原文信息

Yabe T, Hoshijima K, Yamamoto T, Takada S.Quadruple zebrafish mutant reveals different roles of Mesp genes in somite segmentation between mouse and zebrafish.Development, 2016, 143: 2842-2852. DOI: 10.1242/dev.133173

日本基础生物学研究所／冈崎统合生物科学中心 ｜ 综合研究大学院大学 ｜ 美国犹他大学 ｜ 广岛大学

收稿：2015-11-25 ｜ 接受：2016-06-17

我们的脊椎骨、骨骼肌和真皮，都来自胚胎时期一段一段出现的体节（somite）。体节怎么"分节"？经典的答案是"钟与波峰"模型：一个滴答作响的"分子钟"提供时间节律，一个逐渐后退的"决定波峰"提供位置信息，两者一结合，体节就一件一件地"出厂"。

在小鼠里，把节律翻译成结构的"总钥匙"是转录因子 Mesp2——敲掉它，小鼠的体节边界全军覆没。但斑马鱼有整整四个 Mesp 基因，它们干的是不是同一份工作？

这篇 2016 年发表在 Development 的研究用 TALEN 一次敲掉斑马鱼全部四个 Mesp 基因，得到了一个出人意料的答案：体节照样能"分家"，但每一节都被"尾化"了。

结论速览

• 四个 Mesp 单敲均无表型 → 功能高度冗余，必须做四突变体。

• 边界定位不受影响：Tbx6 蛋白域前缘清晰、ripply1/2 在前 PSM 正常表达——这条通路在小鼠里靠 Mesp2，在斑马鱼里不靠。

• 形态学边界部分受损：epha4 条带消失、纤连蛋白组装紊乱。

• R-C 极性全线尾化：头侧基因 tbx18/fgf8 消失，尾侧基因 uncx4.1/myod 扩到整个体节——这条与小鼠保守。

• 下游连锁反应：水平肌隔消失 → cxcl12a 表达丢失 → 侧线与色素细胞排布跟着乱。

一句话：Mesp 的"主控"身份是物种特异的，"极性开关"身份是保守的。

摘要

体节的分节模式，是由分子钟提供的时间周期性逐步转化而来的。这一钟的基本结构在不同物种之间保守，但多样性同样存在，尤其体现在分子网络层面。时间周期性随后被转化为体节的空间格局，在小鼠中 Mesp2 在此起关键作用。本研究利用 TALEN 产生了缺失全部四个斑马鱼 Mesp 基因的突变体。与小鼠 Mesp2 突变体相反，斑马鱼 Mesp 四突变体胚胎中体节边界位置依然被明确划定、形态学边界也能形成（尽管不完全正常）；但每个体节都像小鼠 Mesp2 突变体那样被尾侧化，浅层水平肌隔与侧线神经基板也无法正常形成。这些结果阐明了 Mesp 在分子钟与体节形态发生之间连接环节上的保守功能与物种特异性功能。

一、为什么非要敲四个基因？

斑马鱼有四个 Mesp 基因：mespaa、mespab、mespba、mespbb，都在前体节中胚层（PSM）前部表达。可问题是——敲掉任何一个，胚胎都好好的。四个基因显然在"轮流值班"。

更麻烦的是，mespaa 和 mespba、mespab 和 mespbb 两两紧挨着坐在同一条染色体上，重组率极低，想靠常规杂交把突变攒到一起非常难。

作者的解法很巧：先用 TALEN 分别造出两个"双突变杂合体"，再让这两条系互相杂交——因为紧邻的突变本来就锁在同一条染色体上，双杂合体的后代里就能直接拿到四重纯合子。这就是本研究的主角：Mesp 四突变体（m4）。

图 1 | 利用 TALEN 产生 Mesp 基因突变体

A 四个 Mesp 基因在基因组上的位置：mespaa 与 mespba（12.9 kb）、mespab 与 mespbb（10.0 kb）分别紧密连锁。

B 四个突变等位基因（kt1017、kt1004、kt1002、kt1009）的示意与测序峰图。红色箭头标示突变位置；所有突变都落在编码 bHLH 结构域（绿色）上游，均为移码突变。右侧为野生型与四突变体 cDNA 直接测序结果，红色字符为突变序列。

拿到 m4 之后的第一个意外是：这个"零 Mesp"的胚胎居然能活到成体、还能生育——要知道小鼠敲掉一个 Mesp2 就全身体节崩盘。作者又做了母源-合子型（MZ）四突变体，排除了母源残留 mRNA 的干扰；再补上两个理论上不可能产出任何功能产物的新等位基因，排除残留蛋白的可能。结论稳固：斑马鱼胚胎对 Mesp 的依赖，真的比小鼠低得多。

二、第一个反差：体节照样"划线"

m4 胚胎里，除了最前面 3–5 个体节，绝大部分体节边界依然清晰成形——只是形状不再是标准的"人"字形（图 2）。

这和小鼠 Mesp2 突变体完全不同。在小鼠里，边界定位靠的是这样一条链：Mesp2 → Ripply1/2 → 阻遏 Tbx6 → Tbx6 蛋白域前缘＝未来边界的位置。Mesp2 一缺，Tbx6 域向前疯长，边界定位随之崩溃。

斑马鱼 m4 里发生了什么？

• Tbx6 蛋白域前缘依然清晰，与野生型无异——定位这一步没塌。

• 但作者同时敲出的 ripply1;ripply2 双突变体里，Tbx6 域向前延伸——Ripply 这条路在斑马鱼同样是必需的。

• 关键的是：m4 中前 PSM 的 ripply1/ripply2 表达完全正常，过表达 mespba 也诱导不出异位表达——也就是说，斑马鱼的 Ripply 表达不归 Mesp 管。

图 2 | Mesp 四突变纯合体的表型

A,B 1 体节期野生型与 m4 的背面观：箭头指示形态学体节边界，箭号指示脊索。最前端的体节边界缺失。

C–F′ 18 体节期野生型（C）、mespaa/mespba 双突变体（D）、mespab/mespbb 双突变体（E）与 m4（F）的体节形态（下排为放大图）。单双突变体均正常；只有 m4 的体节失去"人"字形，且括号标示的前部体节边界受损。

图 3 | Mesp 四突变体中的体节定位

A–F 1 与 9 体节期的 Tbx6 免疫染色：野生型与 m4 的 Tbx6 蛋白域前缘均清晰（A,B,D,E），而 ripply1;ripply2 双突变体中该域向前延伸（C,F）。

G–N 原位杂交显示：m4 中前 PSM 的 ripply1（H,L）与 ripply2（J,N）表达不受影响，受影响的只是体节区的 ripply1。

O–T 用 tbx6:ggff 驱动子过表达 mespba：前 PSM 的 ripply1/ripply2 表达不被异位诱导，仅体节区 ripply1 表达扩展。比例尺，50 µm。

三、第二个反差：线划了，"墙"却砌得歪

边界"定位"和边界"砌墙"是两回事。Phalloidin 染色把 m4 的底牌掀了出来：即使后部体节，边界形态也被部分破坏——纤连蛋白虽然在边界处堆积，但组装得七零八落。

分子层面的一组对照非常说明问题：

• epha4：条带式表达完全消失（但沿体轴的梯度表达还在）——它是 Mesp2 在小鼠里的直接下游，负责 Eph/Ephrin 排斥性相互作用启动砌墙。

• papc（pcdh8）：条带还在，只是略淡——它走的不是 Mesp 这条路。

所以斑马鱼的体节砌墙由两条平行通路维持：一条 Mesp 依赖（经 Epha4），一条 Mesp 非依赖（很可能经 Pcdh8）。前部体节两条都得靠 Mesp，后部体节对 Mesp 的需求就低多了——这正好解释了为什么缺陷集中在前端。

图 4 | m4 形态学体节边界的形成受损

A–B″ 纤连蛋白与 Phalloidin 双染：白色箭号示边界处纤连蛋白组装的缺口，白色箭头示边界处细胞排列破坏。

C–Hepha4a 表达：1 与 8 体节期的条带式表达在 m4 中完全丢失（黑色箭头标示野生型条带）。

E–Jpapc 表达：1 与 11 体节期的条带在 m4 中保留，仅强度略降。比例尺，50 µm。

四、R-C 极性：Mesp 的老本行，斑马鱼也保守

体节内部必须分出"头侧"与"尾侧"两种身份（R-C 极性），骨头的花样全靠它。这一步，斑马鱼和小鼠终于站到了一起：

• 头侧基因 tbx18 与 fgf8 的表达完全消失（1、11、28 体节期，外显率都是 100%）。

• 尾侧基因 uncx4.1 与 myod 反向扩张到整个体节——每一节都"尾化"了。

• 反过来，用 tbx6:ggff 驱动子过表达 mespba，就能把 tbx18 抬上去、把 uncx4.1 压下去——必要且充分，和小鼠 Mesp2 一模一样。

极性乱了，骨头也跟着遭殃：m4 成鱼的部分椎骨出现脉弓重复、神经弓分裂或融合。不过椎骨的分节本身没乱——印证了"椎柱分节不依赖体节分节"的旧结论。

值得一提的是：后躯干的体节边界在没有 R-C 极性的情况下照样维持。在小鼠的 Mesp 亚等位基因胚胎里，边界会先建立后消失；斑马鱼却证明，边界的建立与维持都可以不需要极性——这是两个物种之间的又一个差别。

图 5 | m4 中头-尾极性受损

A–L 11 与 28 体节期的原位杂交：头侧基因 tbx18、fgf8 在 m4 中完全缺失；尾侧基因 uncx4.1、myod扩展至整个体节（各组外显率均为 100%）。

M–P′ 过表达 mespba：tbx18 上调、uncx4.1 下调。黑线标示体节边界。

Q–R‴ 30 dpf 成鱼骨骼染色：m4 的部分椎骨脉弓重复（R″ 箭头）、神经弓分裂（R′–R‴ 箭号）。

五、一条肌隔倒下，全身跟着乱

体节还要竖起一层"天花板"——水平肌隔（horizontal myoseptum），由贴着脊索的轴细胞中、位于头侧的一群"肌肉先驱细胞"（MPs）向外侧迁移铺成。

m4 里的故事分两半：

• MPs 的分化照常——Prox1/Engrailed 双阳性细胞数目正常。这部分由不依赖 Mesp 的极性管着。

• 但 MPs 迁移不出去，堵在脊索旁边；浅层肌隔的趋化因子 cxcl12a（sdf1a）表达彻底消失。这部分必须 Mesp。

移植实验一锤定音：把野生型细胞移植进 m4 囊胚，cxcl12a 的表达只在野生型供体细胞里恢复——Mesp 是细胞自主地要求轴细胞把肌隔铺出去的。

而 cxcl12a 这层"路面标线"一消失，下游全面塌方：

• 后侧线神经基板错误迁移——躯干前部几乎没有神经丘沉积。

• 黑素细胞与虹膜细胞排列紊乱——体表色素格局最终破相。

图 6 | m4 中肌肉发育异常

A–C 24 hpf 的 Engrailed/Prox1 免疫染色与计数：MPs 数目正常（野生型 16 个体节 vs m4 23 个体节）。

D,Esmyhc 表达横切：m4 中慢肌纤维在躯干内侧面中断。

F,Gcxcl12a 表达：m4 中浅层肌隔的 cxcl12a 完全消失（n=14，100%）。

H,Ipax7 表达：肌源性祖细胞数量减少。

J–L 移植实验：野生型细胞（红）移植进 m4 后，被挽救的 cxcl12a 表达（绿）只出现在供体细胞内——10 条胚胎 42 个细胞，无一例外。

图 7 | m4 中体表内侧格局受损

A,B 2 dpf 侧线神经丘：野生型沿体轴整齐排列（A），m4 躯干前部几乎无沉积（B）。

C,D 4 dpf 黑素细胞：野生型沿前后轴伸长并排成一线（C），m4 形态与排列紊乱（D）。

E,F 30 dpf 虹膜细胞：野生型排布连续（E），m4 出现缺口（F）。

六、机制总图：同一份钟，两套接线

把所有结果收拢，就得到文章最后这张"接线图"——同一个分子钟，在小鼠和斑马鱼里接到了不同的电路上：

图 8 | 小鼠与斑马鱼体节分节机制差异的示意图

左（小鼠）：Notch 信号与 Mesp2 把分节钟连接到全部三个过程——边界定位、形态学边界形成、R-C 极性形成。右（斑马鱼）：分节钟以不依赖 Mesp 的方式调控 Ripply 表达、决定边界位置；Mesp 的功能收缩到形态学边界与 R-C 极性两件事上。斑马鱼中分节钟→Ripply 的直接通路是什么（图中"？"），是留给未来的问题。

七、这项研究为什么重要

"钟与波峰"模型讲的是普适规律，但把钟的节律翻译成结构的"插头"可以换。小鼠用 Notch→Mesp2 这根线把钟接到全部三道工序；斑马鱼只把 Mesp 接到其中两道，边界定位那一道换成了未知机制直连 Ripply。

这也解释了一个长期悬案：为什么斑马鱼 morpholino 敲 mespba/bb 只见肌病、不见分节缺陷？——因为分节那部分本来就不怎么依赖 Mesp，morpholino 只是把 Mesp 依赖的肌肉部分砸中了。

方法学上，这项研究也是TALEN 时代处理"串联重复基因"的教科书案例：先各自做成双突变杂合体、再靠紧密连锁攒出四重纯合——四年后这套思路在 CRISPR 时代依然通用。

最后留一个问题：斑马鱼的分节钟到底通过谁去驱动 Ripply？找到这个"缺失的一环"，体节发生这架钟的接线图才算真正画完。

译者说明：本文为学术论文中文译稿之导读与图解版，仅用于学习与学术交流；所有实验数据、结论与观点均归属原作者（Yabe et al., Development 2016;143:2842-2852），如需引用请以英文原文为准。

图片来源：原文图 1–8（© 2016. Published by The Company of Biologists Ltd）。

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