MAP4K4蛋白功能的丧失会导致人类和斑马鱼出现先天性异常

题目：Abrogation of MAP4K4 protein function causes congenital anomalies in humans and zebrafish

原文链:https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade0631

期刊:Science Advances

本研究报道了21个家庭，这些家庭存在神经发育异常和多种先天性畸形，同时携带丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）的一系列罕见变异体。MAP4K4与包括c-Jun N端激酶和RAS激酶在内的多种信号通路相关，目前正作为多种疾病的可成药靶点进行研究。通过多种斑马鱼模型，我们证实这些人类变异体为功能缺失或显性负性等位基因，且降低Map4k4的活性会导致发育缺陷。此外，MAP4K4在胚胎发育早期能够抑制过度活跃的RAS信号传导。综上，本研究数据表明MAP4K4在早期胚胎中负向调控RAS信号传导，受影响人类个体中发现的变异体会使其功能丧失，从而确定MAP4K4是伴有综合征性神经发育异常个体的致病位点。

引言

RAS信号通路是胚胎发育过程中用于塑造胚胎生长的众多信号级联反应之一。该通路配体与受体酪氨酸激酶（RTK）结合后被激活，最终引发信号级联反应，涉及RAS、快速加速纤维肉瘤、丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的依次磷酸化。许多蛋白质直接参与信号转导，还有更多蛋白质则对通路活性起到正向或负向调控作用。

在健康状态下，RAS 信号通路有助于调控细胞的存活、生长与分化，而该信号通路的异常则可能引发疾病。信号通路的缺失会导致胚胎致死，但 RAS 基因或其他通路组分的变异若导致 RAS 信号过度激活，却是癌症发生的常见原因。这类激活型变异通常发生于体细胞，但若通过生殖系遗传，会引发一组发育综合征，统称为拉沙病（RASopathies）。尽管每种拉沙病在临床上均具有特异性，但受累个体出现的症状存在大量重叠。其中颅面畸形（CFAs）、先天性心脏病（CHDs）、发育迟缓（DD）、身材矮小以及癌症易感性尤为常见。部分拉沙病综合征较为罕见，而另一些则相对常见，总体而言，拉沙病的发病率约为千分之一。

已识别出多种与RAS病相关的基因，而具体通路的异常决定了该疾病的临床表现。例如，MEK基因中的致病突变会心面皮肤综合征，而NRAS、RAF1等基因的致病变异与努南综合征相关。尽管如此，许多受累个体在外显子组或基因组测序后仍缺乏分子诊断，且推测其中许多人携带此前未与人类疾病关联的基因变异。在多中心队列中对导致RAS病表型的候选基因进行致病变异的鉴定与验证，不仅为发现RAS信号通路的调控因子提供了机会，也有望为研究中的病例以及更广泛的RAS相关疾病提供治疗干预靶点。

MAPK激酶激酶激酶4（MAP4K4）编码一个Ste20家族的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该激酶包含一个激酶结构域、一个域间连接区和一个香橼同源（CNH）结构域。域间连接区和CNH结构域介导与相互作用伙伴的结合，其中CNH结构域还在调节激酶活性方面发挥额外作用。MAP4K4在所有组织中均有表达，不过在大脑和睾丸中的表达水平最高，且已分离出五种同工型。MAP4K4的缺失会破坏胚胎发育，而蛋白水平升高则与癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等多种疾病相关。尽管MAP4K4已被证实参与多条信号通路，但有研究表明该蛋白在调节RAS信号传导中具有作用。

本研究报道了来自21个无亲缘关系家庭的26名受累个体的队列，这些个体存在神经发育异常、心脏问题和颅面异常，其表型与RAS病有重叠，且携带MAP4K4基因的一系列罕见变异。我们利用斑马鱼模型证实，这些变异会降低MAP4K4的功能。部分变异体在本质上通过功能丧失（LOF）或显性负效应（DN）发挥作用。我们发现，增强或减弱MAP4K4的活性会在斑马鱼胚胎中引发相似的发育缺陷。最后，我们证实了MAP4K4能够在斑马鱼胚胎早期抑制过度激活的RAS信号通路。综合来看，我们的研究数据表明，在早期胚胎环境中，MAP4K4是RAS信号通路的负向调控因子，且在患者体内发现的变异体会使其功能丧失，从而解除对RAS信号通路的抑制。本研究明确了MAP4K4基因变异与其他RAS病综合征相关特征之间的关联。

结果

MAP4K4基因存在罕见变异的个体表现出神经发育异常和先天性畸形

对一名被诊断为努南样综合征的患病女性进行外显子组测序，在MAP4K4基因（GenBank 标识符：NM_001242559.1）中发现了一个c.2591T>A;p.Leu864Ter变异体。该变异体在基因组聚合数据库[基因组聚合数据库（gnomAD）v2.1.1]的约123,350名个体中均未出现，其功能缺失不耐受概率为1，错义Z评分为4.74。该患者表现出颅面畸形特征、肢体异常、肺动脉狭窄、智力障碍（ID）及发育迟缓（DD），并伴有行为障碍（表S1）。对家庭成员的测序结果显示，先证者的母亲和兄弟姐妹均携带该变异体。母亲和兄弟姐妹均表现出轻度智力障碍/发育迟缓，且该兄弟姐妹还患有先天性面部异常。在本次初始发现队列中其余的患病个体中，未发现其他有意义的MAP4K4变异。

此前有研究报道，一名患有复杂先天性心脏病及肾脏和泌尿道先天性异常的胎儿中，存在 MAP4K4 基因的一个新发 LOF 变异（p.Gln1157Ter）。该变异的功能影响尚未经检测，但该基因位点被认定为候选致病基因。通过包括 GeneMatcher在内的国际合作，我们从 21 个无亲缘关系的家系中鉴定出 26 名携带 MAP4K4 基因杂合变异的个体（表1及补充表S1）。其中包含两个错义变异（p.Gly173Asp 及p.Arg152Trp）为复发性突变，且在两个家系中均为新发突变，形成了包含19个变异的等位基因系列；其中8个为截短变异、9个为错义变异、2个为内含子剪接位点变异（图1A和图1B）。这些变异在gnomAD数据库中未被检测到，要么为新发突变，要么遗传自患病亲本。部分亲本因无法检测而无法确定其遗传方式。携带MAP4K4变异的个体中，发育迟缓（DD）发生率高达80%，智力障碍（ID）为42%，身材矮小为40%。其他可变症状包括先天性面部异常（CFA，最高29%）、先天性心脏病（CHD，27%）、肌张力低下（25%）、肢体异常（29%）、小颌畸形（29%）、耳后旋位（29%）、注意缺陷障碍（30%）、中枢神经系统结构缺陷（31%）以及胎儿指垫（19%）（图2和表1）。尽管患病个体的临床表现多样，但大多数表现出神经发育疾病症状，且具有一系列与RAS病患者重叠的特征。这些数据与此前报道的MAP4K4在调控RAS信号通路中的作用一致。

MAP4K4 截短导致蛋白功能丧失

为确定 MAP4K4 变异体对蛋白质功能的影响，我们利用斑马鱼进行了快速筛选。我们构建了编码人 MAP4K4 的表达载体，并通过定点诱变引入了在病例中发现的七个随机选择的变异体，其中五个为截短型变异，两个为错义变异。患者参考序列（NM_001242559.1）编码的蛋白质与表达载体编码的蛋白质，其变异注释存在差异。但受影响残基在整体序列中的上下文保持一致（图1A）。

斑马鱼胚胎在单细胞阶段，在各实验条件下均以等剂量注射编码野生型（WT）或变异型MAP4K4的mRNA。MAP4K4{W T}的表达会在受精后3天（dpf）引发一系列发育缺陷。与注射溶剂的对照组相比，这些幼鱼的体长更短，且出现了体轴弯曲（CFA）、提示心脏缺陷的心脏水肿、脑积水、眼睛偏小或畸形、卵黄延伸缺陷以及体轴弯曲等表型（图3A）。这些表型以任意组合的形式出现。值得注意的是，异位表达的人源MAP4K4将mRNA导入野生型背景中，内源性map4k4从合子阶段开始表达，并至少持续到幼虫第5天（表达图谱：www.ebi.ac.uk/gxa/experiments/E-ERAD-475）。因此，该实验无法重现受影响的人类表型；相反，它可用于评估野生型蛋白对发育的影响，以便与变异型蛋白进行对比。

表1. 27名携带杂合MAP4K4变异个体的临床特征。最常见的特征为发育迟缓（DD）、智力障碍（ID）、注意缺陷障碍、脑部磁共振成像（MRI）异常以及身材矮小。M，男性；F，女性；Unk，未知。

我们评估了MAP4K4变异体对形态的影响。携带病例相关变异体的等剂量mRNA与MAP4K 4{W T}影响相同的组织，只是严重程度有所不同（图3A）。我们对幼鱼的身体缺陷（图3B）进行了评分，包括躯干截断、侧曲或背腹弯曲。除MAP4K4 4{P 232 X}外，所有变异体均显著增加了身体缺陷的发生率，其中MAP4K4 4{R 152 W}的影响最大，MAP4K 4{L 889 X}的影响最小。其他三类缺陷也呈现出类似趋势：眼部缺陷（包括小眼和裂孔等畸形）、心脏缺陷（表现为心包水肿）以及卵黄缺陷（表现为卵黄延伸体前后缩短或背腹增厚，或卵黄缩窄消失）（图3C至E）。我们还测量了体长（图3F），发现了类似趋势，部分变异体对体长几乎无影响，而另一些则大幅降低了胚胎长度，MAP4K4 {WT }的异位表达也会产生类似效果。

表达MAP4K4变异体的一部分幼虫在受精后3天出现颅面前位畸形，与对照组相比，眼睛位置更靠前。由于在携带MAP4K4变异体的人类队列中也观察到了颅面前位畸形，我们接下来在受精后5天通过阿尔辛蓝染色观察软骨来检测颅面发育（图4A）。我们测量了中线处梅克尔软骨与角舌软骨之间的距离，作为颌骨长度的替代指标。表达MAP4K4 4{WT }会缩短颌骨长度（图4B），大多数变异体也有类似效果，只是程度不同。颅面前位畸形的发生率也有所上升，表达MAP4K4变异体会导致软骨形态异常或位置异常（图4C）。在极端情况下，软骨会向双侧而非中线发育，这可能是神经嵴细胞迁移异常所致。

在所有检测的发育相关结构中，五种截短变体对发育的影响最小。错义变体 MAP4 K 4{R 152 W}和 MAP4K4 4{G 173 D} 具有最强的破坏性。由于 MAP4 K 4{W T}会破坏幼虫发育，这表明截短变体降低了 MAP4K4 的功能，使其不再像 MAP4K4 4{WT } 的异位表达那样对发育产生阻碍作用。尽管这一发现支持了移码变体病例中 MAP4K4 功能丧失是疾病诱因这一事实，但并未解释错义变体如何导致我们研究队列中其余病例的疾病发生。

错义突变具有显性负效应

为探究错义变异是否可能产生显性负效（DN）效应，我们检测了引入一种已知显性负效形式的蛋白质MAP4K4 {D 153N}所产生的效应（图3和图4）。该变异为激酶失活型变异，能够干扰内源性表达的Map4k4蛋白质，有效抑制该蛋白的功能。表达MAP4K4 {D 153 N}会导致各类胚胎异常的发生率升高，同时使胚胎的体长和颌骨长度均缩短。在大多数情况下，所检测到的效应与表达MAP4K 4{W T}所产生的效应相似或更强，这表明降低Map4k4的功能与增强其功能具有相似的影响。通过外源性提供 MAP4K4。因此，我们假设在我们的实验中观察到与 MAP4 K 4{W T} 具有相似效应的一部分错义变异可能代表显性负效低活性等位基因。

图1. 受影响个体中鉴定出的MAP4K4变异体聚集在功能结构域中。(A) 展示了丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）蛋白的示意图（NP_001229488.1），我们队列中鉴定出的变异体位置在示意图上方用箭头标出。绿色箭头代表移码或截短变异体，紫色箭头代表错义变异体。示意图下方的箭头代表引入我们表达载体的相应突变（NM_001384485.1，Δ2078-2083）。红色方块显示已报道的磷酸化区域。(B) 展示了经典转录本和更长异构体的示意图。灰色方框代表序列间保守的外显子，黑色方框代表序列间不同的外显子。绿色箭头代表剪接供体位点的变异体，紫色箭头代表剪接受体位点的变异体。

由于我们的患者队列由表现出与RAS病综合征临床特征重叠的个体组成，我们推测疾病病因将源于RAS信号通路的调控。先前的研究表明，在斑马鱼中调控RAS通路会影响受精后11小时（hpf）胚胎的纵横比。通过表达高活性的RAS病相关MEK或BRAF变异体激活通路会导致胚胎伸长，而MEK的药理学抑制则会使胚胎缩短。此外，伸长或缩短的程度与通路激活的强度相关。我们预测，如果MAP4K4调控RAS信号，那么该检测方法将使我们能够区分四种等位基因类型；与M A P 4 K 4{WT }相比，显性负效（DN）变异体应对纵横比产生相反作用，功能缺失（LOF）变异体应无影响，低活性等位基因应产生类似但程度更轻的作用，而功能获得性变异体引起的作用应大于MAP4K4 4{WT }。

MAP4K4 {WT } 的过表达在受精后11小时显著降低了纵横比（图5A）。这表明功能蛋白量增加会抑制该信号通路。引入 MAP4K4 {D 153 N} 会导致胚胎伸长，这与信号通路因功能丧失而过度激活的结果一致Map4k4 功能。综合来看，这些数据表明在该情境下 MAP4K4 是 RAS 信号通路的负向调控因子。

我们接下来评估了变异体对纵横比的影响。变异型MAP4K4 mRNA的异位表达几乎没有影响或导致胚胎伸长（图5A），这使我们能够将变异体分为显性负效（DN）或功能丧失（LOF）型。显性负效变异体——MAP4K4 4{R 152 W}、M A P 4 K 4{G 173 D}和M A P 4 K 4{V 1033 X} .——提高了纵横比，尽管效果不如MAP4K4 {D 153 N}变异体显著。其余变异体——MAP4K4 4{S 17 X}、MAP4 K 4{P 232 X}、M A P 4 K 4{L .889 X}和MAP4K4 4{V 1093 X}——对纵横比无影响。这些变异体被归为功能丧失型，因为它们既未像MAP4K 4{W T}与内源性Map4k4联合那样产生累加效应，也未像MAP4K4 {D 153 N}那样干扰内源性Map4k4的功能。因此，在患者中检测到的所有变异体均会降低蛋白质功能，其中一部分变异体还能进一步干扰野生型等位基因的功能。

我们还测试了一种人类体内不存在的变体 MAP4K4 4{1841 S}，该变体由质粒诱变产生。这种变体保留了足够的功能，可降低与载体注射对照组相比的纵横比，但效果不及 MAP4K4 {WT }。因此，我们得出结论，p.Ile841Ser 是一种低活性等位基因。尽管这一结果与我们的人类队列无直接关联，但这一偶然发现表明，我们可通过该实验区分低活性等位基因与功能丧失等位基因。低活性 MAP4K4 的表达处于介于野生型和功能丧失变异体的过表达以及对后续表型的分析显示，其产生的表型与MAP4K4 {WT }过表达所导致的表型相似但更弱（图3和图4）。这一结果支持了我们先前的结论，即增加或降低内源性蛋白功能都会以相似的方式破坏发育过程，而功能丧失等位基因仅会产生轻微的表型影响。

图2. 受累个体表现出面部特征和肢体异常。(A至D) 4月龄(A)、14月龄(B)和28岁(C、D)的受累个体。该个体表现为上睑下垂、眉弓高、鼻根宽、唇薄、耳廓后旋。(E至H) 29岁的受累母亲(E、F)及其受累子女(G、H)，11月龄时表现为上睑下垂、眉弓高、睑裂下斜、低位耳、上唇薄，同时存在肩、手、肘畸形以及腕关节挛缩(P)。(I) 18岁的受累个体，表现为前额发际线高、上睑下垂、睑裂下斜。(J至L) 受累婴儿表现为哭貌不对称、鼻背宽平。(M至P) 受累个体表现出肢体异常，包括短指症(M至O)。

MAP4K4功能的增强与减弱均会引发相似的表型

为比较不同变体异位表达 MAP4K4 诱导的表型输出，我们进行了层次聚类分析（图 5B）。聚类分析对 DN MAP4K 4{D153 N} 进行了排序，且MAP4K4 {R 152 W}以及低功能型 MAP4K4 4{18155} 与 MAP4 K 4{W T} 的相似性，高于与弱效DN变异体或功能缺失等位基因的相似性。因此，这些汇总数据表明，在发育背景下，增加或减少功能性MAP4K4的数量均会产生相似的表型结果。

与这一假设一致，用 MAP4K4 抑制剂 PF06260933 处理斑马鱼胚胎以耗尽内源性 Map4k4，会以剂量依赖性方式导致发育缺陷。幼虫在受精后第3天（3 dpf）出现心脏水肿、眼睛变小和卵黄畸形，在受精后第5天（5 dpf）还出现胸鳍发育异常（CFA）（图6，A和B）。暴露于更高剂量的抑制剂后，异常胚胎的发生率增加（图6C），而体长和颌长均缩短药物治疗（图6，D和E）。这些表型与MAP4K4过表达胚胎所观察到的表型高度相似。

图 3. MAP4K4 变异导致功能丧失（LOF）（A）显微注射变异型 MAP4K4 的幼鱼在受精后 3 天（dpf）成像，代表性侧面观图示。异位表达 MAP4K4 引发发育缺陷，包括颅面畸形（实心箭头）、脑积水（空心箭头）、泄殖腔缺陷（实心方块）。幼鱼按变异在蛋白上的位置从上到下（N 端到 C 端）排列。（B–E）发育缺陷以占总幼鱼的百分比定量。（B）躯体缺陷包括背侧弯曲（）、腹侧弯曲（）、侧向弯曲（）及截短（空心方块）。（C）眼部缺陷包括缺损（$）、独眼（#）、小眼（~）。（D）心脏缺陷表现为心包水肿（^）。（E）卵黄囊缺陷包括卵黄延伸部增厚（实心箭头）与卵黄缩窄缺失（虚线箭头）。（F）体长经测量并以溶剂注射对照组（Veh）均值归一化；野生型 MAP4K4 与错义变异可缩短体长，截短变异影响较小。比例尺：500 μm（A）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

为了证实MAP4K4药物抑制实验的观察结果，我们对内源性map4k4转录本进行了敲除。我们获得了一种靶向13号外显子供体位点的剪接阻断吗啉代寡核苷酸（MO），通过对注射6纳克或9纳克吗啉代寡核苷酸的胚胎进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）验证了外显子跳跃，并完成了克隆和测序实验。为确认73个碱基对的缺失引发了移码突变和提前截短（图S1，A至C），我们接下来通过-1.4col1a1:egfp转基因的活体自动成像技术，在3天龄（dpf）时评估了注射不同剂量吗啉代寡核苷酸（MO）的幼虫下颌表型。与我们使用MAP4K4抑制剂化合物的观察结果一致，我们发现颅面角度（CFA）呈剂量依赖性加重，表现为角舌骨角扩大和下颌缩短，而体长仅在（注：原文此处未完整给出后续内容）最高剂量（图7，A至C；以及补充图1，D至H）。此外，我们向cmlc2:gfp心脏报告基因胚胎中注射了MO，并注意到在受精后2天的最大舒张期，心房和心室腔的大小显著增加，这是人类病例中心脏缺陷的直接替代指标。共注射MAP4K4 {WT } mRNA可显著挽救心脏腔室大小和颌部表型（图7）。

图 4. 异位表达 MAP4K4 在受精后 5 天引发颅面畸形（A）阿辛蓝染色颌骨软骨的代表性腹面观。灰色示意图示软骨结构，红色箭头示麦克尔软骨与角舌软骨中线间距。畸形包括软骨形态异常（箭头）、角舌软骨夹角增大（箭头头）、软骨双侧异位（双向箭头）。（B）颌骨长度经测量并以溶剂注射对照组均值归一化；野生型 MAP4K4 与错义变异可缩短颌骨。（C）畸形发生率以占总幼鱼的百分比定量。比例尺：200 μm（A）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图 5. 上调与下调 MAP4K4 对发育产生相似影响（A）受精后 11 小时（hpf）测量长宽比（示意图中 a/b）。野生型与亚效等位变异降低长宽比，功能丧失（LOF）变异无影响，显性负效（DN）变异使胚胎伸长。（B）定量表型指标的层级聚类将显性负效等位基因归为表型更接近野生型，而非功能丧失型。方框内为各指标 P 值，无符号为无显著改变。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

MAP4K4是斑马鱼胚胎早期RAS信号通路的负调控因子

内源性Map4k4功能的丧失会影响与患病个体相似的组织，这支持了MAP4K4功能丧失会导致类RAS病的模型。因此，MAP4K4在早期阶段作为RAS信号通路的负调控因子斑马鱼胚胎（图5A）。为验证这一点，我们检测了MAP4 K 4{W T}抑制过度活跃RAS信号通路的能力，该信号通路可通过异位表达MEK 1{F 53 L}信使RNA（44）——一种癌症相关变异体（图8A）来诱导。信号通路激活增强会导致胚胎在受精后11小时出现伸长表型。共表达MAP4K4 4{WT }可显著挽救这一形态缺陷，而相比之下，功能缺失型变异体MAP4K4 4{L 889 X}仅能部分改善长宽比的伸长情况。因此，在胚胎中提高MAP4K4的表达水平可抵消RAS通路活性增强所带来的形态学影响，这与MAP4K4作为通路负调控因子的作用一致。

我们还检测了在表达 MAP4K4 {D 153 N} 时观察到的胚胎伸长是否由过度活跃的 RAS 信号通路引起。我们用 MEK 抑制剂 PD0325901 或成纤维细胞生长因子受体（FGFR）抑制剂 SU5402 处理了注射后的胚胎（图8B）。使用任一药物处理均降低了载体注射胚胎以及表达 MAP4K4 {D 153 N} 的胚胎的纵横比。综合这些数据可知，在MAP4K4敲除的情况下，胚胎的伸长是通过增强的RAS信号通路介导的。

图 6. 药理抑制 Map4k4 影响与患者受累组织相似（A、B）野生型胚胎经不同剂量 MAP4K4 抑制剂 PF06260933 处理。（A）3 dpf 时，Map4k4 抑制引发发育缺陷，包括躯体缩短、小眼（~）、泄殖腔缺陷（实心方块）、心包水肿（^）、卵黄延伸部增厚（箭头）或卵黄缩窄缺失（虚线箭头）。代表性侧面图示。（B）5 dpf 颌骨软骨阿辛蓝染色的代表性腹面观。高剂量下心包水肿遮挡颌骨。黑色虚线勾画出头部，红色虚线勾画出水肿心脏，红色实线示角舌软骨与麦克尔软骨间距。（C–E）异常率（C）、体长（D）、颌骨长度（E）定量显示缺陷随剂量升高而加重，躯体与颌骨呈剂量依赖性缩短。比例尺：500 μm（A）、200 μm（B）。*P<0.05；**P<0.01；****P<0.0001。

我们进一步在分子水平上验证了 MAP4K4 影响 RAS 信号通路这一假设。向胚胎注射 MAP4K4WT 后，在原肠胚形成50%阶段提取蛋白质，此前我们已证实，该时间点 RAS 通路的过度激活会导致胚盘边缘双磷酸化 ERK（dpERK）水平升高。我们进行了蛋白质印迹实验，利用 ImageJ 对条带强度进行定量分析，并将 dpERK 的水平相对于总 ERK 的含量进行标准化（图8C）。

与癌症相关的MEK变体MEKF53L的过表达会增强RAS信号传导，该变体的过表达导致双磷酸化ERK（dpERK）的含量增加，与该通路的过度激活相符。相反，与未注射的对照组胚胎相比，野生型MAP4K4（MAP4K4WT）的过表达使dpERK的含量出现统计学上显著的降低，这表明提高MAP4K4的水平会在分子层面抑制RAS信号通路。这种降低的幅度小于MEKF53L过表达所引起的变化程度，但与我们在11小时受精后（hpf）观察到的现象一致——MAP4K4WT过表达对胚胎长宽比的影响小于MEKF53L过表达的影响（图8B）。这很可能是因为MEKF53L与癌症相关，而非与RAS神经皮肤综合征相关，且癌症相关突变对通路的破坏更为严重。因此，提高胚胎中MAP4K4的水平可以抵消这种形态学上的影响增加 RAS 通路活性的效应，这与其作为通路负调控因子的作用一致。

讨论

本研究首次报道MAP4K4基因是一种临床表现与RAS病综合征存在重叠的全新综合征的致病基因。本研究在21个家系的26名患者中发现了这些杂合致病变异。患者均表现出影响脑、心脏及面部发育的重叠临床特征。携带MAP4K4基因罕见变异的患者需接受临床评估，因为他们存在发育迟缓、心脏病、肾病、听力损失、身材矮小及神经行为异常的风险。

斑马鱼的功能研究表明，MAP4K4 变异体会导致功能低下、功能丧失或显性负效应。在我们的队列中鉴定出的错义变异体大多集中在激酶结构域内（图1A）。Arg{152} 和 Asp {153} 均位于催化环的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序内，而 Gly {173} 位于激活环内，靠近腺苷(5')-三磷酸（ATP）结合区域。这些残基处的变异体均表现为显性负等位基因，这与激酶活性降低且不影响蛋白质相互作用的结果一致。

预期截短变异体会使蛋白功能丧失，但此前关于CNH结构域功能的研究结论相互矛盾（10, 11）。在本研究中，在p.Ser17、p.Pro232、p.Leu864或p.Val1068位点截短MAP4K4均导致了蛋白的丢失p.Val1093Ter 蛋白包含完整激酶结构域、域间序列以及一半的 CNH 结构域序列，而 p.Ser17Ter 蛋白则不包含任何功能性结构域。这可能意味着截短型蛋白无论长度如何都无法正确折叠，或者完整的 CNH 结构域是蛋白发挥功能所必需的。

图 7. map4k4 敲低导致斑马鱼幼鱼颅面模式与心脏表型改变（A）3 dpf 时对照、吗啉代（MO）、MO + 野生型人源 MAP4K4 mRNA 挽救组的代表性腹面观软骨荧光图。白色虚线标示角舌软骨（CH）夹角；垂直虚线示麦克尔软骨（MK）至 CH 距离。（B、C）3 dpf 腹面 GFP 图像中 CH 夹角与 CHMK 距离定量。（D）2 dpf 心脏 chambers 的代表性腹面观荧光图。（E、F）2 dpf 舒张期心房与心室面积定量。所有指标均归一化为同期对照组百分比。比例尺：300 μm（A）、200 μm（D）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；n.s. 无统计学差异。

一部分已识别的变异体会破坏经典剪接位点序列（图1B），但没有可用的样本用于mRNA剪接的实验检测。c.695-3del变异会破坏一个剪接接受位点，我们预测这将导致后续外显子的跳跃。外显子9的缺失预计会引发移码突变（p.Pro232ArgfsTer8），我们通过构建p.Pro232Ter变异体对其进行了模拟，证实该突变属于功能缺失型变异。c. 639+1 G>C变异会破坏一个剪接供体位点，我们预测该变异会在剪接过程中导致其上游的外显子7发生跳跃。外显子7的缺失预计会导致蛋白质发生移码突变（p.Leu169fsTer2），这很可能是一个功能缺失型等位基因。

通过对部分变异体的功能数据进行外推，我们可以对等位基因系列做出预测（表2）。我们无法排除无义介导的降解在患者体内导致翻译前mRNA降解的可能性，如此一来，无论变异体预测结果如何，该蛋白质都将永远无法表达。此外，我们对截短变异体进行了基因工程改造，使其引入终止密码子而非移码突变。因此，移码变异体在患者体内的作用机制可能与我们的过表达实验略有不同。不过，我们的数据表明，所有变异体都会降低蛋白质的功能，即便其作用方式是减少所表达的mRNA数量。

此前研究表明，MAP4K4 是胚胎发育所必需的。在果蝇中，MAP4K4 的同源物 misshapen 参与胚胎发生过程中的背侧闭合。有研究报道，通过吗啉代寡核苷酸（MO）敲低斑马鱼中的 MAP4K4 会导致轻度原肠胚形成缺陷，但未对该缺陷进行深入表征。小鼠中 Map4k4 基因的完全缺失会导致胚胎致死，引发尾部截断；而内皮细胞特异性缺失 Map4k4 则会导致血管缺陷及出生后早期死亡。然而，从成年小鼠体内敲除 Map4k4 对组织稳态几乎没有影响。

MAP4K4在调控RAS通路中的具体功能目前仍不明确。研究表明，MAP4K4可与成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）结合，FGFR1是一种通过RAS进行信号传导的受体酪氨酸激酶（RTK），且是介导成纤维细胞生长因子（FGF）诱导信号传导所必需的物质。此外，MAP4K4能够抑制蛋白磷酸酶2A（PP2A），而PP2A本身可通过使细胞外信号调节激酶（ERK）去磷酸化来使信号传导失活。用丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）抑制剂处理注射了MAP4K4 {D 153 ~N}的胚胎，可阻止胚胎轴的伸长，这提示MAP4K4可能在MEK上游抑制RAS信号传导。这一结论排除了MAP4K4通过作用于ERK的PP2A来调控该通路的可能性。因此，有研究报道MAP4K4对PP2A的作用可正向调控该通路，而本研究发现MAP4K4是信号传导的抑制剂。

有研究还报道，MAP4K4 是抑制 RAS 信号传导并维持内皮细胞命运所必需的，其机制可能是通过激活 Ras p21 蛋白激活因子 1（RASA1）——这是一种能促进 RAS 失活的三磷酸鸟苷酶（GTPase）激活蛋白。由于 RASA1 位于 MEK 上游，可通过增强 RAS 的 GTPase 活性来抑制信号传导，因此它是影响 MAP4K4 在该通路中作用的潜在候选因子。研究证实，RASA1 可与 MAP4K4 相互作用，通过抑制信号传导来维持小鼠体内的内皮细胞命运，不过其作用还不止于此血管生成。此外，RASA1 参与多种疾病的发病机制，包括冠心病和癌症；而 MAP4K4 也与癌症相关，本研究将其与冠心病联系起来。因此，MAP4K4 对 RAS 信号通路的影响可能通过 RASA1 介导，不过也可能涉及其他作用靶点。MAP4K4也已知可通过c-Jun N端信号通路发挥作用，这一点值得在后续实验中进行验证。

图 8. MAP4K4 是 RAS 信号的负向调控因子（A）胚胎共注射持续激活型 MEK 变异（MEK1^{F53L}）与 MAP4K4 变异。11 hpf 成像并计算长宽比。MEK^{F53L} 使胚胎伸长，野生型 MAP4K4 可挽救，而 LOF 变异 MAP4K4^{L889X} 挽救能力弱。（B）胚胎注射 MAP4K4^{D153N} 后用 MEK 抑制剂 PD0325901 或 FGFR 抑制剂 SU5402 处理。11 hpf 成像并计算长宽比。抑制配体结合或 MEK 活性可挽救 MAP4K4^{D153N} 引发的伸长。（C）Western blot 并定量磷酸化 ERK（dpERK）相对总 ERK 水平。比例尺：250 μm（A、B）。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

MAP4K4 很可能是单倍剂量敏感的。这与我们的研究结果一致，即 MAP4K4 的水平必须维持在一定的活性范围内，以促进正常的胚胎发育。这一结论可由以下事实解释，即某些变异体增强 RAS 信号传导最终可能导致通路活性降低。考虑到增强和减弱 MAP4K4 功能所产生的表型效应具有相似性，本研究中观察到的许多发育缺陷可能是由信号传导下调引起的。若情况如此，那么提高野生型 MAP4K4 的水平会抑制信号传导，而通过提供显性负性 MAP4K4 降低蛋白功能则会首先导致通路激活，随后因负反馈作用出现下调。这一事实在癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等病症中检测到MAP4K4的含量升高，而降低MAP4K4的活性能够改善疾病状态，这进一步证明了将MAP4K4维持在适宜水平至关重要。

总之，我们将 MAP4K4 纳入了可能与类 RAS 病发育性疾病相关的基因库。有观点认为，针对性降低 MAP4K4 活性可能是治疗多种疾病的一种方法，然而我们研究表明，MAP4K4功能的废除也与疾病相关。因此，我们研究的意义在于，必须注意避免过度降低其活性，以免加重疾病。尽管存在这一注意事项，MAP4K4仍是人类中通过药理学调节RAS信号传导的一个有吸引力的靶点。

表2. MAP4K4变异体对蛋白质功能的预测影响。DN，显性负性；LOF，功能丧失；CNH，柠檬同源；ATP，5'-三磷酸腺苷。

材料与方法

本研究已获得费城儿童医院机构审查委员会（IRB）的批准。研究纳入的所有个体参与者均已签署知情同意书。对于本研究中包含身份识别信息的所有个体参与者，也已额外获取其知情同意书。

外显子组和基因组测序

从患病儿童及其父母的全血中提取了基因组DNA。原始患者的入组经费城儿童医院机构审查委员会（IRB）批准。外显子组或基因组测序采用多种标准捕获试剂盒进行，变异分类的通用判定标准遵循美国医学遗传学与基因组学学院、分子病理学协会（ACMGG/AMP）的指导原则。这些患者在采用显性或隐性模型进行过滤和分析后，未发现其他可解释其表型的变异。

斑马鱼品系与饲养

斑马鱼的饲养及所有实验均按照普林斯顿大学或西北大学机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。使用PWT品系进行mRNA注射；-1.4col1a1:gfp和cmlc2:gfp转基因品系用于map4k4敲降研究。胚胎在28℃下培养至表型终点。

斑马鱼胚胎的药物处理

胚胎收集后立即加入PF06260933（Sigma-Aldrich），终浓度为1、5或10微摩尔。第二天换水并加入新鲜药物。为抑制MEK，将二甲基亚砜（DMSO）中的PD0325901（Sigma-Aldrich）加入至终浓度1微摩尔，而二甲基亚砜中的FGFR抑制剂SU5402（Sigma-Aldrich）使用浓度为5微摩尔。此前研究表明这些浓度可挽救由MEK引起的胚胎伸长缺陷。对照组胚胎用等量DMSO处理。两种药物均从受精后4.5小时开始添加，直至成像。

克隆与定点诱变

pDONR223-MAP4K4 是 W. Hahn 和 D. Root 赠送的质粒（Addgene，质粒编号 23486）。该构建体包含人 MAP4K4 转录本变异体 13（NM_001384485.1），缺失了六个核苷酸（Δ2078–2083）。将人 MAP4K4 序列亚克隆至 pCS2+ 载体中，并融合 mCherry 标签及 p2A 终止序列。将质粒转化至 5-alpha 感受态细胞（New England Biolabs）中，随后使用 QIAprep 旋转微量质粒提取试剂盒（QIAGEN）或 Quantum Prep 中量质粒提取试剂盒（Bio-Rad）进行纯化。设计重叠引物（Integrated DNA Technologies），使其包含与受累个体中鉴定到的变异对应的碱基改变，该引物购自 Integrated DNA Technologies，用于 PCR 反应以引入对质粒序列进行了修改。序列修改通过桑格测序（GeneWiz）进行了验证。

斑马鱼的mRNA转录与显微注射

根据制造商的说明使用mMESSAGE mMACHINE Sp6试剂盒（Invitgen）生成mRNA，并使用NanoDrop One（Thermo Fisher Science）进行定量。使用PV820气动PicoPump（世界精密仪器）如上所述注射胚胎。在一至四个细胞阶段的胚胎注射150 pg MAP4K4 mRNA和/或55 pg MEK mRNA悬浮在500 pl苯酚红（phenolsulfonphthalein；5毫克/毫升）/0.2 MKCl中。车辆注射的胚胎接受500 pl苯酚红（5毫克/毫升）/0.2 MKCl。对于每个变体，至少注射三个离合器，每个离合器至少有30个胚胎，mRNA至少在两个不同的场合产生。

斑马鱼中 map4k4 的瞬时抑制

设计了一种阻断剪接的吗啉代寡核苷酸（MO），靶向斑马鱼（Danio rerio）map4k4基因的13号外显子剪接供体位点（ENSDART00000165230.2；e13i13；Gene Tools公司）。向1至4细胞期的斑马鱼胚胎中注射1纳升不同剂量（3纳克、6纳克和9纳克）的吗啉代寡核苷酸。按照制造商说明书，使用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技公司）从2天龄（dpf）的胚胎群（每个条件30只动物，包括对照组和注射吗啉代寡核苷酸的实验组）中提取总RNA，以验证吗啉代寡核苷酸的敲减效率。使用QuantiTect逆转录试剂盒（凯杰公司）合成互补DNA（cDNA）。通过侧翼引物对吗啉代寡核苷酸的靶标进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），将扩增得到的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。切下目的条带，使用QIAquick凝胶提取试剂盒（凯杰公司）纯化PCR产物，然后将其克隆至TOPO-TA载体（赛默飞世尔科技公司）中。按照标准程序，使用BigDye 3.1终止子化学试剂对从阳性菌落中提取的纯化质粒（n=4 per) PCR产物）进行测序。通过注射9纳克map4k4吗啉代寡核苷酸和150皮克野生型（WT）人MAP4K4信使RNA（mRNA）开展拯救实验。

斑马鱼颅面分析的阿尔辛蓝染色

幼鱼在受精后5天被处死，固定于4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜。幼鱼经PBS洗涤后，通过梯度乙醇脱水至70%乙醇，随后置于0.04%阿尔辛蓝8GX/50 mM MgCl_{2}/70%乙醇中，4℃孵育过夜。经70%乙醇多次漂洗后，胚胎经梯度乙醇复水至0.1%吐温20/PBS，用2%氢氧化钾洗涤，在1% H_{2} O_{2} / 2% 2%氢氧化钾中脱色，再用2%氢氧化钾洗涤，最后经梯度甘油处理至80%甘油/2%氢氧化钾中进行成像。

斑马鱼成像与分析

使用配备 DFC365FX 或 DFC450C 摄像头配件的 Leica M205 FA 体视显微镜对注射了 mRNA 的胚胎进行成像。对于3天龄（3 dpf）的胚胎成像，将胚胎固定在三卡因（乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐；0.08毫克/毫升；Sigma-Aldrich）中，图像采集后移除该试剂。手动对每个胚胎的表型异常进行评分，并将发生率计算为注射该条件的所有胚胎的百分比。

MO 注射的斑马鱼幼虫在受精后第3天用三卡因麻醉，借助安装在蔡司 Axio Imager.M2m 显微镜上、配备10倍物镜的脊椎动物自动筛选技术（VAST）生物成像仪对其颅面特征进行成像物镜镜头。幼虫在检测平台上依次通过一根600毫米的毛细管。借助VAST软件（1.2.6.7版，在自动成像模式下运行，最低相似度阈值设为70%）中预设的模板设置，可自动检测每只幼虫并对其定位，以获取腹侧[绿色荧光蛋白（GFP）]或侧视（明场）图像，具体操作如前文所述。我们使用蔡司Axiocam 503单色相机及蔡司ZenPro软件，对腹侧定位的幼虫拍摄荧光图像。在心脏表型分析实验中，于受精后2天，借助尼康AZ100显微镜及尼康相机（由尼康NIS-Elements软件控制），对活体胚胎腹侧的GFP信号进行拍摄。在原肠胚形成阶段胚胎的长宽比表型分析实验中，于受精后11小时，使用尼康SMZ745体视显微镜及尼康数码显微微镜拍摄明场图像。

使用ImageJ测量了11小时胚胎阶段卵黄长轴和短轴的长度、3天胚胎阶段胚胎的长度、3天和5天胚胎阶段角舌骨的角度以及角舌骨与梅克尔软骨之间的距离，还测量了2天胚胎阶段心腔的面积。测量时实验人员对实验条件不知情，且将数据标准化为赋形剂注射对照组的平均值，以便合并多批胚胎的数据。采用Bonferroni校正的单因素方差分析（ANOVA）对整组进行比较，同时采用配对t检验将变异体注射胚胎与赋形剂注射对照组进行比较。层级聚类分析通过RStudio完成。

蛋白质提取与蛋白质印迹法

将100个注射后的胚胎置于链霉蛋白酶溶液（1.3毫克/毫升；Sigma-Aldrich）中，于28℃下孵育5分钟，随后在胚胎发育至外包期50%时通过振荡去除卵膜。胚胎用E3缓冲液（5毫摩尔氯化钠、0.17毫摩尔氯化钾、0.33毫摩尔氯化钙CaCl_{2}和0.33毫摩尔MgSO_{4}）冲洗三次，重悬于200微升E3缓冲液中，通过吹打进行匀浆。加入1毫升0.5倍林格氏液（50毫摩尔氯化钠、10毫摩尔氯化钾、1.25微摩尔NaHCO_{3}，涡旋振荡样品后，通过离心[300倍相对离心力，1分钟，4℃]沉淀细胞。细胞重悬于50微升裂解缓冲液[20毫摩尔三羟甲基氨基甲烷（pH 8.0）、50毫摩尔氯化钠、2毫摩尔乙二胺四乙酸、1%伊格尔特罗宁CA-630、200微摩尔苯甲基磺酰氟]中，并加入蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich），随后离心去除细胞碎片（14000倍相对离心力，10分钟，4℃）。加入NuPAGE十二烷基硫酸钠样品缓冲液和还原剂（赛默飞世尔科技），于100℃煮沸10分钟，制备等量的蛋白质裂解物。采用4%至12%的三羟甲基氨基甲烷-双丙烯酰胺NuPAGE凝胶和XCell SureLock迷你细胞电泳系统（赛默飞世尔科技），按照制造商的说明书进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜（Li-COR）上，用含5%奶粉的1%吐温20/磷酸盐缓冲液（PBT）进行封闭，以1:1000的稀释度将一抗（细胞信号技术公司）加入5%牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）/PBT中孵育。膜在4℃下振荡孵育过夜，随后用PBT洗涤。以1:5000的稀释度将荧光标记的二抗（Li-COR、赛默飞Invitrogen）加入5%牛血清白蛋白/PBT中，膜在室温下振荡孵育1小时，再用PBT洗涤。使用Azure 600成像仪对膜进行成像，并用ImageJ定量条带强度。