题目：A zebrafish model of foxe3 deficiency demonstrates lens and eye defects with dysregulation of key genes involved in cataract formation in humans

原文链接:https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6481467/

期刊:Human Genetics

摘要

 叉头框E3（FOXE3）基因编码一种带有叉头/螺旋翼结构域的转录因子，该结构域对眼睛晶状体和眼前节的发育至关重要。FOXE3基因中的单等位基因和双等位基因有害序列变异会导致人类出现无晶状体、白内障、硬化性角膜和小眼球症。我们利用成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR/Cas9 系统对斑马鱼中的foxe3转录本进行靶向编辑，以构建该基因功能缺失的实验模型。携带插入缺失变异c.296_300delTGCAG（预测编码p.(Val99Alafs*2)）的纯合子幼鱼表现出严重的眼部缺陷，包括晶状体过小或缺失以及小眼球症。与对照组晶状体相比，纯合子foxe3插入缺失突变体的晶状体与zl-1抗体的结合染色更强烈，这与晶状体纤维细胞分化增强的现象一致。对野生型幼鱼和疑似携带foxe3插入缺失变异纯合子的眼部缺陷幼鱼提取的RNA进行全基因组转录组分析（RNA测序）发现，晶状体和眼中表达的基因出现显著失调，这些基因的同源基因与人类白内障相关，包括cryba2a、cryba1l1、mipa和hsf4。我们还观察到斑马鱼晶状体中表达的lgsn和crygmxl2基因出现上调，而fmodb和cx43.4基因则出现下调；这些基因目前尚未被证实与人类眼部表型相关。本研究表明，这一新的斑马鱼foxe3突变体模型为研究脊椎动物晶状体和眼睛发育过程中保守的基因调控网络提供了重要参考。

关键词:foxe3；无晶状体；白内障；小眼球症；CRISPR/Cas9 与眼部缺陷

引言

叉头框E3（FOXE3）基因（MIM 601094）编码一种含叉头/翼状螺旋结构的DNA结合转录因子，该因子对眼睛晶状体和眼前节的正常发育至关重要（Blixt等人，2000；Brownell等人，2000；Ormestad等人，2002；Shi等人，2006；Medina-Martinez等人，2005）。FOXE3的双等位基因有害序列变异会严重破坏人类晶状体和眼前节的形态发生，影响高达2.5%的眼部缺陷患者（Williamson和FitzPatrick，2014）。缺陷通常为双侧性，主要表现为无晶状体、硬化性角膜和小眼球，同时也可观察到眼前节发育不全、先天性白内障、无虹膜以及视盘缺损等症状（Williamson和FitzPatrick，2014；Semina等人，2001；Gould和John，2002；Valleix等人，2006；Iseri等人，2009；Reis等人，2013；Islam等人，2015；Ullah等人，2016；Chen等人，2017；Saboo等人，2017）。FOXE3突变患者还可能发生青光眼（Semina等人，2001；Gould和John，2002；Islam等人，2015；Nischal等人，2015；Anand等人，印刷中）。FOXE3的杂合性有害变异也可导致眼部缺陷，包括伴胚胎后角膜混浊的眼前节发育不全、先天性白内障、Peters异常、小眼球、小角膜以及虹膜缺损（Williamson和FitzPatrick，2014；Semina等人，2001；Gould和John，2002；Iseri等人，2009；Brémond-Gignac等人，2010；Doucette等人，2011；Reis等人，2013；Islam等人，2015；Anand等人，2018）。因此，对FOXE3的研究与人类眼部缺陷的发病机制密切相关。

Foxe3 基因具有高度保守性，在许多脊椎动物中均有眼部表达（Blixt 等人，2000；Brownell 等人，2000；Blixt 等人，2007；Medina-Martinez 和 Jamrich，2007；Anand 等人，2018）。在小鼠体内，Foxe3 基因的表达起始与胚胎第9.0至9.5天（E9.0-E9.5）晶状体的诱导及晶状体板的形成同步（Blixt 等人，2000；Brownell 等人，2000；Medina-Martinez 和 Jamrich，2007）。该基因的表达在晶状体泡阶段持续至胚胎第12.5天（E12.5），此时 Foxe3 活性仍存在于晶状体前上皮的增殖未分化细胞中，但从晶状体的分化纤维细胞中消失（Brownell 等人，2000；Medina-Martinez 和 Jamrich，2007）。晶状体发育异常（dyl）小鼠的 Foxe3 基因 DNA 结合结构域存在两个自发错义突变（p.Phe93Leu 和 p.Phe98Ser），这会削弱 Foxe3 与 DNA 结合的能力并导致其功能丧失（Ormestad 等人，2002）。dyl 等位基因纯合子小鼠的晶状体体积更小，会出现白内障，晶状体泡无法闭合，且晶状体前上皮不能与角膜分离（Brownell 等人，2000；Medina-Martinez 和 Jamrich，2007）。与胚胎第14.5天（E14.5）的野生型小鼠晶状体相比，dyl 突变体小鼠晶状体的细胞凋亡水平更高，这表明 dyl 突变体小鼠的晶状体上皮细胞会通过细胞凋亡被清除（Blixt 等人，2000）。在另一项小鼠模型研究中，通过靶向敲除 Foxe3 两个等位基因的敲除小鼠（Foxe 3{tm / t m}）表现出晶状体前上皮细胞增殖提前停止的现象，且小鼠晶状体体积偏小，晶状体前上皮无法与角膜分离（Medina-Martinez 等人，2005）。最后，Rinshoken在Foxe3上游顺式调控元件中存在22个碱基对（bp）纯合缺失的白内障（rct）小鼠，由于Foxe3表达降低，出现轻度小眼球、先天性白内障以及晶状体纤维严重变性（Wada等人，2011年）。

斑马鱼晶状体基板通过细胞分层过程增加细胞数量，并未发生内陷，但总体而言，该物种晶状体的发育及相应基因调控网络（GRNs）的表达也高度保守（Cvekl 和 Zhang，2017）。在斑马鱼（Danio rerio）中，foxe3 基因在受精后18至24小时的眼晶状体中被检测到，这一时间点与晶状体基板的诱导以及原代晶状体细胞分化的起始相吻合。在受精后31小时，该基因的表达仍存在于晶状体上皮细胞中（Shi 等人，2006；Kuang 等人，2016）。与野生型幼鱼相比，使用反义吗啉代寡核苷酸（MOs）敲低 foxe3 基因的幼鱼出现小眼症，瞳孔尺寸减小，且少数 morphant 个体的瞳孔完全缺失（Shi 等人，2006；Swindell 等人，2008）。这些 morphant 幼鱼的晶状体体积也更小，上皮细胞呈多层结构，晶状体纤维细胞形态异常（Shi 等人，2006）。值得注意的是，共同注射靶向 (p53) 的 MO，能够部分挽救 foxe3 基因敲低斑马鱼的主动脉弓组装缺陷（Kuang 等人，2016）。

尽管已存在这些FOXE3功能降低的动物模型，但对于脊椎动物晶状体形成中保守的基因调控网络（GRNs）以及FOXE3缺乏对这类基因调控网络造成的扰动，人们的了解仍十分有限。成熟晶状体由前方的单层晶状体上皮细胞和占据晶状体主体的后方纤维细胞区室构成（Cvekl & Zhang, 2017；Wride, 2011）。随着晶状体纤维细胞分化，细胞增殖停止，同时会合成晶状体分化标志物相关的晶状体特异性蛋白，包括晶状体蛋白和晶状体纤维主要内在蛋白（MIP/水通道蛋白）（Blixt et al., 2000；Wride, 2011；Kuang et al., 2016）。既往研究表明，与E15.0天的对照组小鼠相比，dyl突变小鼠的晶状体前上皮中α-晶状体蛋白表达水平升高，而纤维细胞中的α-晶状体蛋白表达则无差异（Brownell et al., 2000）。dyl小鼠晶状体中β-晶状体蛋白的表达也提前出现，且其表达范围延伸至晶状体前上皮细胞（Brownell et al., 2000）。另有研究在小鼠晶状体纤维细胞中过表达Foxe3，发现纤维细胞分化相关基因表达下调，而晶状体前上皮相关基因表达上调（Medina-Martinez & Jamrich, 2007；Sorokhina et al., 2011）。综上，既往研究均表明FOXE3在晶状体中对纤维细胞分化起负调控作用，FOXE3缺失可能会上调纤维细胞分化过程。然而，调控晶状体发育和纤维细胞分化的基因调控网络仍未被完全阐明。本研究利用成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术，靶向斑马鱼的叉头结构域，构建了体内FOXE3功能降低的动物模型。随后通过全基因组转录组分析（RNA测序）解析受FOXE3功能影响的脊椎动物基因调控网络，以期更深入理解该基因缺失对晶状体和眼部发育的影响。

材料与方法

所有动物实验均在加州大学旧金山分校（UCSF）动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案下进行（编号AN108657-02C）。EKW品系斑马鱼饲养于28℃环境，采用14小时光照/10小时黑暗的周期。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 靶向 foxe3 基因

我们采用了先前报道方法的改良版（Talbot 和 Amacher，2014年）。设计了靶向foxe3基因叉头结构域的CRISPR单向导（sg）RNA（表S1）。在单细胞阶段将sgRNA与Cas9蛋白共注射到野生型斑马鱼受精卵中，并在受精后24-48小时（hpf）通过T7酶切实验和/或桑格测序，对10-20尾幼鱼的诱变效率进行评估（引物序列见表S2）。将存在插入缺失（indel）突变的F0代幼鱼饲养至6-8周龄，每10-20尾为一组剪取鱼鳍，通过桑格测序确定其具体的插入缺失变异类型。我们筛选出3个F0代奠基个体，其foxe3基因存在小型插入缺失突变，要么造成移码突变，要么破坏剪接位点，预计会导致蛋白提前截短并发生无义介导的mRNA降解。将这些奠基鱼与野生型斑马鱼回交，对F1代后代进行饲养和基因分型，以鉴定出生殖系传递插入缺失变异的个体。将foxe3基因插入缺失变异杂合的F1代鱼互交，获得携带双等位基因foxe3突变的纯合子或复合杂合子F2代幼鱼。从饲养的3个F0代奠基鱼中，筛选出携带c.杂合突变的雌雄个体。

在foxe3基因中检测到296_300delTGCAG变异（表S3），这些斑马鱼被用于后续的互交实验和相关研究。对c.296_300delTGCAG斑马鱼互交产生的幼体，在受精后3至6天（dpf）进行观察，以验证此前在FOXE3突变患者以及Foxe3和foxe3功能缺失动物模型中观察到的眼部表型。由于斑马鱼无法在斑马鱼养殖系统中存活至幼鱼或成体阶段，我们未能对其眼部进行进一步检查，推测原因可能是与野生型和杂合且视力正常的幼体相比，这些突变幼体在食物竞争中处于劣势。通过光学显微镜测量眼部大小和晶状体形态。对存在眼部缺陷的幼体进行拍照，随后通过桑格测序进行基因分型，以确认其foxe3插入缺失变异的纯合状态。

 免疫组织化学实验中，将幼体用4%多聚甲醛固定，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，依次置于25%（质量/体积）蔗糖溶液和35%（质量/体积）蔗糖溶液中处理。按照标准技术制作组织块并进行切片。切片经过夜干燥后于-80℃保存。切片在含吐温20的磷酸盐缓冲液（PBST）中洗涤三次，随后置于含4%正常山羊血清（体积/体积）、2%正常绵羊血清和0.2%吐温的PBS封闭缓冲液中，于4℃孵育4小时。将zl-1一抗（斑马鱼国际资源中心；https://zebrafish.org/）以1:500的稀释度加入封闭缓冲液中，于4℃孵育切片过夜。切片经PBST洗涤后，使用德克萨斯红标记的抗小鼠IgG（货号M32017，赛默飞世尔科技）作为二抗，于4℃孵育4小时。使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；货号Vectashield，Vectorlabs）的抗淬灭封片液对切片进行封片，作为复染剂，随后通过荧光显微镜进行成像观察。

注射野生型foxe3 mRNA以拯救纯合子foxe3插入缺失突变体幼鱼的表型

为检测野生型 foxe3 mRNA 注射能否挽救杂合 foxe3 插入缺失（indel）斑马鱼互交后代中出现的眼部表型，我们扩增了单一亚型的全长 foxe3 转录本（引物序列见表 S4）。带帽且多聚腺苷酸化的 foxe3 mRNA 按先前描述的方法制备（mMessage mMachine® T7 Ultra 试剂盒；赛默飞世尔科技）（Chao 等人，2010）。我们对杂合 foxe3 插入缺失斑马鱼进行互交，并在 1 至 4 细胞期将浓度为 0、6.25 纳克/微升和 12.5 纳克/微升的 mRNA 注射到受精卵中。如前所述，将幼鱼培养并在受精后 3 天（3 dpf）对其眼部缺陷进行评分。

利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测杂合子foxe3插入缺失型鱼自交后代中存在眼部缺陷的幼鱼体内dnajb1基因的转录水平

我们开展实验以探究foxe3表达降低对dnajb1转录的影响（Khan等人，2016年）。为dnajb1a和dnajb1b设计基因特异性引物后（表S5），我们按照上述方法，在受精后3天从野生型EKW幼鱼以及从foxe3插入缺失杂合子互交群体中筛选出的有眼部缺陷的幼鱼中提取总RNA（使用Qiagen RNeasy试剂盒）。RNA经DNase处理后，利用SuperScript III第一链合成系统（Invitrogen）合成cDNA。反应在ABI Prism 7500序列检测系统上进行，数据参照以往方法（Wu等人，2015年），以gapdh（NM_001115114.1）或eef1a1l1（NM_131263.1）为内参，采用ΔΔCt法进行分析。

全基因组转录组分析（RNA-Seq）用于确定野生型幼鱼与具有眼部缺陷的纯合 foxe3 插入缺失突变型幼鱼之间的差异基因表达

为研究foxe3功能降低对基因转录的影响，本研究使用GeneJET RNA纯化试剂盒，在受精后3天（3 dpf）从20条完整幼鱼的混合样本中提取总RNA；研究分别从3个生物学重复的野生型EKW（对照组）幼鱼，以及3个生物学重复的杂合foxe3插入缺失突变鱼互交后代幼鱼中提取RNA。在插入缺失突变鱼的互交后代中，仅选取眼部和晶状体发育异常的幼鱼（推测为纯合子）用于RNA提取。在合成cDNA并制备测序文库前，研究人员对RNA的质量和浓度进行了检测。通过生物分析仪（2100 Bioanalyzer，安捷伦公司）评估RNA质量，并使用Ovation® RNA-seq V2系统试剂盒（NuGEN公司）制备测序文库。 该方法中，研究人员先利用随机六聚体引物和poly-T嵌合引物的组合，将总RNA逆转录合成第一链cDNA；随后通过加热部分降解RNA模板，再利用DNA聚合酶合成第二链cDNA。接着采用单引物等温扩增技术（SPIA）对双链DNA进行扩增。SPIA是一种线性cDNA扩增技术，其过程为：RNase H降解双链DNA 5'端DNA/RNA异源双链中的RNA，随后SPIA引物与cDNA结合，聚合酶通过置换现有正向链，从引物的3'端开始进行复制。之后再使用随机六聚体引物对第二链cDNA进行线性扩增。最终，利用超低起始量DR文库试剂盒（NuGEN公司）构建SPIA扩增产物的cDNA文库。研究人员通过以下方式对RNA-seq文库的质量及引物二聚体进行分析：使用生物分析仪进行分析，并通过定量聚合酶链式反应（KAPA 试剂盒）进行定量，随后进行测序。在 HiSeq 4000 测序仪（Illumina 公司）上采用单端 50 个循环的单端测序模式进行高通量测序。相关数据集已提交至美国国家生物技术信息中心的基因表达综合数据库（基因表达综合数据库编号：GEO#）。

foxe3 插入缺失型与野生型幼鱼的 RNA 测序数据集分析

利用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）对RNA-Seq数据集的原始单端读长质量进行了检测，以评估每碱基序列质量、质量分数、序列长度分布以及过度代表的接头/引物序列。基于获得的分数数据，使用“Timmomatic”（Bolger等人，2014年）进行序列修剪和剪切，并利用快速剪接定位映射工具TopHat v2.0.9（Trapnell等人，2009年）将处理后的读长与斑马鱼参考基因组（GRCz10/danRer7）进行比对。随后使用Cufflinks (v2.1.1 {34})处理比对结果，以组装转录本并测定其相对丰度。利用Cuffdiff34，结合TopHat生成的基因组比对BAM文件以及Cuffmerge拼接的转录本集合（Trapnell等人，2009年），计算差异表达基因。通过内部Python脚本将foxe3插入缺失突变体数据集与野生型对照组数据集进行比较，筛选出满足以下条件的具有统计学显著性的差异表达基因（DEGs）：倍数变化（fold change）大于±0.5、P值≤0.05，且所有数据集中的每百万个比对片段中每千碱基外显子的片段数（FPKM）平均值≥1。对全局基因表达数据进行主成分分析（PCA），以确定野生型和突变体数据集各生物学重复样本之间的相关性。使用DAVID v6.8（数据库注释、可视化和整合发现工具）（Huang等人，2009年）对foxe3插入缺失突变体数据集中的DEGs进行生物学相关的功能聚类分析。DEGs的基因本体论（GO）富集结果以柱状图呈现。我们还将foxe3插入缺失突变体RNA-Seq数据中鉴定出的DEGs，与此前报道的在Cryaa启动子控制下于晶状体纤维细胞中过表达Foxe3的转基因小鼠晶状体微阵列数据（GSE9711）进行了对比分析（Landgren等人，2008年）。此外，我们还根据iSyTE数据库（Lachke等人，2012年，《视觉科学与眼科学》；Kakarana等人，2018年，《核酸研究》），将foxe3插入缺失突变体中上调或下调1.5倍的DEGs，与小鼠胚胎第12.5天（E12.5）晶状体中富集表达的基因进行了对比分析。

定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）验证RNA测序结果

我们采用qRT-PCR技术，基于RNA-Seq实验结果验证野生型与foxe3插入缺失（indel）斑马鱼幼鱼之间的差异表达。本研究使用的是此前提交用于RNA-Seq分析的相同RNA样本。使用含Rox的通用SybrGreen预混液（罗氏公司）和基因特异性引物（表S5、表S6），终浓度为2.5微摩尔，对1纳克互补脱氧核糖核酸（cDNA）进行扩增。反应在StepOne实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司）上进行，依据ΔΔCt法，通过StepOne {TM})软件和ExpressionSuite软件（赛默飞世尔科技公司）进行分析。如上所述，我们将甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）或延伸因子1α1样1（eef1a1l1）作为内参基因。所有实验均采用野生型EKW（对照组）斑马鱼幼鱼或杂交获得的foxe3插入缺失斑马鱼幼鱼的三份生物学重复样本，且每个反应均进行三次重复。

结果

靶向foxe3的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统

我们利用CRISPR/Cas9技术在独立的野生型F0斑马鱼的foxe3基因中构建了三种插入缺失（indel）变异体（图S1）。所有变异体均预测会导致斑马鱼该基因的一种同工酶丧失功能（表S3）。我们对foxe3基因中c.296_300delTGCAG插入缺失变异体纯合子的幼鱼进行了研究。这些幼鱼表现出眼部表型，表现为眼球体积减小，晶状体小、畸形或缺失（图1）。foxe3表型遵循常染色体隐性遗传模式，在对两批独立的杂合foxe3插入缺失斑马鱼进行杂交后，3天龄（3 dpf）的幼鱼中，晶状体发育异常的比例分别为17/57（29.8%）和32/134（23.9%）。我们通过对6天龄（6 dpf）时8只晶状体发育异常的斑马鱼和8只光学显微镜下眼部外观正常的斑马鱼进行测序，直接验证了表型的外显率。所有晶状体异常的幼鱼（8/8）均为foxe3移码插入缺失的纯合子，而6/8只眼部外观正常的斑马鱼为该插入缺失的杂合子，2/8只为野生型，这表明该表型具有高度外显率。从3天龄（3 dpf）起，光学显微镜下即可观察到眼部异常，且foxe3插入缺失突变体幼鱼在外部其他方面均表现正常（图1）。本研究观察到的表型与此前利用靶向foxe3的反义吗啉代寡核苷酸（MOs）构建的小晶状体斑马鱼表型相似（Shi等人，2006；Swindell等人，2008）。对野生型幼鱼和疑似为foxe3插入缺失突变纯合子的眼部缺陷幼鱼的眼径、眼径与体长比值进行比较，结果显示，6天龄（6 dpf）时突变体幼鱼的眼径两项指标均显著降低，表现出小眼球特征（图2）。我们还利用zl-1抗体检测了foxe3表达降低对晶状体纤维蛋白的影响，结果发现，与野生型对照组相比，foxe3插入缺失突变体幼鱼的小晶状体染色信号更强（图3）。由于zl-1可对分化中的晶状体纤维进行染色（Greiling等人，2010），这一结果表明，与野生型对照组相比，foxe3插入缺失突变体幼鱼的晶状体纤维细胞分化程度更高。

注射野生型 foxe3 mRNA 以拯救 foxe3 插入缺失突变体幼鱼的表型

为证明 CRISPR/Cas9 注射靶向了 foxe3 基因，我们尝试通过将全长野生型斑马鱼 foxe3 mRNA 注射到杂合 foxe3 插入缺失纯合子鱼互交获得的卵中进行表型挽救。未注射 mRNA 时，根据上述表型的常染色体隐性遗传特征以及眼部表型的高外显率，在受精后3天通过光学显微镜观察，杂合子互交的后代中约有25%的幼鱼会出现眼部缺陷。然而，注射12.5纳克/微升的RNA后，出现眼部缺陷的幼鱼比例降至18%，表明实现了部分挽救，不过该差异未达到统计学显著水平（表S7）。由于此剂量下已观察到毒性，我们未尝试更高浓度的RNA注射（数据未展示）。注射靶向 foxe3 的反义吗啉代寡核苷酸的幼鱼与我们的纯合 foxe3 插入缺失突变鱼在表型上的相似性，以及部分挽救的结果，表明我们观察到的眼部表型是由 foxe3 基因破坏导致的。

qRT-PCR 检测纯合 foxe3 插入缺失突变体幼鱼中 dnajb1a 和 dnajb1b 的表达

我们首先通过qRT-PCR检测了dnajb1a和dnajb1b在存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变体幼鱼中的表达情况。此前研究结果显示，通过全转录组分析发现，表达野生型FOXE3的人类细胞中DNAJB1的表达低于表达截短型FOXE3的细胞，这表明FOXE3对DNAJB1具有下调作用（Khan等人，2016年）。而dnajb1a和dnajb1b的qRT-PCR结果显示，存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变体与野生型斑马鱼之间的表达差异无统计学意义。这一结果与此前Khan等人（2016年）在细胞实验中观察到的截短型FOXE3组相比野生型FOXE3组dnajb1b表达相对上调的结论不符，而该结论曾表明dnajb1b是斑马鱼晶状体中foxe3的重要下游效应因子。qRT-PCR结果还证实，与野生型幼鱼相比，存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变体中foxe3的表达有所降低，不过仍检测到残留的foxe3转录本。我们未能获得合适的抗体来进行蛋白质印迹实验，以证实存在眼部缺陷的幼鱼中foxe3的功能丧失。

全基因组转录组分析（RNA-Seq）用于鉴定野生型幼鱼与具有眼部缺陷的纯合 foxe3 插入缺失突变幼鱼之间的差异基因表达

为了更好地理解 foxe3 表达在晶状体中的功 能，我们对野生型对照组的完整幼鱼以及 foxe3 插入缺失杂合子中存在眼部缺陷的幼鱼进行了全基因组 RNA 测序。对照组和突变体各三个重复样本共产生了 255,880,576 条单端读数，其中 199,380,411 条比对到斑马鱼参考基因组（表1）。主成分分析显示，与野生型对照组相比，foxe3 插入缺失突变体的数据集聚类结果明显不同（图5A）。以 P 值为 0.05、log₂（倍数变化）阈值大于 ±0.5 且结合均值 FPKM ≥1 为筛选条件，我们共鉴定出 2170 个差异表达基因（图5），其中包括 584 个上调差异表达基因和 1586 个下调差异表达基因（表S8）。随后，我们利用生物信息学工具（DAVID 生物信息学资源库）对这些差异表达基因进行分析，鉴定出多个与突变体中观察到的缺陷相关的基因本体论聚类（图6）（表S10）。

接下来，我们结合生物信息学数据库资源 iSyTE2.0（眼部基因发现综合系统工具）（Kakrana 等人，2018）中与小鼠 E12.5 期晶状体相关的同源基因，对 foxe3 插入缺失突变体的差异表达基因进行分析，这一研究已成功鉴定出晶状体发育过程中的高优先级候选基因（Siddam 等人，2018）。我们发现，在 foxe3 插入缺失突变体斑马鱼中，有 16.6%（n=181 个基因）的差异表达基因发生了 1.5 倍的上调或下调，这些基因的小鼠同源基因在 iSyTE 数据库中显示在 E12.5 期小鼠晶状体中有 2.5 倍以上的富集表达（表 S11）。有趣的是，在这 181 个差异表达基因中，超过 70% 的基因在 foxe3 突变体斑马鱼中呈下调状态，且在 E12.5 期小鼠晶状体中富集。在 foxe3 下调且同时为 iSyTE 晶状体富集的基因中，还有一些值得关注的候选基因，例如 grifin（晶状体中的半乳糖凝集素家族蛋白，PubMed 编号：9786891）、mipb（与白内障相关，PubMed 编号：20671274）、crygmx（晶状体γ晶体蛋白，PubMed 编号：19936306）、cryba2b（与白内障相关，PubMed 编号：23508780）、tmod1（与晶状体纤维骨架组织相关，PubMed 编号：19752024）、slc16a12a（与白内障相关，PubMed 编号：18304496）、six5（与白内障相关，PubMed 编号：10802668）、aldh1a3（与小眼球症相关/无眼畸形（PMID: 23312594）以及 rnf10、tcf7 等未被鉴定的新候选基因，还有其他众多基因。

此外，我们还对foxe3插入缺失突变鱼中鉴定出的差异表达基因（DEGs）与转基因小鼠模型晶状体中通过微阵列鉴定出的差异表达基因进行了对比分析。在该转基因小鼠模型中，通过Cryaa启动子使Foxe3在晶状体纤维细胞中过表达（Landgren等人，2008，PMID: 18539941）。由于本研究的实验背景是foxe3功能缺失（foxe3插入缺失突变斑马鱼），而先前研究的实验背景是Foxe3功能获得（小鼠晶状体中Foxe3过表达），因此我们预期在本研究中被下调的基因，在Landgren等人（2008）的研究中很可能被鉴定为上调。事实上，我们发现foxe3插入缺失突变鱼中13.8%的基因(n=154)以这种方式与两项研究中的1113个小鼠直系同源基因相关（表S12）。因此，尽管这些对比是在foxe3插入缺失突变鱼的全胚胎组织RNA测序差异表达基因与野生型（iSyTE）或Foxe3过表达的小鼠晶状体组织之间进行的，但它们鉴定出了许多新的Foxe3下游靶基因，且这一关键转录因子对这些靶基因的正向调控在斑马鱼和小鼠中具有保守性。

FOXE3 调控晶状体发育相关基因的表达

对从混合的疑似纯合子foxe3突变体幼鱼和野生型幼鱼中提取的RNA进行的全转录组分析（RNA-Seq）结果显示，若干在晶状体中表达、且其人类同源基因与眼部缺陷（包括白内障）相关的基因存在显著的表达失调现象（表2和表S9；图7）。我们发现晶体蛋白基因（crybb1、cryba4、cryba2a、cryba1l1、crygn1、crygn2、crygmxl2）、含谷氨酰胺合成酶结构域的晶状体蛋白编码基因（lgsn）、晶状体纤维膜内在蛋白基因（lim2.2）、转录因子基因（热休克因子4（hsf4）、早期生长反应基因1（egr1））以及具有潜在转录功能的基因（例如基因本体论（GO）：0003700~转录因子活性和GO：0043565~序列特异性DNA结合）均出现显著上调（图6A）（表S10）。而下调的基因则显著富集于以下GO功能类别：GO：0015254~甘油通道活性、GO：0006508~蛋白水解、GO：0008236~丝氨酸型肽酶活性、GO：0008289~脂质结合、GO：0042632~胆固醇稳态以及GO：0051006~脂蛋白脂酶活性的正向调控（图6B）（表S10）。我们通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对候选基因aqp3a、ctrb1、crygmx、cryba2b、cdh1、cp、cx43.4、mipa、fmodb和fgfbp1b的表达失调情况进行了独立验证（图7）。值得注意的是，foxe3插入缺失突变体中上调的若干基因通常在晶状体纤维细胞中富集，这与foxe3在维持小鼠上皮细胞命运中的功能相符。

我们利用CRISPR/Cas9技术，通过靶向斑马鱼中的叉头结构域蛋白，构建了foxe3功能降低的体内模型。在foxe3基因中存在indel变异c.296_300delTGCAG（预测会导致p.(Val99Alafs*2)，NM_001079682.2）的纯合子幼鱼，在72小时胚胎期（hpf）表现出眼睛较小和晶状体形成缺陷的表型（图1-2）；这一表型与此前在斑马鱼中通过反义吗啉代寡核苷酸（MO）靶向foxe3所观察到的结果一致（Shi等人，2006；Swindell等人，2008）。该表型呈现出常染色体隐性遗传的模式该突变遵循孟德尔遗传模式，且表现为完全外显。使用可染色分化晶状体纤维的zl-1抗体进行免疫组织化学检测发现，与野生型对照组相比，indel突变体幼鱼中该抗体的表达水平有所升高。我们从患有眼部缺陷的foxe3突变体幼鱼和野生型幼鱼的全虫体混合样本中提取RNA，进行全基因组转录组分析（RNA测序），发现晶状体中表达的、且其人类同源基因与白内障相关的基因出现显著表达失调，其中包括cryba2a、cryba1l1、crygmxl2、lgsn和hsf4基因的上调，以及mipa、fmodb和cx43.4基因的下调。

cryba2a的人类同源基因CRYBA2在斑马鱼晶状体早期发育过程中表达，且与人类常染色体显性白内障相关（Reis等人，2013年）。cryba1l1也在晶状体中表达，而其相关基因CRYBA1则因与人类白内障相关而广为人知（Kannabiran等人，1998年；Khan等人，2015年）。在存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变斑马鱼幼鱼中，还有其他在晶状体中表达且表达失调的晶体蛋白基因，其中cryba4、crygmxl2、crybb1、crygn2、cryba1b表达上调，cryba2b表达下调（表S8）。由于晶状体纤维分化涉及晶体蛋白的积累（Cvekl等人，2015年），foxe3插入缺失突变幼鱼中晶体蛋白基因的表达上调，与foxe3缺失会促进晶状体纤维分化的假说相符，这也与此前的研究发现一致——即小鼠晶状体中外源过表达Foxe3会导致纤维相关表达基因（包括编码晶体蛋白的基因）表达下调（Landgren等人，2008年）。

本研究中其他支持这一假说的上调基因包括hsf4，这是一种在晶状体纤维细胞中表达的转录因子，可调控热休克蛋白（包括晶状体B-晶体蛋白）的表达（Somasundaram和Bhat，2004；Anand和Lachke，2017；Anand等人，2018）。该基因DNA结合结构域中的有害变异会导致常染色体显性白内障，若变异位于疏水重复序列（HR-A/B）内或疏水重复序列下游，则会引发常染色体隐性白内障（相关综述见Anand等人，2018）。在小鼠中对Hsf4进行特异性敲除或突变，也会导致晶状体纤维细胞缺陷和白内障，且出生后早期晶状体中的γ-晶体蛋白基因表达下调（Fujimoto等人，2004；Shi等人，2009；Anand等人，2018）。lgsn基因编码晶状体蛋白，属于谷氨酰胺合成酶（GS）蛋白家族，在脊椎动物晶状体中含量中等，且在分化中的晶状体纤维细胞中局部浓度更高（Grassi等人，2006；Wyatt等人，2006）。重组小鼠晶状体蛋白无催化活性，因此晶状体蛋白被认为最可能发挥类似晶状体中晶体蛋白的结构或分子伴侣样作用（Wyatt等人，2006）。有假说认为其在维持晶状体透明性方面具有功能（Grassi等人，2006），但目前尚未发现其与人类疾病存在已知关联。

在被发现下调的基因中，晶状体纤维主要内在蛋白a（mipa；也被称为水通道蛋白0，即aqpo）在眼睛和晶状体泡中表达（Greiling等人，2010年；Sorokina等人，2011年）。研究人员已在斑马鱼中对该基因进行了研究，通过吗啉代寡核苷酸敲低该基因会导致白内障形成，这表明该基因对晶状体的正常发育和透明度至关重要（Froger等人，2010年）。该基因的突变也是人类常染色体显性遗传性白内障的一个重要致病原因（Chepelinsky，2009年）。纤维调节蛋白（fmodb）是富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖（SLRP）家族成员，属于细胞外基质蛋白，可与I型和II型胶原原纤维相互作用并抑制体外原纤维生成（Chen等人，2010年；Amjadi等人，2013年；Steinhart等人，2014年）。纤调蛋白基因敲除小鼠表现出更薄的巩膜，且巩膜中胶原纤维直径减小，这可能改变其因眼内压升高而受损的易感性（Chen等人，2010年；Amjadi等人，2013年）。纤调蛋白和核心蛋白聚糖双基因敲除小鼠（Lum(−/−)Fmod(−/−)患有高度近视、眼轴长度增加、巩膜变薄以及视网膜脱离，因此有假说认为纤调蛋白可能与人类近视的发生相关（Chakravarti等人，2003年），但迄今为止尚未发现致病变异。连接蛋白43（Cx43）、连接蛋白46和连接蛋白50也在晶状体中特异性表达，其中Cx43存在于晶状体上皮细胞和正在分化的晶状体纤维细胞中，随后在分化过程中表达下调（Behnam等人，2016年）。CX46和CX50的突变也与人类常染色体显性和常染色体隐性先天性白内障以及年龄相关性白内障相关（Pichi等人，2016年；Berthoud和Ngezahayo，2017年）。

我们的研究结果表明，我们的foxe3插入缺失模型与晶状体发育的研究高度相关，且在探究受foxe3功能减弱影响且在脊椎动物中保守的基因调控网络（GRNs）方面具有巨大潜力，从而能够识别受foxe3调控的核心基因回路。我们的结果与foxe3失活是晶状体纤维分化所必需的这一假说一致，因为foxe3的缺乏会增加参与该过程的基因的表达。目前仍存在两个未解决的问题。我们使用的是整个斑马鱼的RNA，因此其他组织中的表达可能会影响我们的RNA测序（RNA-Seq）结果，但需要指出的是，在foxe3插入缺失突变体幼鱼中，许多表达失调的基因表现出晶状体特异性表达，且在晶状体生物学中具有既定作用（Lachke等人，2012；Krakana等人，2017）。未来，可仅对从头部或眼睛提取的RNA开展实验。同样，我们未能获得合适的抗体来检测存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变体斑马鱼中残留蛋白的含量；结合我们的实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）结果，我们无法区分其是部分功能丧失还是完全无效突变模型。

结论

我们利用CRISPR/Cas9技术靶向斑马鱼foxe3基因的叉头结构域，构建了一种新的斑马鱼foxe3缺陷模型。该模型表现出眼部变小和晶状体缺陷，晶状体对zl-1抗体的染色反应增强，这与晶状体纤维细胞分化程度提高的结果一致。全基因组转录组分析显示，该模型中晶状体和眼部表达的基因存在显著失调，这些基因的同源基因与人类患者的白内障相关，包括晶状体纤维表达因子（如晶体蛋白基因cryba2a、cryba1l1）以及mipa和hsf4。研究还发现，斑马鱼晶状体表达的lgsn、crygmxl2基因显著上调，而fmodb、cx43.4基因显著下调；目前尚未明确这些基因与人类眼部表型存在关联。这些结果与foxe3在晶状体纤维分化前于晶状体前上皮细胞中发挥的已知作用相符，表明该斑马鱼突变模型与研究脊椎动物晶状体和眼睛发育中保守的基因调控网络高度相关。

图1. 纯合foxe3插入缺失突变的斑马鱼幼体在受精后6天出现眼部异常，晶状体形成异常。A：受精后6天野生型幼鱼的照片，显示正常的眼睛形成（115倍）。B：受精后6天野生型幼鱼的照片，显示正常的外部形态（25倍）。C：受精后6天foxe3插入缺失突变体幼鱼的照片，显示眼睛存在缺陷且瞳孔较小（115倍）。D：受精后6天foxe3插入缺失突变体幼鱼的照片，显示外部形态明显正常（25倍）。

图2. 受精后6天对纯合foxe3插入缺失突变斑马鱼幼鱼的眼径及眼径/体长的测量显示其眼部尺寸减小。A. 对9条野生型幼鱼（蓝色柱）和8条来自杂合子foxe3插入缺失纯合鱼互交的存在眼部缺陷的幼鱼（绿色柱）在受精后6天的眼径进行测量。绘制值代表所有测量的平均值。误差棒为平均值的标准误。双尾异方差T检验显示，存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变鱼的眼大小显著更小，标注为*（对应标识 p=0.017）。B. 对8条野生型幼鱼（蓝色柱）和8条来自杂合子foxe3插入缺失纯合鱼互交的存在眼部缺陷的幼鱼（绿色柱）在受精后6天的眼径与体长的比值进行测量。绘制值为所有测量的平均值。误差棒为平均值的标准误。双尾异方差T检验显示，存在眼部缺陷的foxe3插入缺失突变鱼的眼径与体长的比值显著更小，标注为*（对应标识p=0.0037）。

图3. 受精后6天，纯合foxe3插入缺失突变体幼鱼与野生型对照组相比，眼晶状体更小，且抗晶状体纤维细胞标志物抗体zl-1的染色更强。受精后6天（dpf）使用zl-1抗体进行免疫组织化学染色并以德克萨斯红显色的结果显示，与野生型对照组相比，foxe3突变体幼鱼的晶状体更小，且纤维细胞的染色强度更高。A. 来自EKW对照组幼鱼的右眼经DAPI和zl-1（德克萨斯红）染色。B. 来自纯合子foxe3插入缺失突变体幼鱼的右眼经DAPI和zl-1（德克萨斯红）染色，可见晶状体更小，zl-1染色强度更高。C. 来自EKW对照组幼鱼的左眼经DAPI和zl-1（德克萨斯红）染色。D. 来自纯合子foxe3插入缺失突变体幼鱼的左眼经DAPI和zl-1（德克萨斯红）染色，可见晶状体更小，zl-1染色强度更高。E. 来自EKW对照组幼鱼的右眼经zl-1（德克萨斯红）染色。F. 来自纯合子foxe3插入缺失突变体幼鱼的右眼经zl-1（德克萨斯红）染色，可见晶状体更小，zl-1染色强度更高。G. 来自EKW对照组幼鱼的左眼经zl-1（德克萨斯红）染色。H. 来自纯合子foxe3插入缺失突变体幼鱼的左眼经zl-1（德克萨斯红）染色，可见晶状体更小，zl-1染色强度更高。

图4. 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）显示foxe3插入缺失突变体幼鱼中dnajb1b的表达上调。在受精后3天（dpf），从 foxe3 插入缺失变异杂合子鱼互交获得的对照组幼鱼和存在晶状体缺陷的幼鱼（推测纯合子）群体中提取RNA。完成cDNA合成后，使用两对基因特异性引物扩增 dnajb1a 和 dnajb1b，使用一对基因特异性引物扩增 foxe3。采用ΔΔCt法并以 gapdh 作为内参基因进行qRT-PCR实验及分析。结果展示了 dnajb1a、dnajb1b 和 foxe3 的log2表达倍数变化，除证实 foxe3 下调外，还发现 foxe3 插入缺失突变体互交后代的眼缺陷幼鱼中 dnajb1b 上调（p=0.076），而 dnajb1a 无此变化。所有数值均为3次生物学重复的平均值，每次实验设3次重复，误差线代表均值标准误。

图5. foxe3插入缺失突变斑马鱼的RNA测序分析。A：foxe3 插入缺失突变体和野生型RNA测序数据集的主成分分析（PCA）图。对foxe3插入缺失突变体和野生型RNA测序数据集进行的主成分分析（PCA）显示，突变体（1、2和3）和野生型（4、5和6）数据集形成了不同的簇。B：与对照组相比，foxe3插入缺失突变体中的差异表达基因。绘制了foxe3插入缺失突变体中差异表达基因的倍数变化（FC）相对于平均值的图表以每百万条比对读段中每千个转录本的片段数（FPKM）表示的表达水平，突出显示了3天pf时下调（绿色）和上调（红色）的基因。

图6. foxe3 插入缺失突变斑马鱼中差异表达基因的基因本体（GO）富集分析。A：对foxe3插入缺失突变斑马鱼中具有统计学显著性的差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）功能富集分析，以识别上调的n=584)和下调的n=1586候选基因的富集类别。B：聚类富集p值<0.05

图7. 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果显示lgsn、cryba2a和cryba1l1显著上调，而mipa、fmodb和cx43.4显著下调。在受精后3天（dpf），从对照组幼鱼和晶状体存在缺陷的幼鱼（假定纯合子）混合样本中提取RNA，这些幼鱼来自foxe3基因中一个插入缺失变异杂合子的亲鱼自交。完成cDNA合成后，使用基因特异性引物扩增各基因。采用ΔΔCt法进行qRT-PCR分析，以gapdh或eef1a1l1作为内参基因。结果显示，lgsn、cryba2a和cryba1l1的表达显著上调，而mipa、fmodb和cx43.4的表达显著下调。所有数值均为3次生物学重复的平均值，每次实验均设置3次重复，误差线代表均值标准误。*表示具有统计学意义p<0.05

表1 样本详情、生成的读长数量及与基因组比对的RNA-seq读长汇总

表2.全转录组分析（RNA-Seq）和qRT-PCR结果显示，foxe3 插入缺失突变体中部分基因的表达发生显著改变与野生型幼鱼相比，出现眼部缺陷。