标题：Integrated multi-omics maps how processed black ginseng modulates gut homeostasis through rare ginsenosides

期刊：npj Science of Food

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41538-026-00863-y

摘要

黑参作为一种功能性食品，以其增强的生物活性而为人熟知，然而关于其特定生物活性成分如何调控宿主生理的系统层面理解仍有待阐明。本研究采用整合的多组学方法，绘制了加工黑参影响肠道健康的系统性宿主反应图谱。通过在硫酸葡聚糖钠（DSS）诱导的斑马鱼模型中进行生物活性导向筛选，九蒸黑参提取物（BG-9）在抑制中性粒细胞浸润和氧化应激方面表现出最佳功效。高效液相色谱（HPLC）的化学分析表明，稀有人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5是BG-9中的主要成分，三者合计占总人参皂苷的56.87%。其中，Rk1在体内表现出最强的保护作用。整合转录组学和代谢组学分析发现，Rk1干预显著逆转了DSS诱导的代谢紊乱，主要通过调节甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸甲硫氨酸代谢通路，以及神经活性配体-受体相互作用来实现。这些研究结果绘制出一幅多组学图谱，明确稀有人参皂苷Rk1是黑参引发系统性生理变化、调节肠道稳态的主要生物活性成分。该研究填补了黑参作为功能性食品的消费与其健康益处之间的认知空白，为其在促进肠道健康方面的应用提供了系统生物学视角。

关键词：黑参；功能性食品；稀有人参皂苷；肠道稳态；多组学；斑马鱼模型

引言

近几十年来，全球对具有基础营养之外健康益处的功能性食品的需求大幅增长。其中，黑参等加工人参产品作为增强免疫力和整体健康的膳食补充剂，已获得广泛青睐健康。黑参是通过将新鲜或白参反复进行蒸制和干燥循环而制成的 </originalContent>蒸制与干燥这一过程会极大改变其化学成分特征⁴。值得注意的是，这种热处理会使常见的人参皂苷（如 Rb1、Rb2）转化为稀有人参皂苷（如 Rk1、Rg3、Rg5），而这些稀有人参皂苷通常与生物活性增强相关⁵。尽管黑人参的普及度和独特的化学组成已得到认可，但从系统层面理解其特定的稀有人参皂苷如何带来具体的健康益处——尤其是在维持肠道稳态方面——在很大程度上仍不完整。弥合食品加工、成分变化与机制性健康结果之间的这一差距，是现代食品科学中的一个核心挑战。

肠道环境的稳态对消化健康和全身健康至关重要，而其失衡是多种肠道疾病的一个关键特征。尽管人参提取物的健康促进特性已有相关记载，但研究主要集中于常见人参皂苷，且往往是在相对有限的生物学背景下展开的。关键的是，黑参加工过程中产生的独特稀有人参皂苷的作用，以及它们在维护肠道健康方面的整合作用机制，尚未通过整体的、系统层面的方法得到充分研究。这种认知上的缺失限制了黑参作为肠道健康靶向功能性食品的价值获得科学依据支撑。

为解决这一问题，需要一种将食品化学与系统生物学相结合的研究范式。高通量体内模型结合多组学技术为绘制膳食生物活性与宿主生理网络之间的复杂相互作用提供了强有力的策略。斑马鱼模型在食品来源化合物的快速筛选以及从整个生物体同时获取转录组和代谢组数据方面具有显著优势。

因此，本研究旨在采用整合多组学方法，系统探究加工黑参的肠道健康作用机制。研究首先通过优化加工周期筛选出生物活性最强的黑参提取物，并建立其化学特征谱。随后，在斑马鱼肠道功能障碍模型中，明确了介导其保护作用的关键稀有人参皂苷。最后，也是最为重要的，本研究整合转录组学和代谢组学技术，阐明了黑参发挥作用的整体机制。主要稀有人参皂苷Rk1可调节肠道稳态。选择这一多组学策略，是因为它能同时评估基因调控网络和表型终产物，全面呈现宿主-化合物相互作用的整体图景，这是单层分析无法实现的。本研究旨在通过多组学方法，绘制加工黑人参摄入与肠道健康益处之间的系统性应答图谱，为其作为靶向功能性食品的开发提供新的科学依据。

结果

黑参加工工艺的优化及关键生物活性成分的鉴定

为评估不同加工周期（1至9）黑参提取物的生物活性，我们首先利用转基因Tg(mpx:GFP)斑马鱼幼虫建立了DSS诱导的肠道炎症模型，该模型可实现中性粒细胞迁移的可视化。在建立肠道炎症模型之前，我们评估了斑马鱼幼虫在96小时内暴露于不同浓度DSS（0.25–5.0微克/毫升）后的存活情况。如图S1所示，1.0微克/毫升DSS在96小时pf时的存活率约为80%，而(≥2.5 mu g / mL)浓度会导致幼虫活力急剧下降((survival <50 % ))。因此，1.0皮克/毫升DSS被选为后续实验中诱导肠道炎症的最佳浓度。

图1. 不同蒸制周期的黑参提取物对葡聚糖硫酸钠诱导的斑马鱼幼虫肠道炎症和氧化应激的影响。(A-C) 斑马鱼幼虫在20、50和100 μg/mL浓度的白参（WG）或黑参（BG-1至BG-9）处理后存活率的评估。(D) 不同处理组斑马鱼幼虫肠道和泄殖腔区域中性粒细胞聚集（绿色）的代表性荧光图像。标尺：100微米。(E) (D)中中性粒细胞数量的定量分析。*模型组与对照组相比，* (^{*} p<0.05)：

此外，一项初步安全性评估确定了人参皂苷提取物的最大无毒浓度。如图1A-C所示，暴露于20微克/毫升以上浓度会导致斑马鱼幼虫出现显著死亡。因此，20微克/毫升被确定为后续所有生物活性评估的最佳安全浓度，评估所用提取物分别来自生白参（WG、BG-0）和炮制黑参样品（BG-1至BG-9）。

随后我们评估了这些提取物抑制葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导中性粒细胞浸润的能力。图1D和E显示，仅九蒸黑参提取物（BG-9）能显著抑制肠道和泄殖腔区域的中性粒细胞聚集。相比之下，加工次数较少的提取物（BG-1至BG-8）未表现出显著的调节作用。BG-9的功效与阳性对照倍氯米松相当，表明其具有强大的保护活性。

鉴于氧化应激与炎症之间已确立的关联，我们进一步通过使用绿色荧光探针（DCFHDA）测定活性氧（ROS）的积累情况，来评估BG9的抗氧化活性（图1F）。该荧光探针通过检测荧光强度和面积¹²，反映出斑马鱼肠道和泄殖腔与炎症状态相关的氧化应激情况。虽然荧光面积未出现显著差异，但在DSS诱导的模型组与对照组之间可观察到，模型组的荧光强度显著升高（图1G-H）。BG-9处理可大幅降低这种升高的荧光强度，其效果与倍氯米松相当，且不改变荧光面积（图1G-H）。这表明BG-9可特异性降低炎症部位的氧化应激水平。

稀有人参皂苷 Rk1、Rg3 和 Rg5 是 BG-9 中的主要化学成分

鉴于BG-9具有优异的生物活性，本研究开展了对比化学分析，以探究反复蒸制过程如何改变人参皂苷的组成。我们在前期研究4,5中已系统地表征了九次蒸制循环中这些稀有人参皂苷的逐步富集过程。与预期一致且与我们先前的研究结果相符，反复蒸制和干燥循环引发了显著的化学转化。热处理促进了常见人参皂苷的水解和脱水，导致其含量降低，并使稀有人参皂苷显著富集。对WG和BG-9进行的高效液相色谱（HPLC）对比分析（图2及表S1）显示，人参皂苷组成发生了实质性变化。具体而言，BG-9中Re、Rg1和Rf等常见人参皂苷的含量相较于WG显著降低。相反，稀有人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5的浓度则明显升高。值得注意的是，WG中人参皂苷Rg3仅占总人参皂苷的1.10%，而在BG-9中，Rk1（16.96%）、Rg3（18.74%）和Rg5（21.17%）的总含量占总人参皂苷的56.87%（表S2）。这种化学成分的显著变化表明，Rk1、Rg3和Rg5是BG-9中的主要人参皂苷，也有力地证明了它们在介导该提取物所观察到的生物活性方面发挥着关键作用。基于这一发现，本研究选取这三种稀有人参皂苷进行进一步研究。

图2. 17种人参皂苷在WG组和BG-9组中的相对表达水平。柱状图展示了WG组和BG-9组中各化合物的平均值。数据以三次独立重复实验的平均值±标准误（SEM）表示。* (^{*} p<0.05)、(** p<0.01)、(***** p<0.001)；ns，无显著差异。若某化合物在任意一组中表达值为零，也相应进行了标注。

稀有人参皂苷 Rk1、Rg3 和 Rg5 具有显著的体内保护作用

在进行生物活性评估之前，我们在斑马鱼幼虫中评估了稀有人参皂苷 Rk1、Rg3 和 Rg5 的安全性。根据图 3A-C 所示结果，我们选择了 0.5、1.0 和 2.0 μg/mL 的浓度用于后续实验，因为这些浓度下斑马鱼幼虫的存活率处于可接受范围。与模型组相比，这三种稀有人参皂苷均能显著且呈剂量依赖性地抑制肠道部位由葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的中性粒细胞聚集（图 3D-F）。其中，测试的最高浓度（2.0 μg/mL）表现出最强的抑制效果。此外，我们通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析了这些人参皂苷对关键炎症反应相关基因表达的影响。结果证实，与 DSS 诱导的模型组相比，Rk1、Rg3 和 Rg5 能显著下调肿瘤坏死因子-α（tnf-α）、白细胞介素-1β（il-1β）、白细胞介素-6（il-6）和白细胞介素-8（il-8）的 mRNA 表达水平（图 3G、H）。随后，我们探究了稀有人参皂苷的抗氧化应激潜力。如图4A所示，我们评估了肠道区域的活性氧（ROS）积累情况。Rk1、Rg3或Rg5处理显著降低了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的荧光面积和强度升高，表明其能有效缓解氧化应激（图4B、C）。为阐明这一效应的分子基础，我们检测了关键抗氧化酶基因的表达水平。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析显示，三种稀有人参皂苷均显著下调了氧化应激响应基因的mRNA水平，包括铜/锌超氧化物歧化酶基因（Cu/Zn-sod）、锰超氧化物歧化酶基因（Mn-sod）、过氧化氢酶基因（cat）、谷胱甘肽过氧化物酶1a基因（gpx1a）和谷胱甘肽过氧化物酶1b基因（gpx1b）（图4D、E），这与观察到的活性氧（ROS）水平降低结果一致。

图3. 人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的斑马鱼幼虫肠道炎症的影响。（A-C）暴露于浓度为0.5至3.0微克/毫升的人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5后，斑马鱼幼虫的存活率评估。（D-F）中性粒细胞计数的定量分析。*模型组与对照组相比，**** (^{6} p<0.0001)；#处理组与模型组相比，(# # p<0.01)、(### >0.001)、### (p<0.0001)；数据以平均值±标准误（SEM）表示；(n=30)标准误；n=30，部分组因幼虫正常死亡出现少量损耗，但未影响分析的统计效力。（G、H）促炎细胞因子的mRNA表达水平。通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）对对照组、DSS诱导模型组和处理组（倍氯米松或人参皂苷Rk1/Rg3/Rg5，浓度为0.5、1.0、2.0微克/毫升）幼虫中的肿瘤坏死因子-α（tnf-α）、白介素-1β（il-1β）、白介素-6（il-6）及(il-8)的表达进行定量分析。*模型组与对照组相比，(* * * * p<0.0001)；#处理组与模型组相比，(#### p<0.0001)；数据以平均值±标准误表示；每个基因的所有检测均进行三次重复实验。

图4. 人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的斑马鱼幼虫肠道氧化应激的影响。(A) 不同组幼虫肠道和泄殖腔活性氧（ROS）聚集的示意图。比例尺：100微米。(B, C) 荧光面积和强度统计结果。*模型组与对照组相比，** (**p <0.001)、(* * * * p<0.0001)：#处理组与模型组相比，# (## p<0.01)、91b10103-423e-468e-b113-7eb9d484450、(#### p<0.0001)；数据以平均值±标准误（SEM）表示；(n=20)，部分组别因幼虫正常死亡出现的少量损耗未影响分析的统计效力。(D, E) 促炎细胞因子的mRNA表达水平。通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对对照组、DSS诱导模型组和处理组（倍氯米松或0.5、1.0、2.0微克/毫升稀有人参皂苷Rk1/Rg3/Rg5）幼虫的铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-sod）、锰超氧化物歧化酶（Mn-sod）、过氧化氢酶（cat）、谷胱甘肽过氧化物酶1a（gpx1a）和谷胱甘肽过氧化物酶1b（gpx1b）表达量进行定量分析。*模型组与对照组相比，**** (p<0.0001)；#处理组与模型组相比，(####p<0.0001)；数据以平均值±标准误（SEM）表示；每个基因的所有检测均进行了三次重复实验。

此外，通过H&E染色对肠道组织进行的组织病理学分析进一步证实了稀有人参皂苷的保护作用。纵切面（图5A）显示，模型组中DSS诱导造成了显著的结构损伤，表现为肠腔扩大以及上皮完整性丧失。Rk1、Rg3或Rg5处理可显著恢复上皮结构，并减少病理性肠腔扩张和褶皱变形。横切面提供了互补的证据，明确表明人参皂苷处理抑制了模型组中观察到的炎症细胞浸润，并减轻了肠腔异常扩大的情况（图5B）。

图5. Rk1、Rg3和Rg5（2.0微克/毫升）对斑马鱼肠道损伤的修复作用。H&E染色的纵向（A）和横向（B）切片结果。比例尺：50微米。

图6. 人参皂苷Rk1核心靶点相互作用的验证。(A) 分子对接可视化展示。Rk1（以棍状模型呈现）在TNF、HSP90AA1、STAT3和CASP3这五种核心靶点蛋白活性位点内的预测结合构象，展示了结合能最低的构象。(B) 靶点基因表达的实验验证。通过RT-PCR检测对照组、DSS诱导模型组、倍他米松组和Rk1处理组（0.5、1.0、2.0 μg/mL）斑马鱼幼鱼中hsp90aa1、stat3和casp3的mRNA表达水平。*模型组vs对照组，*** (* * * * p<0.0001)；#处理组vs模型组，(#### p<0.0001)；数据以平均值±标准误（SEM）表示；每个基因的所有检测均进行三次重复实验。

图7. 整合多组学分析揭示了人参皂苷Rk1在葡聚糖硫酸钠诱导的斑马鱼中的系统性调控图谱。(A、B) 对照组（蓝色）、模型组（橙色）和Rk1处理组（绿色）基因表达谱的正交偏最小二乘判别分析得分图。对照组vs模型组，(R^{2}=0.928)、(Q^{2}=0.819)；模型组vs Rk1组，(R^{2}=0.974)、(Q^{2}=0.212)。(C) 差异表达基因。柱状图展示了模型组vs对照组、Rk1组vs模型组比较中上调和下调差异表达基因的数量。(D、E) 对照组（蓝色）、模型组（橙色）和Rk1处理组（绿色）代谢物谱的正交偏最小二乘判别分析得分图。对照组vs模型组，(R^{2}=0.997)、(Q^{2}=0.510)；模型组vs Rk1组，(R^{2}=0.998)、(Q^{2}=0.683)。(F) 差异富集代谢物。柱状图展示了模型组vs对照组、Rk1组vs模型组比较中上调和下调差异富集代谢物的数量。(G) 14个关键差异表达基因的表达模式。热图展示了其在对照组、模型组和Rk1处理组中的标准化表达水平。(H) 18个关键差异富集代谢物的丰度模式。热图展示了其在三组中的相对丰度。

网络药理学与分子对接技术筛选出Rk1与核心靶点具有最稳定的结合特征

为探究并比较三种稀有人参皂苷的潜在作用靶点及作用机制，本研究开展了网络药理学分析。通过BATMAN-TCM、PharmMapper、SEA和SwissTargetPrediction数据库预测Rk1、Rg3和Rg5的潜在蛋白靶点，分别得到242个、214个和255个独特靶点（表S3）。从GeneCards数据库中检索得到13735个与炎症性肠病（IBD）相关的靶点（表S4）。韦恩图分析显示，Rk1、Rg3和Rg5的皂苷预测靶点与疾病靶点分别存在116个、98个和134个重叠靶点（图S2 A-C），这些重叠靶点将用于后续分析。

利用STRING数据库构建了重叠靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape进行可视化（图S2 D-F）。根据度值对靶点进行排序，每种人参皂苷的前十个关键靶点列于表S5中。TNF、ACTB、HSP90AA1、STAT3和CASP3这五个靶点是三种化合物关键靶点中的共同靶点。

然而，由于β-肌动蛋白（ACTB）是常规的持家基因或参考基因，从生物学角度来看，它不适合作为核心机制靶点。因此，β-肌动蛋白（ACTB）被排除在外。来自后续的分子对接分析和实验验证。其余四个靶点（TNF、HSP90AA1、STAT3 和 CASP3）被用于进行计算机结合预测和RT-PCR验证。

本研究采用AutoDock Vina模拟每种人参皂苷与这四个核心靶点的结合情况，计算得到的结合能汇总于表1。Rk1对这四个靶点均表现出最低（最有利）的结合能，表明其与靶点间的相互作用稳定性最强（图6A）。基于这一优异的计算机模拟结合特征，本研究选取Rk1开展进一步的实验验证与多组学分析。

为了实验评估这些核心靶点在 Rk1 抗炎作用中的相关性，我们在斑马鱼模型中检测了它们的 mRNA 表达水平。值得注意的是，尽管网络药理学预测的是蛋白质水平的相互作用，但 mRNA 表达分析为斑马鱼模型中的功能验证提供了一种经过验证且可行的关联方法，尤其是在特定蛋白质抗体可能有限的情况下。在四个核心靶点中，TNF（一种主要的促炎细胞因子）已在先前的功能实验中得到验证。因此，我们重点验证了其余三个靶点。RT-PCR 结果证实，与 DSS 诱导的模型组相比，Rk1 处理显著下调了 hsp90aa1、stat3 和 casp3 的 mRNA 表达（图 6B），这支持了它们在 Rk1 保护机制中的功能相关性。

整合多组学分析阐明人参皂苷Rk1的代谢调控机制

Rk1 用于后续多组学分析的筛选基于对多方面证据的综合评估。在三种稀有人参皂苷中，Rk1 在所有体内实验中均表现出最一致的剂量依赖性保护作用（图3-5），且呈现出尤为明确的单调剂量-反应关系。分子对接提供了互补的计算支持，预测其与核心靶点的结合能略优（表1）。此外，尽管Rg3和Rg5在肠道炎症方面已得到广泛研究9，但针对Rk1的研究仍较为有限，这为其新机制研究提供了更大潜力。因此，本研究选取Rk1作为代表化合物进行深入的多组学分析。

为解析 Rk1（2.0 微克/毫升）诱导的系统性应答，本研究开展了转录组学与代谢组学整合分析。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型在两组数据集的对照、DSS 模型和 Rk1 处理组间均显示出清晰的分离效果（图 7A-B、D-E）。转录组学分析采用的阈值标准为 ((| log _{2} FoldChange |>0.585) 和 (p<0.05)；代谢组学分析采用的阈值标准为 (VIP >1.0)、(| log _{2} FoldChange |>0.585) 以及 (p<0.05)在代谢组学方面，我们鉴定出了差异表达基因（DEGs）和差异富集代谢物（DEMs）。与对照组相比，DSS 诱导显著改变了 1416 个基因（690 个上调、726 个下调）和 84 种代谢物（50 种上调、34 种下调）的表达（图 7C、F）。Rk1 处理逆转了其中大部分紊乱，调控了 53 个基因（50 个上调、3 个下调）和 265 种代谢物（125 种上调、140 种下调）（图 7C、F）。

为探究这些经 Rk1 调控的基因和代谢物的功能相关性，我们分别对 53 个差异表达基因（DEGs）和 265 个差异代谢物（DEMs）进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。两组组学数据中共有的富集通路汇总于图 S3。值得注意的是，这些共有的通路主要与氨基酸代谢相关（如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；半胱氨酸和甲硫氨酸代谢），这表明 Rk1 至少部分通过恢复代谢稳态发挥其保护作用。

从这些常见通路中，我们提取了对通路富集贡献最大的核心分子。共鉴定出14个关键差异表达基因（DEGs）和18个关键差异代谢物（DEMs）（表S6），并分别在图7G和7H中进行了可视化展示。为进一步筛选出生物学相关性最高的基因靶点，我们基于STRING数据库，利用这14个关键DEGs构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。所得网络如图8A所示，揭示了多个具有高连接性的核心基因，这些基因被视为下游验证的候选节点。其中，三个核心基因（grhprb、plg和tat）是基于其在网络中的核心地位以及与富集代谢通路（包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及神经活性配体-受体相互作用）的功能关联而被选中的。同时，神经活性配体-受体相互作用通路将代谢物白三烯C4与基因plg关联了起来。

为了在功能上验证这些网络预测的核心基因的作用，研究人员通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测了它们的表达水平。结果证实，Rk1处理以剂量依赖性方式显著下调了grhprb、plg和tat的mRNA水平（图8B）。这表明Rk1的作用与纠正DSS诱导的特定氨基酸代谢和神经活性配体-受体相互作用通路的系统性紊乱相关，反映了伴随肠道保护作用的整体生理变化。

图8. 关键代谢物与基因的关联网络及DSS诱导斑马鱼中RT-PCR验证实验结果。(A) 核心相互作用网络。该网络整合了通过联合通路富集分析鉴定的三条关键KEGG通路、一个核心差异表达代谢物（DEM）和三个核心差异表达基因（DEG）。边代表富集通路内的功能关联。(B) 核心基因表达验证。通过RT-PCR定量检测对照组、DSS诱导模型组、倍他米松和Rk1处理组（0.5、1.0、2.0 μg/mL）中grhprb、plg和tat的mRNA水平。*模型组与对照组比较，**** (^{5} p<0.0001)；#处理组与模型组比较，(# # p<0.01)、(#### >0.0001)，P<0.0001；数据以平均值±标准误（SEM）表示；每个基因的所有检测均进行三次重复实验。

讨论

本研究通过整合化学与多组学生物学分析，系统阐明了黑人参作为功能性食品的关键生物活性成分，以及其调节肠道稳态的系统性宿主反应。我们的研究揭示了黑人参的特定加工工艺与其特征成分（稀有皂苷）富集之间的关联，其优异的生物活性，以及基于多组学的全身作用机制，为“食品加工-成分转化-生理功能”这一核心科学范式提供了证据。

本研究表明，黑参的体内活性高度依赖其“九蒸九晒”炮制工艺。化学分析提供了直接证据，证明BG-9中稀有的人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5的含量与人参相比呈数量级增长，成为其绝对的主要成分。这一发现与此前的研究一致，即炮制工艺可促进人参皂苷的转化。更重要的是，我们的活性筛选数据直接将这一独特的化学成分与其功能关联起来，因为只有BG9在斑马鱼模型中表现出显著的保护活性。这清楚地表明，特定的食品加工技术不仅是改变风味的手段，更是定向富集具有特定健康功效的生物活性成分的关键步骤，从而开发出高附加值的功能性食品。

在确定BG-9的基础上，我们进一步将其主要功效归因于稀有人参皂苷Rk1、Rg3和Rg5。这三种单体化合物表现出与BG9粗提物相似的保护作用，且呈剂量依赖性，下调关键促炎细胞因子，并修复肠道组织损伤。这证实它们是黑人参调节肠道作用的主要物质基础。值得注意的是，尽管这三种皂苷结构相似、活性相近，但网络药理学和分子对接预测显示，Rk1可能与核心靶点结合得更稳定。后续的实验验证表明，Rk1能显著下调相关基因的表达，这也为其被选为代表化合物进行深入机制研究提供了依据。

本研究的核心发现是，通过整合转录组学和代谢组学技术，揭示了Rk1影响肠道稳态的系统性反应机制。需要指出的是，这些反应是在全生物水平上被捕捉到的，因此反映的是肠道、免疫和代谢变化的综合效应，而非肠道特异性机制。我们选择以Rk1为研究重点，旨在阐明其在肠道生理学中尚未被充分研究的作用，并借助网络药理学分析得出的其优异预测结合亲和力展开研究。值得注意的是，尽管近期有研究表明Rk1主要通过PI3K/AKT/mTOR通路可缓解大鼠辐射诱导的肠损伤¹⁶，但其在肠道炎症模型中对宿主代谢的影响研究仍未见报道。本研究通过证实Rk1的疗效与特定氨基酸代谢通路的重编程密切相关，填补了这一研究空白——这一维度在以往的Rk1研究中并未被重点提及。这表明，与Rc等其他人参皂苷（其通过PI3K-AKT/NF-κB通路发挥作用¹⁷）类似，Rk1可能具有多效性一种依赖情境的机制，在不同的生理或病理生理情境下会激活不同的主要通路。

我们的分析所聚焦的代谢通路——甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及半胱氨酸-蛋氨酸代谢——并非偶然发现。这些通路与代谢稳态在肠道健康中所起作用的新兴共识高度契合。一项系统生物学研究表明，炎症性肠病患者体内的宿主氨基酸代谢（包括氮稳态及多胺/谷胱甘肽代谢）受到严重破坏。我们关于Rk1可恢复这些通路的研究数据，为其在肠道炎症的全身反应中处于核心地位、且能被Rk1逆转这一结论提供了直接的实验验证。这也表明Rk1不仅是一种抗炎剂，更是一种潜在的代谢调节剂，有助于恢复肠道内的细胞平衡与能量稳态。

神经活性配体-受体相互作用通路的富集为理解人参皂苷Rk1的作用提供了一个系统性视角，其影响范围超出了局部肠道环境。值得注意的是，该通路包含大量G蛋白偶联受体（GPCRs），这类受体在介导神经系统、免疫系统与其他系统之间的信号交流中发挥关键作用[19]。该通路的富集在肠道炎症研究中的意义并非仅具预测性。例如，该类别中的典型受体——嘌呤能受体P2Y14R（一种Gi/o蛋白偶联的G蛋白偶联受体），近期已被证实可通过诱导肠道上皮细胞的程序性坏死直接加重结肠炎。这一例子表明，该通路中特定受体的激活可能是肠道病理改变的直接诱因。因此，本研究中该通路的富集，以及核心代谢物（如白三烯C4）与基因（如纤溶酶原基因plg）的关联，提示人参皂苷Rk1可能通过调控类似的G蛋白偶联受体信号网络，影响肠道内的神经-免疫串扰。

这让我们得以思考其在“肠-脑-免疫轴”这一更大框架中的作用。值得注意的是，尽管本研究主要评估了肠道相关指标，但对完整幼虫进行的非靶向代谢组学分析捕捉到了系统性信号，为这一假设提供了初步依据。具体而言，Rk1 处理显著恢复了左旋多巴（L-Dopa）的水平——多巴胺的直接前体物质，而该物质在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的模型组中出现了表达失调（图7J）。这一发现，结合神经活性配体-受体相互作用通路的富集结果，表明 Rk1 可能对神经-免疫通讯产生系统性影响，而非仅作用于肠道黏膜内部。

此外，针对其他人参皂苷（如 Rh4 和 Rg1）的研究表明，这些化合物可通过调节这一轴来改善抑郁行为或结肠炎。其共同机制包括减轻全身性炎症、调节下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴以及影响肠道菌群代谢物——而肠道菌群代谢物本身也是该轴上的关键信使。因此，我们推测，Rk1 纠正全身性代谢和氧化应激失衡，再加上其对神经活性受体（如 G 蛋白偶联受体，GPCR）通路的潜在调节作用，构成了其全身性稳态调节作用的基础。这一假设与我们组学数据的全生物体特征相符，该数据捕捉到了来自多种组织的信号。这不仅直接维护肠道健康，还可能通过打破肠道炎症、全身性炎症并最终导致神经免疫失调的恶性循环，带来更广泛的健康益处。

本研究存在若干局限性，同时也对应着相应的未来研究方向。首先，由于本研究的转录组学和代谢组学分析是在完整的斑马鱼幼体上开展的，因此观察到的变化反映的是多种组织的综合反应，而非肠道特异性的分子事件。尽管这种全生物个体研究方法能够全面反映机体的生理状态，但未来采用组织特异性转录组学的研究对于解析组织特异性机制具有重要价值。此外，用于对比模型组和Rk1处理组转录组数据的OPLS-DA模型，其(Q^{2})值相对较低（0.212），表明该模型的预测能力有限。这可能是由于Rk1作为一种膳食生物活性物质，其诱导的转录组变化幅度较为温和，仅能部分而非完全逆转病理状态。然而，得分图中观察到的明显分组现象（图7B），结合关键通路基因的RT-PCR验证结果（图8B），证实该模型能够捕捉到真实的生物学变异。

其次，尽管三种稀有人参皂苷（Rk1、Rg3、Rg5）均表现出保护作用，但我们并未探究它们之间潜在的协同相互作用。未来研究可通过设定特定比例的组合实验，以及对Rg3和Rg5进行比较性多组学分析，有助于阐明这些结构相关的化合物在黑人参健康益处的介导过程中是独立发挥作用，还是协同发挥作用。

接下来，我们的多组学分析揭示了与Rk1保护作用相关的三条关键通路，但明确的因果关系——例如氨基酸代谢是否直接调控神经活性配体-受体相互作用——仍有待实验验证。同样，尽管网络药理学和分子对接为潜在的蛋白质靶点提供了可验证的预测，但我们的验证仅局限于mRNA表达水平的变化，无法直接证实物理结合或靶点结合。因此，针对特定通路的抑制剂研究、基因敲低实验、代谢组学通量分析以及蛋白水平检测等研究仍需开展。以明确因果关系及配体与靶点的直接相互作用。

最后，Rk1 恢复左旋多巴水平并富集神经活性配体-受体相互作用通路这一发现，为肠-脑-免疫轴的参与提供了初步的代谢组学线索，但仍缺乏直接证据——如神经行为学参数、脑区特异性神经递质、小胶质细胞激活状态或外周免疫细胞谱等。未来需采用哺乳动物模型并对候选受体进行靶向操作，以明确 Rk1 是否确实调控该轴，还是主要通过局部肠道机制发挥作用。

综上所述，本研究构建了一条从食品加工到健康益处的完整科学路径。研究表明，九蒸九晒工艺通过富集稀有人参皂苷（尤其是Rk1）将黑参转化为功能性食品，而Rk1可诱导机体整体生理变化，进而调节肠道稳态。此外，本研究证实Rk1的作用机制涉及宿主氨基酸代谢与神经活性信号网络的协同调控。因此，本研究不仅验证了一种传统食品加工工艺，还借助多组学技术构建了机制框架，明确了加工食品与宿主生理相互作用的整体应答通路，为基于稀有人参皂苷的肠道健康功能性食品的合理开发提供了理论依据与思路。

方法

人参样品的处理与制备

5年生人参原料由北京中医药大学提供，经长春中医药大学孙萌萌教授鉴定。

根据中国的监管指导方针，5年生人参被推荐为适用于食品和保健食品的原料。由于其在24-26岁时生物活性化合物的最佳积累，它也被广泛应用于植物化学和生物活性研究。此外，5年生人参展现出优异的加工适应性，常被进一步加工成红参或黑参。

按照既定方法4，先将原料在50℃的烘箱中烘干，随后在100℃下蒸制180分钟，接着再次于50℃烘干24小时，得到加工人参。该加工循环重复1至9次，制备出对应循环1至9的黑人参样品（BG1至BG9），而初始烘干的原料则作为白人参（WG，即BG0）。

人参皂苷的提取与化学表征

按照既定方案5，从样品（0-9个制备循环）中提取总人参皂苷。简要来说，将处理后的人参原料研磨成粉末。精确称取约2克粉末，置于50毫升容量瓶中，用50毫升氯仿浸泡过夜。经超声脱脂1小时后，弃去氯仿，将残留物干燥。随后将该物料转移至含50毫升水饱和正丁醇的100毫升锥形瓶中，密封并放置过夜。接着进行30分钟的超声提取（功率250瓦、频率50千赫兹）。将混合物过滤，收集25毫升后续滤液，经氮气吹干后，立即用甲醇复溶至最终浓度40毫克/毫升。将溶液涡旋混匀，通过0.22微米滤膜过滤，随后进行高效液相色谱（HPLC）分析。

为进行化学指纹图谱分析，本研究使用了17种人参单糖皂苷标准品（上海源叶生物科技有限公司），包括Re、Rg1、Rf、Rb1、Rg2、Rh1、Ro、Rc、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rg3、Rk1、Rg5、S-Rh2和R-Rh2。将这些标准品溶解于甲醇中并进行梯度稀释，制备出不同浓度的混合标准溶液。

使用配备安捷伦ZORBAX SBC18色谱柱（5 μm，4.6×250 mm）的安捷伦1260高效液相色谱系统进行分析，色谱柱温度维持在40℃。检测波长设定为203 nm。采用二元梯度洗脱程序，流动相A为乙腈/水/5%乙酸（体积比10:85:5），流动相B为乙腈/水（体积比80:20），流速为1.5 mL/min。梯度洗脱程序如下：0–10 min，0–30% B；10–25 min，30–50% B；25–40 min，50–100% B；40–50 min，保持100% B；50–53 min，恢复至0% B；53–60 min，用0% B重新平衡。进样体积为10 μL。该分析方法经重现性和重复性验证，可对人参皂苷图谱4进行可靠的定量分析。

斑马鱼安全性评估与体内模型测试

本研究所用斑马鱼的饲养与处理均遵循斑马鱼模式生物数据库（zfin.org）的标准以及长春中医药大学地方动物福利委员会的相关规定。所有实验程序均严格遵守该校《实验动物饲养与使用指南》，并经该校动物伦理委员会批准（批准号：2024100）。

我们将斑马鱼幼鱼饲养在28.5摄氏度、光暗周期为14小时比10小时的胚胎培养基中。实验时，我们通过随机数表生成完全随机设计，将健康幼鱼分配至各处理组。为避免观察者偏倚，由不了解分组情况的实验人员完成所有表型评估；样本编码这些内容直到数据采集后才被披露。我们将幼虫浸入0.016%的甲烷磺酸三卡因（经缓冲至pH 7.0的MS-222）中麻醉，直至其失去平衡和自主运动，以便进行成像观察。研究结束时，我们给幼虫注射过量的MS-222（浓度0.1%，处理10分钟）使其安乐死，随后按照下述方法，将其在-80 °C下快速冷冻以用于生化分析，或立即进行处理以提取RNA。

在生物活性评估之前，通过96小时暴露试验测定了硫酸葡聚糖钠（DSS）、人参提取物及人参单体皂苷的最大无毒浓度，并对死亡率和形态进行了评估27。通过将斑马鱼幼鱼浸泡于DSS中建立了肠道炎症实验模型28-30。为监测中性粒细胞迁移，使用了转基因品系Tg(mpx:GFP)，该品系中髓系特异性髓过氧化物酶（mpx）的表达驱动绿色荧光蛋白（GFP）的表达，可实时追踪中性粒细胞的运动。受精后3天（dpf），对幼鱼进行72小时处理：空白对照组给予标准胚胎培养基；模型组给予1.0 μg/mL DSS；阳性对照组给予1.0 μg/mL DSS加25 μM倍氯米松；处理组给予1.0 μg/mL DSS加20 μg/mL黑人参皂苷提取物，或人参单体皂苷Rk1、Rg3、Rg5（浓度为0.5、1.0、2.0 μg/mL）。所有溶液均配制于标准胚胎培养基中，处理液每24小时更换一次。处理72小时后，在体视显微镜下对幼鱼进行观察和成像，对指定肠道区域的中性粒细胞聚集情况进行定量分析。此外，采用AB野生型斑马鱼幼鱼在同一模型中评估活性氧（ROS）的积累。给药72小时后，将幼鱼置于含2.0 μg/ml DCFH-DA荧光探针的标准胚胎培养基中孵育1小时，随后通过显微镜观察和成像评估肠道部位的ROS积累31。尽管存在自然损耗，但每组斑马鱼的数量均得到控制（n≥20）。((n ≥20))

通过H&E染色进行组织病理学分析

采用苏木精-伊红（H&E）染色法评估斑马鱼的肠道组织病理学变化。斑马鱼幼鱼按照先前描述的造模和处理方案进行操作。随后，对幼鱼进行麻醉，置于4%多聚甲醛中固定48小时，再进行脱水处理。接着将样本包埋于石蜡中，在横切面和纵切面两个方向均切成3微米厚度的切片，并用H&E染色。使用配备数码相机的显微镜（中国明美）对染色后的切片进行成像。

通过RT-PCR进行基因表达分析

对于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析，每组30条斑马鱼幼鱼按照先前描述的方法进行处理。使用TRIZOL试剂（美国赛默飞世尔科技公司）从匀浆后的幼虫中分离总RNA，并通过吸光度法（德国BMG LABTECH公司的CLARIOstar仪器）测定其浓度。以2微克RNA为模板，使用逆转录试剂盒（中国天根生化科技有限公司）合成cDNA，随后将其按1:10的比例稀释。采用SYBR Green荧光定量PCR系统（中国天根生化科技有限公司），在CFX96深孔Dx实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）上进行定量RT-PCR反应。以β-肌动蛋白为内参，采用(2- Delta Delta Ct)法计算基因的相对表达量。引物序列见表S7，均参考已发表文献设计。所有实验均进行三次重复。

网络药理学与分子对接分析

按所述方法进行了分析29。从BATMAN-TCM、PharmMapper、相似集合法（SEA）和Swiss TargetPrediction数据库中检索稀有人参皂苷（Rk1、Rg3、Rg5）的潜在靶点。对带有(probability >0)的靶点进行整理和去重。通过在GeneCards数据库中查询相关医学主题词（MeSH）术语，获取炎症性肠病（IBD）的疾病相关靶点。确定稀有人参皂苷与炎症性肠病的交集靶点，用于后续分析。将共同靶点提交至STRING数据库生成蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，随后使用Cytoscape 3.9.1软件对网络进行可视化与分析，计算节点度值。

在分子对接实验中，从 RCSB 蛋白质数据银行（RCSB PDB）获取靶蛋白的三维结构，经编号为 (PyMOL) 的步骤处理（去除水分子和配体），再通过 AutoDock 工具进行加氢和电荷计算。人参皂苷 Rk1、Rg3 和 Rg5 的三维化学结构来源于 ChemSpider 数据库，将其转换为 PDBQT 格式后，利用 AutoDock Vina 软件完成分子对接。设置指定的网格框以覆盖受体的结合位点，最终使用 PyMOL 软件对接合亲和力的结果进行可视化与分析。

RNA测序与转录组分析

为评估Rk1处理对肠道炎症模型的转录组学反应，选取高剂量Rk1组的幼体，以及对照组和模型组进行RNA测序。分析方法遵循既定方案33。处理后，使用TRIzol试剂（美国赛默飞世尔科技公司）从混合样本（每个重复30只幼体，每组(n=3)）中提取总RNA。通过NanoDrop 2000和Bioanalyzer 2100系统（美国安捷伦科技公司）验证RNA的浓度和完整性。按照Illumina的标准方案构建测序文库，包括mRNA片段化、cDNA合成和PCR扩增。在Illumina平台上进行双端测序((2 ×150 bp))。原始测序读段使用 Trimmomatic 进行质量控制处理。基因表达水平以每百万转录本（TPM）进行定量，将 (TPM >1) 设为基因表达的阈值。利用 DESeq2 进行差异表达分析，设定 (| log _{2} FoldChange |>0.585) 和校正后的 (p -value <0.05) 作为阈值。

代谢组学分析

为探究与肠道炎症及Rk1干预相关的代谢变化，本研究对对照组、模型组和Rk1处理组（2.0微克/毫升）的斑马鱼幼虫开展代谢组学分析。每组收集10条完整幼虫混合（n=3个生物学重复），迅速置于液氮中冷冻，随后在400微升甲醇和125微升水中匀浆。加入400微升氯仿和200微升水后，将样品涡旋振荡1分钟、震荡5分钟，并在4摄氏度、12000转/分钟条件下离心10分钟，收集上清液用于后续分析。

代谢物的分离与检测采用安捷伦1290 Infinity超高效液相色谱仪（UPLC）联用安捷伦6540四极杆-飞行时间（Q-TOF）质谱仪（美国安捷伦科技公司）完成。色谱分离在Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm）上进行，柱温40℃，流速0.3 mL/min。流动相由乙腈（A相）和0.2%甲酸水溶液（B相）组成，梯度洗脱程序如下：0~2 min，A相95%~80%；2~5 min，A相80%~40%；5~6 min，A相40%~1%；6~7.5 min，维持A相1%；7.5~7.6 min，A相1%~95%；7.6~10 min，A相95%以实现色谱柱重新平衡。质谱分析采用双电喷雾电离（ESI）源，分别在正、负两种电离模式下采集数据。关键参数设置为：喷雾电压正模式+3500 V/负模式-3200 V；鞘气30 Arb；辅助气5 Arb；离子传输管温度320℃；汽化器温度300℃；流速10 L/min。全扫描质谱（Full MS）以35000的分辨率（质荷比m/z 75~1000）进行采集，自动增益控制（AGC）目标值为1.0×10⁶。对丰度排名前10的前体离子进行数据依赖型二级质谱（dd-MS²）分析，分辨率为17500，碰撞能量分别设置为30、40和50电子伏特（eV）。动态排除时间设定为3秒。

采用自建的MWDB数据库（Metware生物技术有限公司）进行代谢物鉴定，该数据库包含高分辨率的MS/MS质谱图、保留时间和加合物信息。通过将精确质量((<5 ppm))、保留时间和MS/MS碎裂模式与MWDB数据库进行匹配，对代谢物进行注释。对于关键代谢物，对其MS/MS质谱图进行人工验证以确认注释结果。通过混合所有样品提取物的等体积制备混合质量控制（QC）样品，并在整个分析过程中定期进样。通过监测QC样品的总离子流图（TIC）评估代谢物提取和检测的重现性，结果显示不同进样间的保留时间和峰强度保持一致，证实了系统的稳定性数据可靠性。分析过程严格按照既定方案进行。

原始数据被转换为mzXML格式并在XCMS中进行处理。采用MetaboAnalyst 6.0进行包括正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）在内的多变量统计分析。单变量分析中，代谢物满足(| log _{2} FoldChange |>0.585)（相当于1.5倍变化）和(p -value <) 0.05的标准被认为具有统计学显著性。为进一步筛选对组间分离有贡献的代谢物，将从OPLS-DA中获得的投影变量重要性（VIP）评分（VIP > ((VIP>) 1.0）作为补充筛选标准。同时满足两项标准的代谢物被认定为发生显著变化。这种联合策略遵循非靶向代谢组学的常规做法，以平衡统计稳健性与生物学相关性。关键代谢物及其原始p值、倍数变化和VIP评分见表S6。本研究产生的原始代谢组学数据已提交至中国国家生物信息中心，生物项目编号为PRJCA060433，OMIX编号为OMIX015734。