疫系统启动以清除病原体，恢复体内平衡并修复受损组织。然而，无法激活消退通路会使炎症反应持续存在，最终导致慢性炎症——一种会引发多种有害影响的长期免疫反应。事实上，慢性炎症状态被认为是全球死亡率的主要诱因，与以下疾病相关的死亡病例中，慢性炎症占比超过50%：与炎症相关的病症。因此，抗炎药物已成为现代医学的重要支柱。

常用的抗炎药主要作用于炎症的初始（急性）阶段，这一阶段由关键促炎酶触发，这些酶将花生四烯酸（AA）转化为前列腺素（PG）等脂质介质。在这些酶中，在炎症部位瞬时表达的环氧合酶-2（COX-2）发挥关键作用，因此是广泛使用的非甾体抗炎药（NSAIDs）的主要靶点。然而，非甾体抗炎药的药理选择性有限，常引发严重副作用，并导致免疫抑制。经典非甾体抗炎药（如阿司匹林和布洛芬）还会抑制环氧合酶-1，这是一种在大多数组织中组成性表达的同工型酶，用于调节关键生理过程。例如，胃黏膜保护就依赖于该酶的作用，而非甾体抗炎药对环氧合酶-1的抑制会对其产生不利影响，最终导致大量使用者出现胃溃疡和内出血。

为缓解这些问题，研究人员开发出了被称为昔布类的COX-2选择性非甾体抗炎药，其中包括塞来昔布（CEL）以及罗非考昔。遗憾的是，这些药物同样会抑制组成型组成型COX-2酶虽然含量低于COX-1，但会在健康组织中表达以维持体内平衡，例如在大脑、胸腺、肠道和肾脏中。因此，昔布类药物也可能引发有害的副作用，比如增加中风等心血管事件的发病风险，这类副作用通常与对其的抑制作用失衡有关。组成型的COX-1和COX-2。 因此，一些考昔布类药物，例如罗非昔布，已从市场上撤市。事实上，除阿司匹林外，所有非甾体抗炎药均存在此类心血管副作用，仅服用2周后，个人患心脏病或中风的风险就会增加高达30%。

图1. 本研究中探索的氮杂化策略，用于开发塞来昔布的光可转换类似物（PC1−PC7），旨在在光异构化为顺式形式时选择性抑制环氧合酶-2（COX-2）。

炎症不仅与常见炎症性疾病相关，还被认为是癌症的一个特征标志，为癌症免疫治疗领域的创新治疗策略奠定了基础。在大多数癌细胞中，环氧合酶-2（COX-2）诱导产生的前列腺素（(E_{2}) - ((PGE_{2}))）会促进肿瘤的生长、增殖和转移，进而导致免疫治疗效果不佳。有研究提出，抑制COX-2可抵消(PGE_{2})介导的免疫抑制作用，同时还能提高肿瘤对放疗和化疗的敏感性。然而，非甾体抗炎药（NSAIDs）显著的副作用阻碍了相关药物的研发进程，尽管有流行病学证据表明长期使用非甾体抗炎药（尤其是塞来昔布，CEL）能够降低癌症发病率并延缓疾病进展，但这仍限制了COX-2阻断疗法的治疗潜力。除了这一挑战之外，癌症组织中COX-2的表达水平比正常炎症状态下高出多达100倍，这就需要使用剂量大得多的非甾体抗炎药才能实现有效的癌症治疗，而如此高的剂量会会显著增加毒性，使目前的非甾体抗炎药不再适用于此目的。因此，目前不推荐将塞来昔布用于癌症治疗。

鉴于这些局限性，要充分利用非甾体抗炎药（NSAIDs）的治疗潜力来治疗慢性炎症及癌症等其他疾病，就需要对其抑制活性进行精准的时空调控；也就是说，这类药物需兼具环氧合酶-2（COX-2）选择性，且仅能在炎症位点与瞬时表达的该酶结合，从而最大限度减少在健康组织中的非预期作用。本研究提出通过光药理学这一新兴领域实现这一目标，该领域致力于实现药物活性的光学调控。具备时空精准性。为验证这一概念，我们率先开发了光可切换的塞来昔布衍生物，这类化合物在光照下可在两种具有不同COX-2抑制活性的状态间可逆切换。为此，我们选择塞来昔布（CEL）结构作为设计这类光开关的起点，原因在于其作为抗炎药物的显著疗效。通过结合计算模拟、合成、体外和体内研究方法，我们证实这些化合物能够以光控方式减轻炎症程度，为未来设计副作用更少的新一代抗炎疗法奠定了基础，同时也为其在癌症治疗中的潜在应用开辟了道路。

结果与讨论

光可切换的考昔布的设计灵感来源于(CEL,)的结构，该物质是最常用的环氧合酶-2选择性非甾体抗炎药之一。如图1所示，塞来昔布呈现出弯曲结构，由三种不同的芳香环组成：一个中心为三氟甲基化的吡唑核心，以及两个带有磺酰胺和甲基取代基的侧向苯环单元，这使得该化合物能够选择性抑制环氧合酶-2，而对环氧合酶-1无显著影响。塞来昔布（以及其他考昔布）与环氧合酶-2选择性结合的两个关键特征如图2所示：（1）环氧合酶-1中的异亮氨酸523被环氧合酶-2中更小的缬氨酸523取代，这使得塞来昔布的磺酰胺基团能够进入酶的侧袋；（2）该基团与侧袋中的谷氨酰胺192和精氨酸513残基发生选择性相互作用。图2a清晰地展示了这一点，该图描绘了通过分子动力学（MD）得到的稳定的环氧合酶2-塞来昔布复合物对人类环氧合酶-2（hCOX-2）进行模拟。在该复合物中，吡唑环及其三氟甲基取代基位于hCOX-2催化腔入口处的精氨酸120（Arg120）和酪氨酸355（Tyr355）残基附近，而甲苯基单元占据主口袋的更深区域，靠近并阻断参与酶催化活性的酪氨酸348（Tyr348）、酪氨酸385（Tyr385）和丝氨酸530（Ser530）残基。总体而言，CEL占据了hCOX-2催化腔的大部分空间，从而阻碍花生四烯酸（AA）的结合，进而阻止其后续转化为促炎的前列腺素脂质介质。

图2. (a) CEL 与 (b) 顺式-PC2 结合于人环氧合酶-2（hCOX-2）活性位点的三维示意图。每个复合物结构均源自其对应分子动力学（MD）模拟的最后一帧（见正文）。hCOX-2 结合口袋内的关键残基以棕褐色显示，CEL 和顺式-PC2 以灰色显示。氮原子为蓝色，氧原子为红色，氟原子为绿色，硫原子为黄色。为清晰起见，氢原子未显示。

基于CEL结构，光可切换类似物（即光考昔布，简称PCs）是通过偶氮化设计而成的。偶氮化是光药理学中的一种常见策略，具体是将偶氮芳香光开关引入已知药物的核心结构中。这种修饰使得生成的偶氮类似物在光照下能在反式和顺式异构体之间发生可逆互变，进而引发显著的几何结构变化，从而调节其生物活性。 针对光考昔布（PCs），偶氮化过程遵循两大设计原则：（1）顺式PCs应采用与CEL结构相似的弯曲几何构型，以此实现与环氧合酶-2（COX-2）活性位点的强效结合；（2）反式PCs则应呈现伸长的结构，以避免与COX-2活性位点的氨基酸残基形成有利的相互作用。 因此，PCs对COX-2的抑制活性在其热力学最稳定的反式状态下应处于最低水平，而在光异构化转化为顺式形式后，可按需被激活。

为此，研究人员设计了数种 CEL 类似物（PC1-PC7，图1），并通过计算评估了它们作为顺式选择性 COX-2 抑制剂的结合能力。为此，研究人员首先进行分子对接计算，为 PC1-PC7 的反式和顺式异构体在人 COX-2 催化腔中生成多达 100 种结合模式。基于每种化合物的最高排名对接构象，开展分子动力学（MD）模拟，以评估人 COX-2-PC 复合物的稳定性（图S1−S8），并将其结构与人 COX-2-CEL 复合物的结构进行对比（图2a）。最后，利用分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）计算方法，估算出所有复合物的结合能((Delta G_{binding }))，从而定量衡量所有设计的 PC 化合物在反式和顺式状态下与 COX-2 亲和力的差异（图3及表S1）。

在所有被分析的PC化合物中，PC1与(CEL,)的结构相似性最高，因为它是通过在母体药物的吡唑环和甲苯基之间简单引入一个偶氮基团得到的；因此，它具有一个5苯基偶氮吡唑光可切换核心（图1）。然而，与我们的设计原理相反，该化合物的反式异构体显示出更高的计算结合亲和力h C O X - 2（(Delta G_{binding }^{trans -PC 1}=-1.8 kcal mol^{-1}) 以及 (Delta G_{binding }^{cis-PC1 }=+2.3 kcal mol^{-1}))），其复合物存在于酶的催化腔，其结合模式与塞来昔布的结合模式更为相似（图3和图S1）。酶的催化腔，其结合模式与塞来昔布的结合模式更为相似（图3和图S1）。

为了形成更拉长的反式异构体结构，研究人员将苯偶氮取代基移至吡唑环的4位，从而设计出了PC2（图1）。这一修饰使反式和顺式PC2之间产生了明显的几何差异，其中顺式PC2的结构与CEL的结构及其在hCOX-2空腔内的结合模式高度相似（图2b）。计算结果表明，hCOX-2-顺式PC2复合物具有极高的稳定性((Delta G_{binding }^{cis-PC2 }=-5.3 kcal mol^{-1}))，其结合能不如 CEL ((Delta G_{binding }^{CEL}=-9.3 kcal mol^{-1})) 有利(kcal mol^{-1})），将该化合物定位为一种极具潜力的光考昔布候选物（图S2）。

以PC2作为先导化合物为基础，我们接下来评估了将吡唑环上的三氟甲基取代基替换为氟（PC3）和氢（PC4）等其他基团的效果（图1）。对于PC3，这一结构修饰完全逆转了该体系两种异构体对酶催化腔的结合偏好，更倾向于形成hCOX-2-反式-PC3复合物（((Delta G_{binding }^{trans -PC 3}=-2.0 kcal mol^{-1})、(Delta G_{binding }^{cis-PC3 }=+5.0)、(kcal mol^{-1})）（图3和图S3）。相比之下，PC4在(Delta G_{binding })中表现出理想的调控作用，其顺式异构体与hCOX-2催化腔结合的亲和力最高（((Delta G_{binding }^{trans }=-0.6 kcal mol^{-1})、(Delta G_{binding }^{cis-PC4 }=-3.8)）(kcal mol^{-1})）（图3和图S4）。因此，尽管经计算人环氧合酶-2-顺式PC4复合物的稳定性低于顺式PC2复合物，这可能是由于三氟甲基未提供额外的分子相互作用，但PC4仍被视为(CEL,)的潜在氮杂类似物。

在最后一步中，我们研究了将 PC1-PC4 中的苯基偶氮吡唑光开关替换为更常见的偶氮苯光致变色化合物，这是主要的光光药理学中使用的主要光响应单元。32−34 为此 </response>最后，我们设计了以4-(4'-磺酰胺基)苯基-2-三氟甲基偶氮苯为核心的光环氧化合物PC5至PC7，其设计参考了先导化合物PC2吡唑环的取代模式（图1）。PC5至PC7在偶氮苯核心另一侧引入的给电子对位取代基不同——分别为乙基（PC5）、甲氧基（PC6）和N-甲基氨基（PC7）——我们旨在借此调控所得光环氧化合物的光开关性能。然而，研究发现这些取代基也会对与人类环氧化酶-2（hCOX-2）的相互作用产生显著影响。

对于 PC7，观察到其结合偏好反式异构体（((Delta G_{binding }^{trans }=)(-1.4 kcal mol^{-1}) 和 (Delta G_{binding }^{cis-PC7 }=+4.9 kcal mol^{-1} ))不鼓励将该化合物用作CEL的光开关类似物（图3和图S7）。相反，如预期的那样，PC5和PC6的顺式异构体优先与人环氧化酶-2（hCOX-2）结合（图3和图S5-S6）。尤其值得注意的是PC6的结果，其顺式结合模式与CEL相比发生了改变，三氟甲基和末端苯基在酶腔中的位置也有所不同。尽管如此，PC6的计算结合能值（(Delta G_{binding })）与基于苯基偶氮吡唑的化合物PC4（((Delta G_{binding }^{trans-PC6 }=-3.4 kcal mol^{-1})）以及(Delta G_{binding }^{cis-PC6 }=-0.3)千卡（(mol^{-1})）相当，这表明基于偶氮苯的光考昔布类化合物有望实现对顺式异构体具有高选择性的人环氧化酶-2抑制作用。

合成与光化学表征

基于开展的计算建模研究，我们将合成研究重点放在制备对人环氧合酶-2（hCOX-2）具有顺式优先结合特性的光致变色化合物PC2、PC4、PC5和PC6上。所有候选化合物中偶氮键的构建均采用芳香胺与新合成的亚硝基芳烃之间的拜尔-米尔斯反应，据报道该反应可同时制备偶氮吡唑类光致变色化合物（PC2和PC4）36以及偶氮苯类光致变色化合物（PC5和PC6）37。

因此，我们尝试通过亚硝基衍生物2与氨基吡唑1a、1b之间的Mills反应，制备PC2（反式-3a）和PC4（反式-3b）的光致变色核心（方案1）。化合物1a和1b此前通过对相应商业吡唑进行硝化及后续还原反应合成得到，而亚硝基中间体2则是通过对对甲苯胺进行氧化反应新鲜制备的，且未经过进一步纯化便直接使用（详见支持信息）。然而，尽管反式-3b的合成取得了令人满意的结果（产率69%），但通过Mills反应并未观察到反式-3a的生成，这可能是由于带有吸电子三氟甲基的胺1a亲核性降低所致。我们尝试制备1a的亚硝基衍生物并使其与对甲苯胺反应，同时探索了构建PC2芳基偶氮吡唑光致变色结构的其他策略，但均未成功。因此，我们放弃了该化合物的合成，转而专注于PC4的制备。为此，我们让反式-3b中间体在N-芳基化Chan-Lam反应条件下38，以二乙酸铜为催化剂，与商业可得的硼酸4发生反应，最终以18%的产率得到候选化合物PC4的反式异构体（方案1）。该低产率归因于反应后去除铜物种所需的繁琐后处理步骤。

偶氮苯候选物PC5和PC6的制备以市售胺5与硼酸4为起始原料，在钯催化下通过Suzuki−Miyaura偶联反应进行，以68%的收率得到胺6（方案1）。将6转化为Mills反应所需的相应亚硝基中间体7，是在有机溶剂混合体系中以间氯过氧苯甲酸（mCPBA）为氧化剂实现的。得到的起始胺与相应亚硝基衍生物的25:75混合物直接与市售胺8a和8b反应，以反式构型得到目标化合物PC5和PC6分别以31%和29%的收率得到目标构型（方案1）。通过高分辨质谱（HRMS）和核磁共振（NMR）波谱法确认了PC4、PC5和PC6合成过程中所有涉及化合物的结构同一性（详见支持信息）。

接下来，我们研究了PC4−PC6在水介质中的光开关特性。根据(^{1} H)核磁共振数据，这三种化合物在黑暗和室温条件下仅以热力学最稳定的反式异构体形式存在。在此状态下，它们在二甲基亚砜-水混合体系中表现出极为相似的吸收光谱，在(lambda_{abs,max } ~ 345-370 ~nm)处识别出一条强(pi-pi^{*})吸收带，同时在(lambda_{abs, max } ~ 410-450 ~nm)处识别出一条弱得多的1 (1-pi^{*})吸收带（图4a、图S9、表S2）。这些光谱特征是无强给电子和/或吸电子取代基的反式偶氮苯35和反式芳基偶氮吡唑36,39,40的特征，与在M06−2X/6−31+G(d)水平下对PC4-PC6进行的含时密度泛函理论（TD-DFT）计算结果一致（图S13、表S3）。因此，这些化合物在其(pi-pi^{*})吸收带的紫外激发下必然会发生高效的反式→顺式光异构化反应。实际上，在(lambda_{exc }=365 ~nm)处照射反式PC4-PC6会引发显著的光谱变化，这与顺式异构体的形成相符，即(pi-pi^{*})吸收带强度降低并发生蓝移，同时(n- pi^{*})吸收带强度增加（图4a）。通过结合(^{1} H)核磁共振和紫外光谱技术，我们评估了紫外诱导反式→顺式光异构化的效率如前文所述，对芳基偶氮吡唑测定了光稳态下更大的光转化效率（((PSS_{f-c}))）以及光异构化量子产率（((Phi_{t-c}))）PC4（反式:顺式比例为10:90，编号(Phi_{t-c}=0.22)）的光致变色特性，相较于偶氮苯类化合物PC5（反式:顺式比例为27:73，编号(Phi_{t-c}=0.09)）和PC6（反式:顺式比例为34:66，编号(Phi_{t-c}=0.13)）。

图 5.(a) 使用 Abcam 荧光法 COX 检测试剂盒测定的 COX-1 和 (b) COX-2 抑制率。柱状图显示了黑暗（反式）条件下以及先前经 365 纳米照射以生成相应顺式富集的 (PSS _{t-c}) 混合物后的抑制百分比。

这些化合物的顺式异构体随后经可见光（波长为5865ce2-a560-439d-9c7c-34ab44d08ac3或445纳米）照射，发生了顺式→反式的异构化反应反向光异构化，且具有相当高的量子产率（((Phi_{c-t})(=0.11-0.33)），最终形成反式异构体含量约70%至80%的平衡混合物（PC4、PC5和PC6的反式:顺式比例分别为70:30、79:21和71:29）（表S2）。因此，通过依次进行紫外光和可见光照射，PC4-PC6可在反式和顺式状态之间实现可逆光开关，且连续循环过程中未出现明显的光降解迹象（图4b、图S11）。此外，尽管室温下动力学速率极慢，但这些化合物可通过黑暗中的反向异构化实现热致完全转化回初始反式状态（(t_{1 / 2}=37)、17小时和10小时，图S12）。因此，在PC4-PC6经紫外光照射后的混合物中，高含量的顺式异构体可保持数小时，这一特性被应用于后续的生物实验中。

在这些实验中，偶氮基光致变色化合物可能会受到谷胱甘肽等细胞内还原剂的影响，从而改变其光诱导的生物学反应。 为此出于这一原因，我们评估了 PC4-PC6 在还原性水溶液条件下（(DMSO: H_{2} O) 混合物中含 10 mM 谷胱甘肽和 5 mM 三(2-羧乙基)膦）的稳定性，分别测试了其初始反式异构体以及在 (lambda_{exc }) 波长 (=365 ~nm) = 365 nm 下生成的 (PSS _{t-c}) 状态。孵育 24 小时后，通过 (^{1} H) 核磁共振波谱和紫外-可见吸收光谱未观察到显著变化，表明其对生物还原具有高耐受性（图 S14）。

体外酶抑制实验

为评估所合成光化昔布的生物活性及亚型选择性，我们在避光和紫外线照射（365 纳米）的受控条件下，使用荧光法 Abcam COX-1 和 COX-2 筛选试剂盒，评估了它们对两种 COX 亚型的抑制活性；即分别针对其反式异构体和富顺式异构体的(PSS _{t-c})混合物进行检测。在单一且相对较高的浓度（45微摩尔）下对抑制作用进行定量分析，该浓度为检测条件下的最高可溶性浓度。这种筛选策略确保了对靶点结合的可靠检测并最大限度减少假阴性结果，提供了快速且可靠的功能性检测结果，足以对化合物进行优先级排序，以便后续在生理相关浓度下开展细胞和体内研究。

将参考抑制剂SC-560（COX-1）和CEL（COX-2）与PC4至PC6进行对比，这两种参考抑制剂作为效力和亚型选择性的基准。正如预期的那样，参考抑制剂重现了其特征性活性谱，验证了实验测定的有效性，并为解释光考昔布的结果建立了有意义的活性标尺。在全部数据集中，无论处于光照状态还是暗态，PC4至PC6对COX-1的抑制作用均极微弱（PC5除外），这证实了它们对该组成型亚型的亲和力较弱（图5）。三种抑制剂对COX-2则表现出不同的活性：经反式-顺式光异构化后，其活性均有所提升，这与我们的计算模拟结果一致。PC4在光照下活性有适度增强，从暗态下的可忽略活性提升至365纳米光照下约9%的抑制率。相比之下，PC5和PC6在光照诱导下对COX-2的抑制活性提升更为显著，光异构化后活性翻倍以上：PC5从约12%升至约27%，PC6从约2%升至约19%。这些响应是该系列化合物中最强的光控效应，表明PC5和PC6的顺式异构体采用了与COX-2结合更匹配的空间构象。相比之下，正如预期的那样，三种光考昔布的反式异构体均为弱抑制剂，其分子构象呈伸长型，空间上与COX-2的结合位点不匹配。

总体而言，这些结果证实，在考昔类药物骨架中嵌入光开关基团，可实现对COX-2的可逆光诱导抑制，同时几乎不影响COX-1。具体而言，PC5、PC6以及在较小程度上的PC4，满足了光药理学抗炎药物的两项核心设计标准：暗适应反式状态下的低基础活性，可最大程度减少脱靶相互作用；以及光照下的高效激活能力，实现了对COX-2阻断的时空精准调控。在体外明确了其光控抑制特性后，我们接下来旨在探究该特性是否能转化为更复杂的生物环境中发挥作用。因此，我们在巨噬细胞中评估了光塞来昔布的细胞活性，并利用斑马鱼模型检测了其在体内调节炎症的能力；这两种互补模型可在生理相关条件下，同时测试其效力以及光依赖的功能效果。

图6. (a) 反式-PC4−PC6（深色柱）或其顺式异构体预处理的J774细胞中，对COX-1介导的(PGE_{2})生成的抑制作用，数值表示为平均值±标准误（SEM）。数据通过单因素方差分析结合Bonferroni法进行分析。未用花生四烯酸（AA）或PC样品处理的细胞分别标记为C和0，代表统计学显著性。(b-d) J774细胞与(b) PC4、(c) PC5和(d) PC6（0.1−10 μM）的反式异构体（深色柱）或顺式异构体富集的(PSS _{t-c})混合物（365 nm）孵育后，用脂多糖（LPS，((10 mu g mL^{-1}))）刺激24小时，对COX-2介导的e43a1bde-8a02-493e-b5d2-1e852ad6cb6生成的抑制作用。未用LPS或PC样品处理的对照实验分别标记为C和0。在所有实验中，收集上清液通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测(PGE_{2})的水平。细胞先用顺式异构体富集的(PSS _{t-c})混合物（365 nm，10 μM）处理15分钟，再与花生四烯酸（AA，15 μM）孵育30分钟。对照实验结果标注如下：°°° (p<0.001) 代表与未刺激细胞（C）相比有显著性差异；(^{*} p<0.05)、(* * p<0.01)和(* * * p<0.001) 代表与单独用LPS处理的细胞相比有显著性差异

光调控活化小鼠巨噬细胞中 (PGE _{2}) 的产生

巨噬细胞介导的PG生成，尤其是(PGE_{2})的生成，使这些细胞成为研究生理相关（COX-1）和炎症（COX-2）条件下COX通路调控机制的理想平台。J774小鼠巨噬细胞培养是一种成熟的体外检测方法，选择性非甾体抗炎药对COX-1和COX-2同工型的作用。本文中，我们采用该方法检测了PC4-PC6的两种异构体对COX-1和COX-2的抑制作用。实验中使用的光考昔布浓度为0.1、1和10微摩尔，因为细胞活力研究显示，所有化合物的最高测试浓度（50微摩尔）对细胞具有毒性（数据未显示）。

在静息状态下，J774巨噬细胞仅表达COX-1酶。为评估这些化合物对COX-1活性的影响，J774巨噬细胞先用反式PC4-PC6或其顺式富集的(PSS _{f-c})混合物预孵育15分钟，随后用花生四烯酸（15 μM）刺激30分钟；上述混合物是此前经365纳米（10 μM）照射获得的。吲哚美辛用作参比化合物（10 μM）。与未受刺激的对照细胞相比，用15 μM的花生四烯酸刺激J774巨噬细胞30分钟，会使(PGE_{2})的水平显著升高。这三种反式PC类似物，以及它们的 (PSS _{t-c}) 混合物均未显示出任何可检测到的影响在(PGE_{2})位点由COX-1产生的相关物质。实际上，经所有PC样品预处理的细胞上清液中(PGE_{2})的水平与对照细胞中观察到的水平相近（图6a）。正如预期的那样，经COX-1抑制剂吲哚美辛预处理的细胞上清液中该物质水平显著降低（抑制率达75%）。这些结果表明，PC4至PC6的反式和顺式异构体均不抑制COX-1，这与酶学研究结果一致，也符合选择性研究的预期。

接下来，为了评估光考昔对 (PGE_{2}) 的影响COX-2 介导的前列腺素 E2 生成方面，在存在或不存在受试化合物的情况下，用脂多糖（LPS，(10 mu g mL^{-1})）刺激 J774 巨噬细胞 24 小时。LPS 处理显著诱导了 (PGE_{2}) 生成量的增加，且这是炎症反应的结果，因此在巨噬细胞中诱导了COX-2的表达。 0.01微摩尔浓度的CEL被用作这些实验中COX-2选择性抑制剂的参照剂实验导致 (PGE_{2}) 下降了 92%

相比之下，抑制 COX-2 介导的 (PGE_{2}) 的能力经检测，暗适应的反式异构体 PC4-PC6 的生成量要小得多，仅在 10 微摩尔浓度的 PC5 以及 1 和 10 微摩尔浓度的 PC6 时具有显著性（图 6b-d）。因此，我们确定对于反式 PC5 和反式 PC4 而言，(IC_{50}^{COX-2}) 需大于 10 微摩尔，而仅反式 PC6 表现出可检测的活性（(IC_{50}^{COX-2}=2.14 mu M)) 以及选择性 COX-2 抑制剂）字符 ((IC_{50}^{COX-1} / IC_{50}^{COX-2}>4.6))（表1）。更重要的是重要的是，我们观察到这些化合物对COX-2的抑制作用具有光依赖性。在所有经365纳米辐照获得的顺式富集异构体中，在所有测试浓度（0.1、1和10微摩尔）下，脂多糖刺激的巨噬细胞中某物质的生成均出现了具有统计学意义的显著抑制（图6b-d）。其中，顺式PC5的效力最低，即便在最高测试浓度下，也未能实现对另一物质生成50%的抑制。相反，顺式PC4和顺式PC6的效力有所提升，这一点得到了相关证据的支持通过将其受辐照的 (PSS _{t-c}) 的 (IC_{50}^{COX-2}) 值显著降低来实现相对于反式异构体的混合物比例：对于 PC4 为 (from >10 mu M) 至 2.4 M，对于 PC6 为 2.14 μM 至 0.4 μM。由于这些化合物在 365 nm 波长下未能实现完全的反式→顺式光异构化，因此必须将这些数值视为其反式与顺式状态之间 COX-2 活性调节作用的下限（表1）。尽管如此，这些数据证明了光塞来昔布可作为 COX-2 选择性、光调控的抗炎剂，证实了我们的计算预测：PC4、PC6 的顺式形式，以及程度稍低的 PC5 顺式形式，与它们的反式异构体相比，应能以更高的亲和力结合酶的活性腔。与酶促测定结果一致的是，PC6 取得了最佳效果，其在 365 nm 照射下对 COX-2 的抑制效力是初始反式异构体的 5 倍，且对 COX-1 的体外选择性指数高于 25（表1）。

与酶促测量结果相比，在脂多糖刺激的J774巨噬细胞中，PC6两种状态间存在更显著的抑制性调节作用，这一现象可归因于两类细胞之间存在的本质差异。实验。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬细胞等细胞环境中，环氧合酶-2（COX-2）定位于细胞膜上，可形成寡聚体或功能性复合物，还可能发生翻译后修饰。这些因素会改变酶的构象以及活性位点的可及性，与酶学实验中使用的重组蛋白相比，往往能提高抑制剂的结合效率。此外，COX-2和COX-1的酶学实验主要检测的是酶的过氧化物酶活性，而非整个环氧合酶的催化循环。因此，若顺式-PC6主要干扰环氧合酶反应，或需要COX-2天然的膜结合构象才能发挥全部作用，这类实验可能会低估其抑制效果。同时，顺式-PC6还可能对核因子κB（NF-κB）或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等上游炎症通路产生额外的调节作用，也可能通过胞质磷脂酶A2（cPLA2）的活性影响花生四烯酸（AA）的释放。这些间接机制可显著减少前列腺素的生成，从而放大细胞实验中观察到的功能性抑制作用。

对白细胞迁移抗炎活性的体内评价

为探究光考昔布在体内的抗炎潜力，我们采用了斑马鱼尾鳍损伤模型，这是一种能引发急性炎症的成熟模型反应。尾部截肢后，白细胞聚集炎症发生在伤口部位；因此，具有抗炎活性的化合物可通过其减少免疫细胞向该区域迁移的能力来鉴定。截肢后，将幼虫用二甲基亚砜（溶剂对照）、(CEL,) 或光考昔布的暗适应反式形式处理6小时或其在365 nm照射下得到的<b0>顺式富集混合物</b0>。白细胞通过苏丹黑染色法对募集至伤口部位的细胞进行后续可视化观察。基于体外激活小鼠巨噬细胞实验所得结果，这些实验仅针对最具潜力的化合物PC4和PC6开展。

我们将受伤幼虫的尾部区域与未切割的对照胚胎的尾部区域进行了比较（图7a−b）。由于个体之间和个体内部的炎症反应存在高度变异性，我们根据迁移至伤口区域的白细胞数量相对于未切割对照组的数量，将所有实验组的幼虫分为四类（图7c）。这些类别定义如下：1类，0−9个白细胞；2类，10-18个白细胞；3类，19-27个白细胞；以及(4,>27)类白细胞（图7d-g）。

由于此前从未在斑马鱼中对考昔类化合物进行过测试，我们首先通过评估它们对白细胞向伤口区域迁移的影响，来探究不同浓度的这类化合物的作用。参考以往发表的关于在斑马鱼幼体中施用塞来昔布（CEL）的研究，我们选定了10微摩尔至100微摩尔的剂量范围⁴⁸⁻⁵⁰。如图S15所示，塞来昔布（CEL）和光考昔类化合物（PCs）均表现出剂量依赖性的抗炎效应，被归为3级和4级的幼体数量减少，而被归为1级和2级的幼体数量增加；也就是说，每种化合物都能使向伤口部位募集的白细胞数量呈剂量依赖性下降。不过，不同化合物的药效存在差异，其中顺式富集了编号为(PSS _{t-c})的PC6混合物，该混合物在100微摩尔浓度下效果最强。为了实现不同化合物间的对比，我们选取50微摩尔的中间浓度开展后续实验。

在被归为1、2、3类且表现出轻度炎症反应的幼虫中，使用CEL或考昔类药物治疗并未使迁移至伤口区域的白细胞数量发生显著变化（图7h-j）。相比之下，在表现出强烈炎症反应的4类幼虫中，与对照组幼虫相比，所有化合物均显著减少了伤口处的白细胞聚集（图7k）。值得注意的是，PC6的顺式异构体富集型混合物(PSS _{t-c})发挥出最强的抗炎作用，完全抑制了白细胞向伤口的迁移。位点，达到与未切割、非发炎幼虫相当的水平。这些研究结果表明，CEL 和光考昔类化合物均具有体内抗炎活性，其中 PC6 经反式-顺式光异构化后是效果最显著的化合物。因此，与体外实验结果一致，PC6 在体内可作为光调控的非甾体抗炎药，且在最需要抗炎的重度炎症条件下，其疗效表现得更为突出。

图7. (a−b) (a)未切割斑马鱼幼体和(b)尾部受伤后斑马鱼幼体的代表性图像。(c−g) (c)未切割斑马鱼幼体尾部的目标区域，以及(d-g)尾部受伤后斑马鱼幼体的目标区域，分别属于(d) 1类、(e) 2类、(f) 3类和(g) 4类。(h−k) 在365 nm波长下照射后，用50 μM CEL或反式或顺式富集的(PSS _{t-c})混合物形式的PC4-PC6处理后，6小时后迁移至伤口部位的白细胞数量。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示，并分别针对(h) 1类、(i) 2类、(j) 3类和(k) 4类幼体进行展示。图(i−k)中缺失的柱形（即未切割组）、图(k)中PC6 (PSS _{t-c})组柱形缺失，表明不存在对应类别的幼体。采用普通单因素方差分析结合Tukey事后检验法评估统计学显著性((^{*} p<0.05)、(* * p<0.01)、(* * * p<0.001))

结论

本研究首创了光考昔类化合物，这是首款可光控的环氧合酶-2抑制剂，能够实现光调控的抗炎反应。研究人员将偶氮芳香光异构化单元引入塞来昔布的结构中，设计并通过计算评估了一系列光控衍生物库。对其中数种化合物的模拟预测显示，其具备理想的光药理学特性——光诱导顺式构象下，相较于初始暗适应的反式异构体，对环氧合酶-2催化位点的亲和力显著提升。 三种光考昔候选化合物（PC4-PC6）已成功合成并完成光化学表征，在紫外光和可见光照射下可发生高效、可逆的反式-顺式光异构化反应。溶液中酶学检测及鼠源巨噬细胞体外实验证实，PC4-PC6保留了塞来昔布的核心药理特征：对组成型环氧合酶-1的抑制作用微乎其微，且对诱导型环氧合酶-2活性具有强效且浓度依赖性的抑制效果。 值得注意的是，这些化合物对环氧合酶-2的抑制反应具有光依赖性；在酶学实验和巨噬细胞实验中，PC6经反式-顺式光异构化后，效力分别最高提升9倍和5倍。在斑马鱼急性炎症模型中开展的体内实验进一步验证了其理想的光调控非甾体抗炎药特性——以光诱导顺式构象给药时，PC6可显著减少伤口周围的白细胞募集。 总体而言，本研究结果凸显了光药理学在开发下一代抗炎治疗药物方面的潜力，这类新型药物有望最大程度降低现有非甾体抗炎药的不良反应。

然而，光可转换考昔类似物的最终治疗应用还需要进一步优化，其中有两个关键挑战亟待解决。首先，其作用光谱需向近红外I区窗口（650纳米至900纳米）发生红移，以实现更高的组织穿透深度并降低光毒性。为此，可将PC4、PC5和PC6的光转换单元替换为其他光激发能量更低的偶氮衍生物（例如邻位取代偶氮苯、推-拉型偶氮苯、铵离子或(BF_{2})配位偶氮）基团）。其次，抑制活性的提升幅度更大经过反式→顺式光异构化对于实现高治疗疗效而言是必要的。因此，必须对考昔布氮类似物的结构进行迭代式分子设计改造，我们目前正借助基于机器学习的计算方法开展这一研究。（分子对接、分子动力学模拟、MMPBSA 结合能以及 TD-DFT 计算）、光考昔布 PC1PC6 的合成与光谱表征数据（核磁共振、红外光谱和高分辨质谱）、光化学表征数据，以及其生化、细胞生物学和体内实验结果。