结节性硬化症斑马鱼模型中TrkB过度活跃导致脑连接异常、癫痫发生和焦虑

题目：TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of Tuberous Sclerosis Complex

原文链:https://www.pnas.org/content/117/4/2170.full.pdf

期刊:Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

结节性硬化症（TSC）是一种罕见的遗传性疾病，早期症状即可显现，包括皮质畸形、儿童期癫痫以及结节性硬化症相关神经精神疾病（TANDs）。皮质畸形发生于胚胎发育阶段，此前研究已证实其与儿童期癫痫存在关联，但二者关系的潜在机制仍未被充分阐明。斑马鱼已成为研究基础神经发育的便捷模型，但如果缺乏深入的功能分析，Tsc2基因缺陷斑马鱼品系无法用于TANDs研究或新药筛选。本研究发现，斑马鱼中Tsc2基因的缺失会导致其大脑皮层（与哺乳动物皮层同源）出现异位灶形成以及mTorC1通路过度激活。研究人员观察到斑马鱼存在连合纤维变薄现象，这一现象是导致大脑连接异常的原因，重现了人类患者的结节性硬化症病理特征。Tsc2基因缺失还会延迟轴突发育，并导致异常的神经束束状化，这与轴突导向相关基因的异常表达相吻合。该突变体斑马鱼发生癫痫形成，出现非运动性癫痫发作，且表现出焦虑样行为增加的特征。研究人员进一步将运动活动的具体参数与癫痫样和焦虑样行为关联起来，而抑制酪氨酸受体激酶B（TrkB）信号通路可逆转这些行为异常。此外，与氨己烯酸和雷帕霉素的治疗效果相比，TrkB抑制能改善大脑连接异常和焦虑样行为。这些数据表明，连合纤维变薄会导致焦虑调控异常，为大脑解剖结构与人类TANDs之间建立了机制关联。本研究结果还揭示了TrkB信号通路在结节性硬化症复杂病理过程中的作用，并明确了一个治疗靶点。

结节性硬化症 | 结节性硬化症相关神经精神疾病 | 脑连接异常 | 焦虑症 | 酪氨酸受体激酶B

结节性硬化症（TSC）是一种常染色体显性遗传病，由TSC1或TSC2基因的功能丧失性突变引起（1），这两个基因的编码产物形成的复合物可负向调控雷帕霉素机制性靶点复合物1（mTORC1），而mTORC1是神经元正常发育所必需的复合物。在结节性硬化症患者中，癫痫是最主要的神经系统症状，该症状多在出生后第一年出现，且常发展为难治性癫痫。癫痫还伴随结节性硬化症相关神经精神障碍（TANDs），包括智力障碍（ID）和焦虑症。目前认为，癫痫由皮质畸形引发，这类畸形包括结节性硬化症中的脑回异位、结节以及白质（WM）连接异常。结节通常可在胎儿期被诊断出来，这表明结节性硬化症的病理改变发生于胚胎发育阶段。

皮质畸形会导致儿童癫痫以及多种其他疾病中出现难治性或治疗抵抗性癫痫发作，这凸显了皮质正常发育的重要性。现有的哺乳动物TSC模型在许多方面模拟了人类疾病，包括皮质畸形和癫痫发作。然而，这些模型在研究TSC患者方面存在困难胚胎发育期间的病理学过程中，会出现导致癫痫发生的皮质畸形。因此，本研究全面考察了斑马鱼的大脑发育与行为表现。斑马鱼的胚胎在体外发育且身体透明，这为在活体状态下研究神经元早期发育提供了契机。尽管斑马鱼本身并不具备皮质结构，但存在与之同源的组织，且大部分同源组织定位于大脑皮层。

先前的研究探究了tsc2{vu242}突变斑马鱼作为结节性硬化症（TSC）模型的效用，报道了其背侧大脑半球白质（WM）结构存在异常（包括白质因异位细胞体而遭到破坏）、运动能力下降，以及视顶盖脑区出现异常的脑部活动。然而，这些研究并未深入阐述潜在的疾病机制。此外，tsc2{1u242 / u 242}突变体中未探究出可模拟人类结节性硬化症相关神经发育障碍（TANDs）症状的神经行为改变。因此，本研究对发育过程中脑部连接性的变化进行了深入分析。我们评估了tsc2{u2 sqrt{2}鱼的行为表现，并将癫痫发作活动和焦虑样行为与运动的具体参数相关联。最后，我们测试了药物挽救结节性硬化症相关表型的能力，发现抑制酪氨酸受体激酶B（TrkB）信号通路可逆转脑部连接异常和癫痫发生。

研究意义

结节性硬化症（TSC）是一种遗传性疾病，表现为早期脑畸形、儿童期癫痫以及结节性硬化症相关神经精神障碍（TANDs）。皮质畸形于子宫内形成，此前已被证实与儿童期癫痫相关。体外发育的斑马鱼似乎是研究基础神经发育的便捷模型；然而，若缺乏深入的功能分析，Tsc2缺陷型斑马鱼无法用于结节性硬化症相关神经精神障碍的研究。本研究发现，Tsc2缺陷型斑马鱼在解剖学和行为学层面重现了结节性硬化症患者的症状，包括异常的脑形态、脑连接变薄、癫痫发生以及焦虑样行为增加，而降低TrkB信号通路可逆转这些症状，这一发现揭示了潜在的药物靶点。此外，本研究证实连合纤维变薄会导致焦虑调控异常，从而建立了脑解剖结构与情绪之间的关联。以及类似焦虑的行为。后者的表型也可通过抑制 Rac1 来逆转，而 Rac1 可能是 TrkB 的下游靶点之一。

结果

Tsc2缺失会导致斑马鱼白质损伤与脑连接异常。白质（WM）结构破坏是结节性硬化症（TSC）的常见特征，此前研究已在tsc 2{vu242i v242}突变体的端脑中发现该现象。 具体而言，我们对tsc2{1 u 242}斑马鱼的端脑进行检测时，通过二维（2D）脑切片成像（图1A）和三维（3D）全脑成像（补充信息附录，图S1A），证实tsc2{2u242 h u 242}区域存在异位细胞体。 这些细胞在丝氨酸235和236位点的磷酸化核糖体蛋白S6（P-Rps6）水平更高（图1 B、C及补充信息附录，图S1 (B-E），表明mTorC1通路过度激活。 与tsc2{+/+}斑马鱼的脑皮层细胞相比，tsc2{vu242iv242}突变体脑皮层中P-Rps6阳性细胞的信号强度更高、细胞体更大（图1 D、E及补充信息附录，图S1 D、E）。 我们还测量了主要脑连合的厚度，因为人类TSC患者存在与癫痫发作及认知功能恶化相关的白质连接异常。 tsc 2{vu242/vu242}前连合（AC）负责连接端脑中的脑半球，该结构其厚度低于 tsc2{+/+} 号鱼（图2A及附录图S24）。tsc2{vu242 /vu242} 号突变体的视后联合也更薄，而外侧束的大小与 tsc 2{+/+}号鱼相似（补充附录图S2 B和C）。双重免疫染色结果显示，P-Rps6 阳性细胞的数量越多，与AC的厚度呈负相关（图2 A和B）。

为评估可能导致白质（WM）变薄的轴突发育情况，我们将tsc2{2u232}品系与Tg(ptf1a:GFP)转基因背景杂交，并通过活体光片成像对其进行检测。后结节中ptf1a:GFP阳性神经元的轴突向后联合延伸，在此处穿过脑中线并投射至对侧脑半球（图2C）。在tsc2{+/+}品系中，单个脑半球的ptf1a:GFP阳性轴突以一束的形式穿过脑边界。tsc2{vu242 / v u 242}品系中的同类轴突则表现出轴突束形成异常（图2D）。我们能够区分出轻度轴突表型（例如，一束轴突中有一根未穿过中线）和轴突束形成的严重异常（例如，轴突随机穿过中线；补充材料附录图S3A）。对tsc2{vu242}品系ptf1a:GFP阳性轴突的定量形态学分析证实，tsc2{wu242hu242}品系斑马鱼存在轴突束形成受损的情况，表现为其中线处的交叉数量高于tsc2{+/+}品系（图2E）。此外，tsc2{vu242 / w 242}品系中的ptf1a:GFP阳性束并未形成平行束，与呈现出两个平行束的 tsc2{+/+} 形成对比（图2F）。

图1。tsc2wu242wu242 表现出端脑白质（WM）损伤和mTORC1激活。(A) 前连合（AC）冠状切面中灰质和白质（WM）的结构。圆圈代表细胞体。展示了用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的tsc2 2{w 242} 脑切片的样本照片，以及(tsc2 20242) 鱼脑白质区细胞体的相对数量[H=24.443、P=4.92 ×10{-5}：P=3.1 ×10{-6}对应tsc2 与tsc2 2{+1+}，P=0.017对应tsc2 与tsc c{2+1+}（邓恩检验）]。（比例尺，40微米。）(B) 用抗磷酸化核糖体蛋白S6（P-Rps6）抗体（绿色）免疫染色的端脑冠状tsc2 20242 切片的代表性图像。S为腹侧端脑。[比例尺，40和20微米（放大倍数）。](C) tsc2wu242 鱼端脑中P-Rps6阳性神经元的数量H=18.88、P=7.95 ×10{-5}、P=0.00071 对应tsc2vu242/vu242 与tsc2+/+。P=0.00117 对应tsc2 与tsc2（邓恩检验）]。(D) tsc2 200242、[F=6.772、P=0.00335 鱼中每条鱼端脑细胞的平均P-Rps6磷酸化水平5；tsc2u242vu242 对应tsc2 2{+/+}、P=0.0696 对应tsc 2{wu242wu242 } vs。tsc2 2{vu242i+}（邓尼特检验）]。(E) tsc2 24242、[F=21.48、P=9.3 ×10{-7} 鱼中每条鱼端脑P-Rps6阳性神经元的平均胞体大小：tsc2vu242/vu242 对应tsc2+++，tsc2vu242wu242 对应tsc2 2{w 242 /+}（邓尼特检验）]。*P<0.05、***P<0.005

图2. tsc2vu242vu/242 表现出由异常轴突伸长引起的WM连接障碍。(A) 通过tsc2vu242脑的水平光学切片代表性图像，用抗乙酰化微管蛋白（ac-Tubulin；红色）和抗P-Rps6（绿色）抗体双重免疫染色，显示AC（虚线）在受精后7.5天的情况，以及AC宽度的量化 [F = 4.053, P = 0.0202; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+ 的 P = 0.011（Dunnett检验）]。(比例尺, 30 μm)。(B) 脑中P-Rps6阳性细胞数量与AC宽度的相关性分析，显示负Spearman相关性和基因型聚类。(C) 后结核中ptf1a:GFP阳性神经元定位示意图，这些神经元将其轴突背侧延伸并通过后连合穿过脑中缝。(D) 背侧视图的共聚焦代表性图像，显示ptf1a:GFP阳性轴突在中线的轴突束状化情况。量化了各种严重程度的ptf1a:GFP轴突表型的频率。(比例尺, 25 μm)。(E) 对tsc2vu242脑中ptf1a:GFP阳性轴突束在中线的Sholl分析，包括随距胞体3D距离的交叉数 [回归曲线及置信区间；F = 23.84, P = 7.4 × 10^{−11}; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+ 的 P = 2.3 × 10{−6}（Dunnett检验）；n = 16 tsc2vu242/vu242, n = 13 tsc2vu242/+, n = 15 tsc2+/+] 以及平均交叉数和数据分布。对于tsc2+/+，Sholl函数在80到90 μm的距离处收敛于值2，代表每个半球有一条束穿过中线。tsc2vu242/vu242鱼未呈现此趋势，中线处的平均轴突数高于tsc2+/+。(F) tsc2vu242鱼脑中后连合处每个半球的ptf1a:GFP束平行化的频率（n = 27 tsc2vu242/vu242, n = 31 tsc2vu242/+, n = 18 tsc2+/+）。(G) 受精后24小时，tsc2vu242鱼脑中ath5:gap-RFP阳性连合定位示意图。op, 嗅基板；v, 脑室。(H) 正面视图的共聚焦代表性图像，显示ath5:gap-RFP阳性神经元及轴突伸长（白色箭头指示轴突），以及嗅觉内侧束发育过程中各种轴突表型的出现情况 [基因型 × 表型：F = 8.677, P = 8.5 × 10^{-4}; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+ 的 P = 0.077（Dunnett检验）；n = 18 tsc2vu242/vu242, n = 60 tsc2vu242/+, n = 25 tsc2+/+]。(比例尺, 100 μm)。*P < 0.05, ***P < 0.005。

为确定轴突发育损伤是否为突变体的普遍表型，我们从受精后24小时（hpf）开始探究了(Tg(ath5:gap-RFP);tsc2 2{w 242}斑马鱼中ath5:gap-RFP阳性嗅神经元的轴突发育，此时这些神经元伸出轴突并相互接触，通过前连合（AC）跨越半球边界，形成内侧嗅束的先驱（图2G）。与t s c 2{+++}相比，活体tsc 2{1 ×242 / vu 242}突变体中ath5:gap-(RFP)阳性神经元的轴突更常向不同方向异常延伸，或完全不延伸（图(2 H)及(S I)附录图S3B）。这一现象在受精后27小时仍持续存在，此时ath5:gap-RFP阳性轴突在中线处相互接触，tsc 2{++/+}斑马鱼中形成单个束，而tsc 2{1 u 242 N u 242}和tsc 2{1 ×2+2 /+}斑马鱼中轴突排列紊乱，中线跨越存在缺陷（SI附录图S3C）。束束形成的损伤与胶质桥紊乱无关，胶质桥在脑中线处正常形成，允许轴突穿过（SI附录图S3D）。这些发现表明轴突对导向信号的感知或响应存在缺陷。与Rac1相关的导向信号响应通路相关的dock3、dock4和elmo2基因的信使RNA（mRNA）水平升高，进一步支持了这一假设（SI附录图S4A）。与对照组相比，iota sc 2{2u 242 h u 242}斑马鱼端脑中Dock4和Elmo2蛋白的表达增加得到了验证（SI附录图S4 (B-D）。在tsc 2{vu242 h u 242}斑马鱼的前连合（AC）中发现了Elmo2阳性灶，而tsc2{+/+}斑马鱼的前连合（AC）中则无此阳性灶。综上，我们的研究结果表明，Tsc2的缺失会导致连合纤维变薄和脑连接异常，这可能由轴突导向信号紊乱引起。

tsc2 2{vu242/vu242 }斑马鱼癫痫发生能力的增强导致无癫痫发作。大脑连接的改变可能会导致癫痫发生。因此，我们检测了tsc 2{1 ×242}斑马鱼的基础活动，证实t bar{s} c 2{vu242 / v u 242}斑马鱼的运动能力下降（图3A），这与运动和视觉缺陷无关（SI附录，图S5 A和B）。我们还检测了不同速度范围内斑马鱼的活动速度，以更详细地描述其行为。在t s c 2{2 u 2+2 /+}中，过度活跃运动的平均速度（>2 ~cm / s)）高于tsc2+/+斑马鱼的平均速度（图3B），尽管tsc2vu242/vu242斑马鱼在此速度范围内的活动持续时间也有所缩短（SI附录，图S5C）。这些数据表明tsc 2{wut22/u242 }斑马鱼以爆发式方式运动，这可能代表癫痫样或焦虑样行为。

此前有研究报道，在编号为tsc 2{iv242/vu242 }的斑马鱼的视顶盖中存在神经元过度兴奋现象。本研究转而检查了大脑皮层的活动，因为人类结节性硬化症（TSC）患者的大脑皮层被认为是主要的病理区域。我们对编号为tsc 2{v a 242} ; Tg(G C a M P 5 G)的斑马鱼进行了神经元活动的3D延时成像。与对照组相比，编号为tsc 2{wu242 hu242}的斑马鱼其大脑皮层神经元表现出过度兴奋（图3C及补充信息附录图S6A）。 我们还在斑马鱼发育早期检测了致癫痫迹象，因为TSC患者大脑皮层的畸形被认为在发育早期就开始引发癫痫。我们对斑马鱼的自发性尾部甩动和身体卷曲（STFBC）进行了量化分析，此前研究已证实该指标与癫痫相关。编号为tsc 2{1v242 / vu 242}的斑马鱼其STFBC次数有所增加（图3D）。 为进一步验证编号为tsc2{vu242 / v u 242}的斑马鱼是否更易发生癫痫，我们将编号为tsc2{v u 242}的斑马鱼暴露于γ-氨基丁酸受体拮抗剂五甲烯四氮唑（PTZ）中，该物质可在斑马鱼体内诱发阵挛性癫痫样发作。编号为tsc2{v u 242 h u 242}的斑马鱼出现了更多由PTZ诱导的高速癫痫发作，且发作起始时间远早于对照组（图3E、F）。

tsc2{vu242 / v u 242} 表现出癫痫发生和活性降低的特征，这表明非运动性癫痫发作可能导致该表型。为验证这一可能性，我们用乙琥胺对斑马鱼进行了处理，这是一种一种用于治疗人类失神发作的高选择性药物。乙琥胺的急性处理导致了活动亢进，而更长时间的处理则将tsc 2{vu242 hu242}的活动恢复至与对照组相近的水平（图3G）。乙琥胺还恢复了tsc2{vu242 /vu242}的早期死亡率（图(3 I)和(S I)附录，图S6B）。然而，乙琥胺处理后，tsc 2{vu242 / v u 242}鱼的高速游动速度并未恢复（图3H），这表明复杂部分性发作或焦虑是该表型的成因。

tsc2 2{v u 242 / v u 242} 斑马鱼表现出焦虑样行为增加。tsc 2{v u 242 / v u 242}运动速度的加快可能代表焦虑样行为，这在之前的 Tsc2 缺陷型斑马鱼中尚未见报道。我们观察到 tsc 2{vu242/vu242 } 背侧结节中 (ptfla:GFP) 阳性神经元的轴突发育异常（图 2 D-F），这可能导致恐惧/焦虑反应轴的连接发生改变。我们通过对 tsc 2{v u 242} 斑马鱼进行光偏好测试，评估了 tsc 2{v u 242 / v u 242} 是否表现出焦虑样行为。tsc 2{+/+} 斑马鱼在亮区停留的时间更长，这反映了趋光性。tsc 2{v u 242 v u 242} 斑马鱼在暗区停留的时间比 tsc 2{+/+} 更长（图 4A），表明它们对光线无偏好，且焦虑样行为有所降低。我们还发现，与 tsc 2{+/+}相比，t s c 2{1 u 242 / v u 242} 的活动更局限于孔板的边缘区域，这提示其焦虑样行为有所增加。随后，我们分析了 tsc 2{1 u 242}斑马鱼在旷场实验中的活动情况，以测试与新环境和开阔区域相关的焦虑样行为。与 tsc 2{+/+} 相比，tsc 2{1 u 242 / v u 242} 斑马鱼的探索时间更短，且在边缘区域停留的时间更长（图 4B），这表明其焦虑样行为有所增加。

光趋性斑马鱼幼体在黑暗环境中会表现出类似焦虑的行为，进而导致活动亢进。开灯会使斑马鱼出现僵立行为，因为光照条件的突然变化会进一步加剧这种类似焦虑的行为，而斑马鱼天生会将这种变化感知为危险信号。tsc 2{i v 242 / v u 242}突变体在黑暗环境中的活动度高于tsc 2{+/+}。这些突变体在光照条件下的僵立行为也略有增加，但这一增幅与tsc2+/+并无显著差异，而4d67b201-362e-45ff-bbff-f9ab792c9d1c本身的活动度就极低（图4C）。为验证实验设置的有效性，我们让tsc 2{v 2242}斑马鱼分别暴露于抗焦虑药物地西泮或致焦虑药物视黄酸（RA）中。地西泮降低了tsc 2{i u 242 / u 242}及其对照同胞鱼的类似焦虑行为，而视黄酸则增加了tsc 2{+/+}和tsc 2{v u 242 /+}的类似焦虑行为。然而，视黄酸对已经表现出类似焦虑行为增强的tsc 2{v u 242 v u 242}并未产生显著影响（图4D及附录图S7，(S I）。光照阶段间活动幅度的变化也证实了这些结果（图4E）。最终，tsc 2{v i t 242 / v u 242}斑马鱼的皮质醇水平高于其对照同胞鱼（图4F）。

光照偏好测试（图4A）、强光突变测试（图4C）以及皮质醇水平（图4F）的结果表明，冲动控制存在损伤，这与反复暗闪光引发的焦虑及其习惯化形成对比。tsc 2{2u 242 N u 242}对首个惊跳刺激的反应较tsc 2{+/+} 更低或更迟缓，但惊跳习惯化与其他鱼类相似（补充信息附录，图S8）。尽管tsc 2{1 u 242 / i u 242} 的总活动量更低，该个体确实表现出惊跳反应，只是程度弱于同窝对照组。这些结果并未证实冲动性更高，反而表明惊跳刺激引发的僵立行为归因于tsc 2{v u 242 / u 242} 个体预先存在的焦虑水平更高。总体而言，结果证实tsc 2{12242 N u 242} 相较于iota s c 2{+/+} 出现了类焦虑行为的增加，且重现了TANDs 的人类表型。

图 3. tsc2^{vu242/vu242} 突变体表现出活动减少、癫痫发生增加以及对乙琥胺治疗的反应增强。(A) 对 tsc2{vu242} 鱼的活动分析，显示在 1 小时追踪期间，tsc2{vu242/vu242} 鱼（n = 32）与 tsc2{vu242/+} 鱼（n = 85）及 tsc2{+/+} 对照同胞（n = 50）相比，活动量随时间的变化 [F = 2.601, P = 0.0067; tsc2^{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 2.38 × 10^{−9}，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 7.42 × 10{−6}（Dunnett 检验）] 以及累积活动量 [F = 18.61, P = 4.76 × 10{−8}; tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 4.16 × 10{−8}，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 1.22 × 10{−6}（Dunnett 检验）]。(B) tsc2{vu242/vu242} 鱼与 tsc2{vu242/+} 和 tsc2{+/+} 对照相比，高速运动（>2 cm/s）的平均速度 [H = 31.73, P = 1.29 × 10^{−7}; tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 4.8 × 10{−6}，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 2.1 × 10{−7}（Dunn 检验）]。(C) 显示 tsc2{vu242} 鱼 pallium 中（无任何刺激）神经元活动的代表性图像，以及活跃细胞的平均数量，该数量在 tsc2{vu242/vu242} 中增加 [F = 9.638, P = 0.0074; tsc2^{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 0.009，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{+/vu242} 的 P = 0.012（Dunnett 检验）]。（比例尺：30 μm）(D) tsc2{vu242} 鱼的 STFBC 的示例延时照片，以及在受精后 24 小时 [F = 8.59, P = 5 × 10{−4}; tsc2^{vu242/vu242} vs. 其他基因型的 P ≤ 0.001（Dunnett 检验）] 和 32 小时 [F = 7.535, P = 0.001; tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 0.012，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 4 × 10{−4}（Dunnett 检验）] 的量化。（比例尺：100 μm）(E) 每个 tsc2{vu242} 基因型在用 PTZ 处理后的代表性轨迹，显示了整个 20 分钟以及追踪的前 5 秒。图中展示了在追踪的前 10 分钟内，tsc2{vu242/vu242} 鱼与 tsc2{vu242/+} 和 tsc2{+/+} 鱼相比，PTZ 诱导的癫痫样爆发的数量 [H = 34.667, P = 3 × 10{−8}; tsc2^{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 6.8 × 10{−6}，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 9.1 × 10{−8}（Dunn 检验）]。
红色轨迹代表高速运动（>2 cm/s）。绿色轨迹代表自由游动（速度在 0.5 至 2 cm/s 范围内）。黑色轨迹代表自由漂浮（<0.5 cm/s）。(F) 与对照同胞相比，tsc2{vu242/vu242} 鱼首次出现 PTZ 诱导爆发的时间 [H = 26.838, P = 1.49 × 10{−6}; tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{+/+} 的 P = 3 × 10{−4}，tsc2{vu242/vu242} vs. tsc2{vu242/+} 的 P = 2.1 × 10{−6}（Dunn 检验）]。(G) 对用乙琥胺处理的 tsc2{vu242} 鱼的活动分析，显示了在 1 小时追踪期间，tsc2{vu242/vu242}（n = 32）与 tsc2{vu242/+}（n = 56）及 tsc2{+/+}（n = 25）相比，活动量随时间的变化以及累积活动量。急性乙琥胺处理后活动的增加被认为代表了焦虑样行为，表现为无论基因型如何均出现活动过度 [H = 40.312, P = 9.15 × 10{−9}; 未处理的 tsc2{vu242/vu242} vs. 急性乙琥胺处理的 P = 3.9 × 10{−9}，未处理的 tsc2{vu242/vu242} vs. 乙琥胺处理 24 小时的 P > 0.05（Dunn 检验）]。(H) 乙琥胺处理后，tsc2{vu242/vu242} 与 tsc2{vu242/+} 和 tsc2{+/+} 鱼相比，高速运动（>2 cm/s）的平均速度 [H = 9.5556, P = 0.02275; 未处理的 tsc2{vu242/vu242} vs. 急性乙琥胺处理的 P = 0.08，未处理的 tsc2{vu242/vu242} vs. 乙琥胺处理 24 小时的 P > 0.05（Dunn 检验）]。(I) 乙琥胺处理与溶剂处理相比，tsc2{vu242/tsc2{vu242}} 鱼的生存概率。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005。

TrkB拮抗剂ANA-12可逆转斑马鱼中与结节性硬化症相关的表型。脑源性神经营养因子（BDNF）-TrkB信号通路此前尚未在结节性硬化症的研究背景下被探讨，尽管该通路的失调与细胞迁移、轴突生长、癫痫和焦虑症相关。因此，我们检测了靶向TrkB是否能逆转在tsc 2{v u 242 h u 242}中观察到的与结节性硬化症相关的表型。ANA-12是TrkB的选择性拮抗剂，此前研究表明其在小鼠中具有抗焦虑潜力。为检测ANA-12的作用，我们首先通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了TrkB的磷酸化水平。斑马鱼TrkB的氨基酸序列与人类序列具有超过60%的同源性，且包含高度保守的酪氨酸磷酸化基序（支持信息附录，图S9A），该基序在TrkB激活时发生磷酸化。与tsc 2{+/+}相比，tsc 2{v u 242 h u 242}中磷酸化TrkB（P-TrkB）水平更高，而经ANA-12处理后该水平降低（图5A）。为进一步确认ANA-12对TrkB信号通路的作用，我们检测了环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（Creb）的激活情况，该蛋白的激活依赖于BDNF诱导的TrkB激活。与对照组相比，tsc 2{1u 242 / v u 242}中Ser111位点的Creb磷酸化水平升高（该位点与哺乳动物中的Ser133同源），而ANA-12处理可逆转这一现象（图(5 B)及支持信息附录图S9B）。这些结果表明，ANA-12通过TrkB和Creb在哺乳动物和鱼类中发挥相似的作用。

ANA-12 治疗对 tsc 2{1 v 242 / v u 242} 突变体的存活率提升效果优于氨己烯酸（VGN）——氨己烯酸是治疗结节性硬化症相关癫痫的一线药物。然而，在恢复 tsc 2{v u 242 / v u 242} 突变体的存活率方面，ANA-12 的效果不及直接抑制 mTorC1 的雷帕霉素预处理（RapaP）或氨己烯酸预处理（VGN-P；图 5C 及补充信息附录图 S10 A、B）。ANA-12 不会改变 tsc 2^{1 u 242 / u 242} 突变体大脑中 mTorC1 通路的激活状态（图 5D），但在 48 小时胚胎期（hpf）给药时，它能恢复前连合（AC）的正常宽度，效果与雷帕霉素预处理相似（图 (5 E) 及补充信息附录图 S10C）。此外，ANA-12 对 tsc 2{v u 242 / v u 242} 突变体癫痫相关的活性降低的挽救效果，与氨己烯酸或雷帕霉素预处理的效果同样显著（图 5 F–H）。ANA-12 还能减少戊四氮（PTZ）诱导的癫痫发作次数，并延长无发作时间（补充信息附录图 S10D）。tsc 2{1 / 242 / vu 242} 突变体中反映焦虑样行为的高频率运动速度增加，也仅通过 ANA-12 治疗得到了完全挽救（图 5 I–K）。此外，氨己烯酸并未改变突变体斑马鱼高频率运动速度的升高（图 5K），这进一步表明该速度升高并非由部分性癫痫引起，而是真实反映了焦虑样行为。因此，抑制 TrkB 信号通路可有效改善癫痫和焦虑相关的行为改变以及大脑连接异常。

上述液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）结果（补充信息附录，图S4A）表明Dock-Elmo-Rac1通路上调。在神经元中，TrkB可激活Rac1通路；因此我们推测Rac1活性上调是导致tsc 2{v u 242 / v u 242}表型的原因。用Rac1抑制剂W56（200纳摩尔）处理并未影响总活性，但与tsc 2{+/+}组相比，t s c 2{1 v 242 / v u 242}组的高范围运动速度降低（补充信息附录，图S10 E和F），从而挽救了焦虑样相关参数。综上，我们的研究数据表明TrkB过度活跃与结节性硬化症（TSC）病理的多个方面相关，同时也提示Rac1在结节性硬化症相关焦虑中发挥作用。

讨论

结节性硬化症的症状在大脑发育过程中通过尚未完全明确的机制出现。在本研究中，tsc 2{v u 242 h u 242} 表现出大脑皮层畸形和连合纤维变薄的现象，这些异常可被原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）抑制剂逆转，同时还伴随行为异常，这表明观察到的神经学表型与神经解剖结构的改变相关。

tsc 2{1 u 242 / vu242}突变体中更薄的胼胝体宽度可能反映了结节性硬化症患者所见的白质变薄，这与癫痫相关。在结节性硬化症患者中，胼胝体密度降低与癫痫以及自闭症、智力障碍等结节性硬化症相关神经发育障碍相关。此外，结节性硬化症相关难治性癫痫患者的轴突束更薄且结构紊乱。本研究中tsc 2{1 u 242 N u 242}品系的ptf1a:GFP阳性轴突也观察到类似的束形成障碍。这些障碍可能由轴突导向和伸长受损导致。与此一致，既往研究发现Tsc1缺失会在体外诱导轴突异位，并导致小鼠白质缺陷。轴突导向通路受外部信号及其受体调控，这些受体进而激活Dock–Elmo蛋白复合物，随后激活Rac1，进而引发肌动蛋白动态变化。Dock-3和Dock-4在轴突发育中发挥关键作用。Dock-3通过形成经典的Dock–Elmo复合物促进轴突生长，这对于BDNF–TrkB信号通路激活Rac1至关重要。Dock-4促进神经突分化，以建立轴突-树突极性。值得注意的是，本研究中tsc 2{1 u 242 / v u 242}品系的dock3、dock4、elmo2和rac1的mRNA水平高于tsc 2{+/+}品系。研究人员进一步证实tsc 2{v u 242 h u 242}品系斑马鱼大脑中Dock4和Elmo2蛋白水平升高。此外，抑制Rac1可挽救与焦虑相关的tsc 2{1 u 242 / w 242}运动速度异常，但并未影响运动能力下降，这表明Rac1参与焦虑相关行为的机制与癫痫相互独立。

近日，斑马鱼已成为神经精神疾病研究的公认模型，在转化研究中具有应用价值。作为高度复杂的脊椎动物，斑马鱼具备一系列复杂的行为特征，可用于研究人类神经系统疾病和神经精神疾病。在本研究中，tsc 2{1 v 242 / v u 242}突变体表现出较低的活动水平，但较高的高速运动，这表明它们以爆发式的方式游动。这些大幅度的运动可能由与TAND相关的表型引起，例如过度活跃、冲动控制受损或焦虑。由于tsc 2{v u 242 / v u 242}的总运动能力下降，因此高速运动的增加并不能代表多动。我们假设tsc 2{v u 242 h u 242}的运动速度增加是由焦虑样行为导致的，旷场实验、突发光照变化测试以及皮质醇水平升高均证实了这一点。然而，运动速度的增加也可能由冲动控制受损引起，这可以解释光照偏好测试的结果（更高的冒险倾向和大胆程度），但与旷场实验的结果相矛盾。冲动障碍可能导致皮质醇升高和爆发性多动，这与焦虑产生的效应相似。因此，我们对重复暗闪光进行了惊反射分析，该测试与焦虑、冲动以及智力障碍相关，其评估依据是对惊刺激的逃避反应以及重复刺激后的习惯化过程。tsc 2{1 u 242 / u 242}对首次惊刺激的反应更低或更迟缓，而iota s c 2{+/+}的习惯化过程无差异。这一结果并未证实tsc 2{1 u 242 / u 242}存在更高的冲动性，且进一步表明观察到的表型是由焦虑引起的。

由于tsc 2{v u 242 h u 242}号斑马鱼在明暗测试中始终停留在容器边缘，我们推测tsc 2{wut242/nü242 }号斑马鱼存在脑损伤，无法像tsc 2{+/+}号斑马鱼那样对黑暗环境做出反应。惊跳反应的实验结果并不一定与这一假设矛盾。尽管我们未观察到tsc 2{v u 242 / v u 242}号斑马鱼的反应习惯化与对照组存在差异，但其对惊跳刺激的反应已出现损伤。为支持智力障碍的可能性，我们发现tsc 2{1 v 242 / v u 242}号斑马鱼的后脑结节处ptf1a:GFP阳性神经束的成束生长存在紊乱，这可能会损害其焦虑调节功能。另一脑区缰核是处理情绪、社交行为、焦虑反应和运动能力的关键结构，被认为作为前脑与中脑之间的连接介导情绪反应。左侧缰核已有研究表明，该物质可调控斑马鱼幼体的光偏好行为。大脑形态中的其他左右不对称性也与大胆性和探索行为的调控相关。因此，脑半球连接的异常发育很可能是观察到的与TAND相关表型的成因。tsc 2{v u 242 / v u 242}组中，幼体在开阔场中类焦虑行为增多、面对光线骤变时也表现出此类行为，且无光偏好，这些现象或许都源于与缰核的整体连接受到了干扰。

图4. 突变体tsc2vu242/vu242在旷场和对光照突然变化的反应中表现出增加的焦虑样行为以及皮质醇水平升高。(A) tsc2vu242鱼的光偏好分析，包括代表性轨迹和每个tsc2vu242基因型在亮区和暗区花费的时间（相对于总活动）[基因型 × 处理：F = 8.181, P = 5 × 10{-4}; tsc2+/+亮 vs. 暗的 P = 1 × 10{-4}, tsc2vu242/+亮 vs. 暗的 P = 3 × 10{-4}, tsc2vu242/vu242亮 vs. 暗的 P = 0.999（Tukey HSD检验）；n = 15/基因型]。数据表示为平均值 ± SEM。(B) tsc2vu242鱼旷场分析示意图，显示实验孔的周围区和中心区选择，每个tsc2vu242基因型在周围区和中心区花费的时间（相对于总活动）（平均值 ± SEM），以及tsc2vu242鱼在周围区花费时间相对于总活动的数据分布 [F = 3.721, P = 0.0321; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+的 P = 0.043, tsc2vu242/vu242 vs. tsc2vu242/+的 P = 0.11（Tukey HSD检验）；n = 15/基因型]。(C) 光照突然变化后，每个tsc2vu242基因型随时间的平均活动 [H = 636.14, P < 2.2 × 10{-16}; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+ 或 tsc2vu242/+的 P < 7.4 × 10{-8}（Dunn检验）；n = 23 tsc2vu242/vu242, n = 69 tsc2vu242/+, n = 45 tsc2+/+]。(D) 用抗焦虑药物处理后，tsc2vu242/vu242在光照突然变化后随时间的平均活动，与未处理鱼比较 [H = 492.92, P < 2.2 × 10{-16}; 未处理 vs. 处理的 P < 2 × 10{-16}（Dunn检验）]。(E) 用各种抗焦虑药物治疗后，tsc2vu242鱼在暗相和亮相的活动幅度，与未处理鱼比较 [基因型 × 处理：F = 1.806, P = 0.128；处理：F = 43.643, P < 2 × 10{-16}; 未处理 tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+的 P = 0.0067；未处理 tsc2vu242/vu242 vs. 地西泮处理的 P = 1.3 × 10{-5}；未处理 tsc2vu242/vu242 vs. RA处理的 P = 0.999（Tukey HSD检验）]。(F) tsc2vu242鱼中皮质醇水平的量化 [F = 3.395, P = 0.103; tsc2vu242/vu242 vs. tsc2+/+的 P = 0.081（Dunnett检验）；n = 120/基因型]。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.005, ns：不显著。

癫痫发作可诱发类焦虑行为，这为癫痫发生、癫痫发作与焦虑之间建立了联系。研究表明，降低海马体中脑源性神经营养因子（BDNF）的信号传导可预防啮齿动物癫痫模型中的自发性癫痫发作，并挽救类焦虑行为。一致的是，有研究显示持续的环腺苷酸反应元件结合蛋白（Creb）活性可在小鼠体内诱发癫痫发作。在本研究中，ANA-12 治疗挽救了tsc 2{iv242ivu242 } 中的活性损伤，并逆转了其高速段运动能力的增强。同时，ANA-12 还降低了原肌球蛋白相关激酶 B（TrkB）和 Creb 的激活水平并降低了tsc 2{w u 242 h u 242}中的癫痫发作阈值，这表明TrkB信号传导参与了癫痫发生过程。

ANA-12 可逆转 AC 变薄及焦虑相关的过度反应，而 VGN 则无法逆转，这表明连合连接在调节焦虑方面发挥着重要作用，并将大脑解剖结构与行为联系了起来。这些结果还表明，TrkB 过度活跃与连合发育和焦虑均有关。我们还发现，与抑制 TrkB 类似，抑制 Rac1 也可挽救 tsc 2{v u 242 h u 242} 小鼠的焦虑相关反应。与我们的研究结果一致，此前已有研究表明 Rac1 过度激活会抑制长期恐惧条件反射记忆的形成。Rac1 是小鼠大脑皮层连合轴突发育所必需的，并通过前连合（AC）和胼胝体控制轴突交叉。tsc 2{v bar{u} 242 / v u 242} 小鼠的 AC 变薄，且轴突穿越大脑中线存在障碍。因此，连合轴突的破坏很可能通过 Rac1 导致焦虑。此外，Rac1 可能在轴突发育和突触串扰中作用于 TrkB 的下游，这引出了一个有趣的可能性：在结节性硬化症（TSC）中也可能存在类似机制。

图5. ANA-12可挽救tsc2 vu242vu/242突变体的存活率、脑连接异常、运动功能损伤以及焦虑相关的运动亢进。(A) 通过免疫化学法（ELISA）检测P-TrkB水平及P-TrkB与TrkB的比值，对TrkB受体的激活水平进行定量分析，结果显示tsc2wu242/wu242鱼的激活水平高于野生型对照兄弟姐妹，且ANA-12处理后激活水平降低[P-TrkB：H=4.355 P=0.049 : P=0.05 tsc2 vs. tsc2 {+/+}（Dunn检验）]；P=0.015 tsc2 vu242Nvu242未处理组与ANA-12处理组相比（Dunn检验）；P-TrkB/TrkB：H=5.689、P=0.05 8 P=0.05 tsc2vu242ivu242 vs. tsc2+/+（Dunn检验）；P=0.049 tsc2wu242/wu242未处理组与ANA-12处理组相比（Dunn检验）]。(B) 通过免疫化学法（ELISA）对Creb磷酸化水平进行定量分析，结果显示tsc2wu242/wu242突变体的Creb磷酸化水平高于对照组，且ANA-12处理后水平降低[基因型：F=3.513、P=4.66 ×10{-4}；处理：F=14.759 P=8.33 ×10{-4}；基因型×处理：P>0.05：P=0.012 tsc2 vu242Avu242经ANA-12处理组与DMSO处理组相比（Tukey HSD检验）；P=0.033未处理组与tsc2 {+/+}未处理组相比（Tukey HSD检验）]。(C) tsc2wu242/wu242突变体在不同处理后的存活概率。(D) ANA-12处理后，用抗P-Rps6抗体免疫染色的tsc2vu242鱼脑的共聚焦图像。(比例尺，30微米。)(E) tsc2vu242/vu242突变体在不同处理后的AC宽度，包括代表性共聚焦图像及定量分析[F=5.83 P=0.00142：P=0.002 DMS0组与ANA-12组相比，P=0.049组为0.049（DMSO组与雷帕霉素预处理组相比，Dunnett检验）]。(比例尺，30微米。)(F) 2VU242Nv242突变体经ANA-12处理后，与tsc2 20u242/+和tsc2 2{+1+}野生型鱼相比，1小时追踪过程中的累积活动量，结果显示突变体鱼经24小时ANA-12处理后活动量增加[未处理组与ANA-12处理组相比（Dunn检验）]。(G) tsc2wu242hvu242突变体经雷帕霉素预处理预防疾病发生后，与tsc2 2{vu242/+}和tsc2 {+/+}野生型鱼相比，1小时追踪过程中的累积活动量，结果显示处理后突变体鱼活动量增加[未处理组与雷帕霉素预处理组相比（Dunn检验）]。(H) tsc2wu242/wu242突变体分别经VGN或VGN-P处理预防疾病发生后，与tsc2 2{w u 2421+}和tsc2+/+野生型鱼相比，1小时追踪过程中的累积活动量，结果显示短时间VGN处理可改善活动量，但长时间VGN处理会产生毒性[未处理组与VGN处理组相比，未处理组与VGN-P处理组相比（Dunn检验）]。(I) tsc2 2 vu242/vu242突变体经ANA-12处理后，与tsc2 2{vu242/+}和tsc 2{+1+}野生型鱼相比，高速运动的平均速度[未处理组与ANA-12处理3小时组相比，未处理组与ANA-12处理24小时组相比（Dunn检验）]。(J) tsc2wu242/wu242突变体经雷帕霉素预处理预防疾病发生后，与tsc 2{vu242/+}和tsc2+/+野生型鱼相比，高速运动的平均速度[未处理组与雷帕霉素预处理组相比（Dunn检验）]。(K) tsc2vu242/vu242突变体分别经VGN或VGN-P处理预防疾病发生后，与tsc2 2{v u 242 t-}和tsc2 {+/+}野生型鱼相比，高速运动的平均速度。ns：无显著差异。

TrkB 过度活跃会导致焦虑，进而引起 Rac1 通路失调。尽管如此，过度活跃的 Rac1/3 还会造成兴奋-抑制失衡，使大脑活动增加且同步性受损。这与我们的研究结果一致，因为 tsc 2{v u 242 h v 242}表现出更高的大脑活动和癫痫发作。不过，Rac1 也有可能通过损害其他脑区的突触串扰来影响焦虑，且这种作用不依赖于连合纤维。最后，尽管我们确实发现 ANA12 和 Rac1 抑制剂对斑马鱼的焦虑样行为具有相似的影响，且它们的作用靶点很可能在同一条信号通路中，但我们仅提出二者间存在直接联系的假设。综上，本研究结果表明 TrkB 和 Rac1 信号通路参与了结节性硬化症的病理过程，加深了我们对该疾病复杂发病机制的理解，并揭示了一个潜在的治疗靶点。

方法

药物治疗。戊四氮（PTZ）、视黄酸（RA）、缬草宁（VGN）、乙琥胺和ANA-12均购自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）。雷帕霉素、地西泮和W56分别购自MBL国际公司、西班牙Cefarm制药公司和托瑞克斯公司（Tocris）。药物溶解于E3培养基、二甲基亚砜（DMSO）或甘油中制备储备液，随后进一步用E3培养基稀释。将药物直接加入含有相同数量去绒毛膜斑马鱼的E3培养基中给药。更多详细信息参见补充信息附录（SI Appendix）。

图像采集与分析。冰冻切片和整体标本的荧光图像通过蔡司LSM800共聚焦显微镜采集。对于STFBC实验，带卵膜的活体胚胎使用配备DMC2900相机的徕卡M60显微镜，每10毫秒拍摄一次，持续3分钟。其他活体成像实验采用蔡司Lighsheet Z.1显微镜完成。图像分析使用Fiji软件（fiji.sc）结合测量工具进行。骨架化（二维/三维）(49) 或三维肖尔分析(50)。更多详细信息见补充信息附录。

行为分析。行为学检测采用 ViewPoint Zebrabox 高通量监测系统完成。活动量按不同速度类别进行记录：静止（<0.5 cm/s）、自由游动（0.5–2 cm/s）和高速运动（>2 cm/s）。