文章信息

期刊：Cell Death Discovery（《细胞死亡发现》，Nature 旗下期刊）

最新影响因子：10.4（2025 年度 JCR，2026 年 6 月发布）｜JCR 分区：Q1（Cell Biology 30/207）

中科院分区（2025）：大类·生物学 2 区；小类·细胞生物学 2 区

发表信息：Cell Death Discov (2021) 7:250｜收稿 2021-02-16，接收 2021-08-26

DOI：10.1038/s41420-021-00630-w

通讯作者：De-Sheng Pei 裴得胜（中国科学院重庆绿色智能技术研究院）

开放获取：CC BY 4.0

导读：人类 MPV17 突变可引发婴幼儿致死性的线粒体 DNA 耗竭综合征（MDDS），但该基因功能长期成谜。本研究用 CRISPR/Cas9 构建了 mpv17 敲除斑马鱼：突变鱼肌肉、肝脏发育异常，能量物质与 ATP 锐减，透射电镜下线粒体数量减半、嵴"中空"断裂。有趣的是，往受精卵里注射正常线粒体，竟能把 TAG 代谢基因和体重"拉"回正常水平——这是鱼类模型中首次报道 MPV17 缺陷的全套人类样表型。

摘要

MVP17 编码一种定位于线粒体内膜的四次跨膜蛋白，人类 MVP17 突变可导致线粒体 DNA 耗竭综合征（MDDS），但其确切功能尚不清楚。本研究利用 CRISPR/Cas9 系统构建了一个新的 mpv17 敲除突变体。mpv17−/− 斑马鱼表现出肌肉、肝脏和能量供应方面的发育缺陷；幼鱼几乎无法存活超过一个月，发育阶段生长异常，游动能力亦不正常。透射电镜（TEM）观察表明，mpv17−/− 斑马鱼存在严重的线粒体功能障碍和线粒体嵴结构紊乱。作为细胞的"能量工厂"，线粒体的缺陷使突变体 ATP 含量较野生型显著降低。作者推测，线粒体嵴紊乱是 mpv17−/− 斑马鱼肌肉和肝脏功能障碍的原因。此外，主要能量储库甘油三酯（TAG）的含量大幅下降。有趣的是，通过显微注射正常外源线粒体进行拯救后，参与 TAG 代谢通路的基因恢复至正常水平。综上，这是首次在鱼类模型中报道由线粒体功能障碍导致的肌肉、肝脏与能量供应发育缺陷，并揭示了 mpv17 在斑马鱼中的功能机制。

引言

MVP17 编码定位于线粒体内膜的四次跨膜蛋白，但其功能长期未被充分理解，多个物种中均报道了与其相关的健康问题。早在 1990 年，小鼠 Mpv17 就通过反转录病毒插入失活被发现，其纯合突变小鼠出现肾病综合征和慢性肾衰竭【1】。后续更多工作表明，Mpv17 基因与 ROS 产生和肾小球硬化相关【2–7】；由于耳蜗形态学退行性变【5,6】，Mpv17 缺失小鼠还出现类似人类 Alport 综合征的内耳异常【3,4】。Clozel 等【7】则发现 Mpv17−/− 小鼠发生显著的全身性高血压和心动过速，继之多尿和尿钠增多，提示 Mpv17 在小鼠中的关键作用。

在人类，MVP17 突变导致线粒体 DNA 耗竭综合征（MDDS）并在婴儿期致死【8–13】，临床症状包括肝病、周围神经病和发育停滞【14】。Wong 等【15】报道 MVP17 突变可导致婴儿快速进展性肝衰竭；人类 MDDS 临床病例多为 MVP17 的点突变或缺失【16,17】。在斑马鱼中，2013 年报道了 mpv17 缺陷——transparent（tra）突变体的 mpv17 存在缺失并产生提前终止密码子【18】，表现为虹膜细胞和黑色素细胞缺陷的透明表型。2017 年，D'Agati 等为 roy orbison（roy）和 casper 斑马鱼提供了遗传学解释【19,20】：mpv17 mRNA 的 19 bp 缺失造成了 roy 品系【21】，且 roy 斑马鱼除皮肤颜色主要缺陷外，肝、肾、肌肉均未见明显异常——与人类或小鼠突变体不同。

本研究建立了一个新的 mpv17 截短斑马鱼品系，呈现与 tra、roy 类似的强表型（缺乏虹膜细胞和黑色素细胞）；此外，本研究 mpv17−/− 斑马鱼几乎无法存活超过 4 周，肌肉和肝脏异常，与人类和小鼠突变体一致而不同于 tra 和 roy。突变体线粒体嵴缺陷——而嵴正是细胞呼吸的关键结构——导致 TAG 和 ATP 含量下降。本工作为 mpv17 与肌肉、肝脏发育之间的关系提供了更多细节与证据，功能异常的线粒体正是连接基因与异常表型的关键纽带。这一新建立的斑马鱼突变系有助于阐明 mpv17 基因在 MDDS 中的分子机制。

结果

1｜mpv17−/− 斑马鱼的构建

研究团队用 CRISPR/Cas9 系统敲除斑马鱼 mpv17，靶位点由在线工具 ZiFiT Targeter 设计在翻译起始密码子附近的第 2 外显子（图 1A）。T7E1 酶切实验证实敲除效率良好（图 1B）。幼鱼养至成鱼后筛选纯合突变体，鉴定出 mpv17-2 和 mpv17-5 两个突变（分别缺失 2 bp 和 5 bp）。将其序列与野生型及 tra 突变体比对（图 1C）：tra 突变体缺失 54–72 bp 导致移码、31 个密码子后出现终止码，N 端保留 18 个与野生型相同的氨基酸；而本研究 22 bp 位置的 2 bp / 5 bp 缺失导致移码与提前终止，仅剩 30/29 个氨基酸残基，N 端只有 7 个残基与野生型相同。由于 mpv17-5 仅比 mpv17-2 少一个残基，后续实验均采用 mpv17-5（即 mpv17−/−）。1 月龄 mpv17−/− 斑马鱼的腹部、背部和眼睛缺乏虹膜细胞与黑色素细胞，与 tra 突变体相似（图 1D）【18】。从受精卵到 9 dpf 幼鱼的发育阶段记录（补充图 S1）显示，5 dpf 时突变体眼部反光因虹膜细胞缺失而显著减弱。

图 1　利用 CRISPR/Cas9 系统敲除斑马鱼 mpv17 基因。（A）靶位点设计在 mpv17 基因翻译起始密码子 ATG 附近。（B）T7E1 酶切实验的琼脂糖凝胶电泳结果（DL1000 marker；397 bp 条带为野生型，227/170 bp 条带示突变）。（C）野生型、tra 突变体及本实验 mpv17−/− 斑马鱼 mpv17 蛋白序列的氨基酸比对。（D）1 月龄野生型与 mpv17−/− 幼鱼。

2｜mpv17−/− 斑马鱼生长不良、4 周后存活率低，mRNA 注射可挽救

杂合子 mpv17+/− 互交后统计存活率。由于杂合子与野生型表型无法区分，二者合并计算；mpv17−/− 可在 5 天时依据眼部反光颜色挑选。5 dpf 幼鱼中突变体比例（23.5%）与预期无显著差异；10 dpf 时差异显著（突变体 21.9%）；26 dpf 时仅 6.8% 的 mpv17−/− 仍然存活（图 2A）。体长测量显示，发育早期突变体与合并组无差异，但 14 和 21 dpf 时突变体已明显更短，且几乎停止生长（图 2B）。向受精卵注射 mpv17 mRNA 后，拯救组中 mpv17−/− 幼鱼比例显著降低，证明 mpv17 mRNA 可恢复突变表型（图 2C）。

图 2　mpv17−/− 斑马鱼生长不良、存活率低，但可被 mpv17 mRNA 挽救。（A）首月内 mpv17−/− 存活率下降（5 dpf n=1160、10 dpf n=993、15 dpf n=227、26 dpf n=176）。（B）14 天后生长减慢甚至停滞，突变体与合并组的平均体长差距增大。（C）mpv17 mRNA 可挽救突变体，拯救组中突变体比例低于对照组。误差线为 ±SEM，***p<0.005。

3｜mpv17−/− 斑马鱼骨骼肌异常

饲养与筛选纯合子的过程中，研究者注意到 mpv17−/− 斑马鱼运动明显异常（补充电影 S1）。录像分析显示，突变幼鱼 15 秒游动距离更长、尾鳍摆动次数显著多于野生型——研究者认为肌肉缺陷是这一表型的原因。用肌肉发育标记基因 myod 的 RNA 探针进行原位杂交：突变体中 myod 信号减弱（图 3A）；qRT-PCR 进一步证实，肌肉发育相关基因 myf5、mstna、mstnb 表达显著下降（图 3D）。整体免疫荧光（抗快肌肌球蛋白抗体 F310、抗慢肌抗体 F59）显示肌纤维排列与完整性明显改变：突变体肌纤维结构不规则、组织呈无序模式（图 3B）。HE 染色石蜡切片显示，突变体躯干骨骼肌组织量少于对照，结构疏松、肌纤维间隙更大（图 3C）。以上均提示 mpv17 突变影响了骨骼肌的早期发育。

图 3　mpv17−/− 斑马鱼发育过程中骨骼肌缺陷。（A）24 hpf 生肌标记基因 myod 原位杂交（标尺 250 μm）。（B）72 hpf 快肌（F310）与慢肌（F59）免疫荧光共聚焦图像（标尺 50 μm；星号示异常）。（C）1 月龄鱼骨骼肌石蜡切片 HE 染色（4X/10X）。（D）肌肉发育相关基因的相对 mRNA 表达水平。

4｜能量储库减少、ATP 减半，注射正常线粒体可恢复相关基因表达

鉴于运动异常，研究者检测了作为真核细胞主要能量储库的甘油三酯（TAG）及其代谢物双甘油酯（DAG）、非酯化脂肪酸（NEFA）和葡萄糖：突变幼鱼 TAG 含量（0.007 mmol/g prot）显著低于对照（0.039 mmol/g prot），NEFA 亦低于野生型，DAG 无显著差异，血糖水平更低（图 4A）——提示能量底物减少。ATP 含量则显著降至野生型的一半（图 4B）。TAG 合成与降解相关基因中，除催化甘油三酯合成第一步的 mogat3a 外均发生改变；参与甘油三酯分解的 atgl、hsla、mgll 显著上调，促进了甘油三酯降解（图 4C）。

考虑到 MPV17 编码线粒体内膜蛋白，研究者尝试向 mpv17−/− 单细胞期受精卵显微注射正常外源线粒体。7 天后检测发现，hsla 和 mogat3a 的表达恢复至野生型水平——外源线粒体可能是恢复 mpv17 突变的有效手段（图 4C）。此外，7 dpf 突变幼鱼体重较对照降低约 16%，注射外源线粒体后也恢复到接近野生型水平（图 4D）。

图 4　mpv17−/− 斑马鱼 TAG 含量降低，注射正常线粒体可挽救 TAG 代谢基因表达。（A）7 dpf 幼鱼 DAG、TAG、NEFA 和葡萄糖含量测定。（B）7 dpf ATP 含量评估。（C）注射或未注射正常线粒体的突变幼鱼中 TAG 代谢相关基因的相对 mRNA 表达水平。（D）注射或未注射线粒体的突变幼鱼体重。误差线为 ±SEM，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.001。

5｜肝脏发育延迟、组织结构异常

用肝源性标记基因 tfa 探针进行整胚原位杂交（WMISH）评估肝脏发育：野生型幼鱼 3 dpf 时 tfa 信号强、位于身体左侧；而 mpv17−/− 幼鱼该探针染色缺失（图 5A 上、中排）。注射 mpv17 mRNA 拯救后 3 天，同一位点出现微弱信号（图 5A 下排）。5 dpf 时野生型染色增强并由左侧扩展至右侧，突变体则仅在肝脏左侧有微弱信号（图 5B）——提示其肝脏发育延迟。肝脏发育相关基因的 qRT-PCR 显示：wnt2bb、bmp2b、fgf（肝胚细胞特化信号分子）、hhex、prox1（促进肝芽发生与肝胚细胞迁移）、ppp1r12a（促进肝芽生长）、rbp4（参与肝芽形成）等所有与肝脏早期发育相关的基因均显著下调（图 5C、D）。1 月龄突变鱼肝组织石蜡切片 HE 染色显示肝脏组织离散、结构异常（图 5E）。

图 5　mpv17−/− 斑马鱼肝脏发育异常。（A）3 dpf tfa 探针原位杂交：上排野生型，中排 mpv17−/−，下排 mpv17 mRNA 拯救的 mpv17−/−。（B）5 dpf tfa 探针原位杂交。（C）tfa 基因表达水平（±SEM，*p<0.05）。（D）肝脏发育相关基因表达水平（±SEM，**p<0.01，***p<0.005）。（E）1 月龄斑马鱼肝脏 HE 染色石蜡切片；黑框区域在右侧放大。

6｜线粒体嵴"中空"断裂、线粒体数量与体积减少

对 7 dpf 突变鱼肌肉组织的 TEM 分析显示：突变幼鱼肌肉中线粒体数量显著少于野生型——每 100 μm² 组织中，野生型平均约 6 个线粒体，突变体仅约 3 个（图 6A 上排、图 6B 上）；突变体线粒体体积也更小，约缩小 30%（图 6B 下）。此外还观察到"中空"线粒体：嵴断裂、结构破损（图 6A）。这些缺陷大幅减少了内膜系统的表面积——而内膜正是细胞呼吸最重要的场所。因此，ATP 含量低很可能源于线粒体嵴的缺陷。

图 6　mpv17−/− 幼鱼肌肉中线粒体的结构、数量与大小。（A）7 dpf 幼鱼骨骼肌 TEM 图像：上排 ×2500，下排 ×11500；红色箭头示骨骼肌中的线粒体。（B）每 100 μm² 线粒体数量（上）与骨骼肌线粒体直径（下）。误差线为 ±SEM，*p<0.05，**p<0.01。

讨论

本研究用 CRISPR/Cas9 构建了 mpv17 敲除斑马鱼，其经线粒体功能障碍出现肌肉、肝脏和能量供应的发育缺陷，与人类 MDDS 相似。人类 MDDS 的临床症状包括肝病、周围神经病、发育停滞及婴儿期快速进展性肝衰竭【14,15】。此前的 tra 突变体（最早由 Walker 和 Streisinger 于 1983 年报道【28】，2013 年由 Krauss 系统表征【18】）主要表现为虹膜细胞与黑色素细胞显著减少；2017 年的 roy 突变被定位为 mpv17 mRNA 的 19 bp 缺失并经 mRNA 拯救实验证实【21】。然而在这些工作中，除皮肤缺陷外，作者均未发现肝、肾或肌肉的其他异常。而本研究中，纯合子几乎无法存活满 1 个月，肝脏、肌肉和线粒体发育均异常——这与携带插入突变的 mpv17 小鼠表型相似：mtDNA 耗竭、晚发肾小球硬化、毛发变灰和周围神经系统神经退行性变【1,4,5,29】。在人类，该基因的大量突变与 MDDS 相关，并导致幼儿早期死亡【17,30,31】。

本研究突变鱼与 tra、roy 品系表型的差异，可能源于截短蛋白的不同：本研究 mpv17 蛋白只保留 7 个与野生型相同的氨基酸残基，tra 则有 18 个——这 11 个氨基酸的差异可能导致了两种突变系表型的不同。另一可能原因是缺失方式不同：本研究品系经 CRISPR/Cas9 造成第 2 外显子缺失（NHEJ 途径），而 tra 与 roy 由内含子 2 缺失继外显子 2 隐性剪接供体位点造成【21】。

与野生型相比，突变鱼运动异常——研究者认为这源于肌肉组织缺陷（图 3B、C）；且肌肉线粒体数量与大小均下降，该现象可能来自线粒体重塑——这在斑马鱼肌肉早期发育中很重要【32】。本研究分析了全鱼 mtDNA 拷贝数，未发现显著差异（数据未显示），可能原因是 mtDNA 减少发生于特定组织、全鱼水平差异不明显【33】。但在肌肉组织中，突变体线粒体数量约为对照的 50%（图 6B 上），且观察到嵴破坏——这与 MPV17 突变患者肝中所见的嵴缺失【13】、嵴扩张【34】和无结构嵴【35】相似。mpv17 在维持线粒体结构与功能中至关重要【36】：正常线粒体不足、ATP 偏低（图 4B）使其无法良好工作，肌纤维因此发育不规则。

有趣的是，肌肉薄弱的 mpv17−/− 幼鱼反而游得更远、摆尾更快（补充图 S2B、C）。由于肌肉缺陷，突变体尾鳍每次摆动的角度小于野生型，因此需要更多次摆尾以在水中保持平衡；每次摆尾耗能更低——换言之，突变体没有足够的力量支撑单次大幅摆尾，只能靠高频小幅摆尾游完较长的距离。既往研究显示，一名 25 岁男性患者因 MPV17 突变出现双远端肌及内在肌无力与萎缩【37】；另一例 21 岁男性患者因手部与下肢远端肌肉萎缩只能以缓慢不稳的步态行走【38】。小鼠模型中，Viscomi 等报道 1 岁龄 mpv17−/− 小鼠发生亚临床线粒体肌病，其肌肉组织 mtDNA 仅为正常同窝个体的 25%【29】。在线粒体中，ATP 合酶功能障碍导致扁平板层嵴缺失、形成几乎无嵴的独立囊泡【39–41】。因此作者假设：线粒体数量减少与嵴缺陷共同导致了 ATP 含量降低，进而影响肌肉发育与运动。

尽管斑马鱼与人类存在遗传差异，斑马鱼仍是人类疾病研究的优秀模型。本研究的 mpv17−/− 斑马鱼通过缺失 5 bp 编码序列破坏基因功能，其表型（肌肉、肝脏与能量供应缺陷）与人类 MDDS 相似。整胚原位杂交显示 3–5 dpf 突变幼鱼 tfa 信号明显减弱（3 天样本几乎消失）——tfa 是肝细胞分泌的肝功能标志物，其低表达提示肝细胞分泌功能受抑；且所有肝脏发育相关基因均显著下调（图 5D），这些基因在肝胚细胞的特化与迁移中发挥重要作用【25,43,44】，可能减少了肝胚细胞向成熟肝脏的发育。综上，新建立的 mpv17−/− 斑马鱼可模拟人类 MPV17 缺陷疾病表型，属鱼类模型中的首次报道。由于线粒体缺陷，突变鱼出现肌肉、肝脏和能量供应异常，表明其未来可用于线粒体疾病的治疗研究。

材料与方法（概要）

伦理声明：动物实验经重庆市动物护理与使用委员会及中国科学院重庆绿色智能技术研究院实验动物福利与伦理委员会批准（批件号 ZKCQY0106），按《实验动物护理与使用指南》（第八版，2011）执行。

斑马鱼饲养：AB 品系成鱼于 28 °C、14 h 光照/10 h 黑暗的自动循环水系统中饲养，雌雄每周交配一次，收集受精卵于 28 °C 培养。

mpv17−/− 品系构建：用 ZiFiT Targeter 设计靶序列，MAXIscript T7 试剂盒体外转录 sgRNA；以 pXT7-Cas9 线性质粒为模板体外转录 Cas9 加帽 mRNA。将 Cas9 mRNA（300 ng/μL）与 mpv17 sgRNA（30 ng/μL）各 1 nL 显微注射单细胞期胚胎；48 h 后每 10 枚胚胎合并提取 DNA 进行 T7E1 检测；注射胚胎养至成鱼后筛选 mpv17−/−。

mtDNA 拷贝数测定：绝对定量 real-time PCR。将斑马鱼 nd1 PCR 片段插入 T-Vector pMD20，梯度稀释为 10²–10⁷ 拷贝/μL 制作标准曲线（r²>0.99），以 qRT-PCR 靶向线粒体基因 nd1 计算 mtDNA 拷贝数。

mRNA 表达水平分析：RNAiso Plus 提取 20 尾 5 或 7 dpf 幼鱼总 RNA，PrimeScript RT 试剂盒（含 gDNA Eraser）合成 cDNA，TB Green Premix Ex Taq II 在 ABI 7300 上进行 qRT-PCR，2−ΔΔCt 法计算相对表达。

组织学与整胚原位杂交：1 月龄鱼 4% 多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋切片，HE 染色镜检。WMISH 按 Thisse 方案【45】进行，反义探针长约 700 bp，含 T7 启动子引物扩增模板，体外转录制备。

整胚免疫荧光：3 dpf 胚胎 4% PFA 固定，PDT 洗涤封闭后，以单抗 F59（1:20）与 F310（1:20）分别抗 MHC（慢肌）与 MLC，再以 Alexa Fluor 488 山羊抗鼠 IgG 孵育，Olympus FV1000 共聚焦成像。

TAG、DAG、NEFA 与 ATP 含量测定：取 7 dpf 幼鱼按试剂盒说明测定：甘油三酯与非酯化脂肪酸测定试剂盒（南京建成）、斑马鱼 DAG ELISA 试剂盒（上海酶联）、增强型 ATP 测定试剂盒（碧云天）。

mRNA 拯救实验：扩增斑马鱼 mpv17（NM_201165.2）完整开放阅读框，插入 pCS2+ 载体体外转录加帽 mRNA，以 100 ng/μL 浓度注射杂合子亲本的单细胞期胚胎。

TEM 分析：7 dpf 幼鱼 2.5% 戊二醛固定，切成 1 mm³ 小块，0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.4）浸洗过夜，1% OsO₄ 后固定 1 h，梯度乙醇脱水、环氧树脂渗透包埋，Leica EM UC6 切 60–80 nm 超薄切片，Hitachi HT-7700 电镜 80 kV 观察。随机取 3 个个体，按每 μm² 计数线粒体数量，以长轴测量直径。

线粒体显微注射：用线粒体提取试剂盒（索莱宝）自 10 尾野生型成鱼肝脏分离线粒体：肝脏冷 PBS 洗涤三次后匀浆，1000×g 离心 5 min（重复一次），上清 12000×g 离心 10 min，沉淀洗涤两次后溶于 PBS，BCA 法定量，按既往描述【46】进行显微注射。

存活率与体长：按 1:3 期望比例经 Pearson 卡方检验统计各时间点基因型比例；4、8、14、21 dpf 幼鱼 MS222 麻醉后拍照记录体长。

游泳行为记录：每组 5 尾野生型与突变体幼鱼录像，以不同颜色轨迹线记录游泳路径，统计 15 秒内尾鳍摆动次数与游动距离。

统计分析：GraphPad Prism 5.01，单因素 ANOVA，p<0.05 视为显著，数据以均值 ± SEM 表示，每项实验独立重复三次。

补充说明：本文系文献翻译整理，原文及全部图表以开放获取（CC BY 4.0）形式发表于 Cell Death Discovery (2021) 7:250，DOI: 10.1038/s41420-021-00630-w。文中图片版权归原论文作者所有。数据可用性、致谢、作者贡献与参考文献详见原文，此处从略。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。