Development

《发育》 · The Company of Biologists 出版 · 2017 年 144 卷 16 期 2889–2895 页 · 研究报告（Research Report）　|　IF 4.0（5年 4.6） CiteScore 5.4 · Q1 · 中科院生物学 2 区 · RESEARCH REPORT· STEM CELLS AND REGENERATION专栏

DOI 10.1242/dev.155655　原文链接 https://journals.biologists.com/dev/article/144/16/2889/19215/　版权状态 出版方保留版权　收稿/接受 2017-06-02 收稿 | 2017-07-04 接受 | 2017-08 出版

通讯作者：Kenneth D. Poss（kenneth.poss@duke.edu）　作者：Valerie A. Tornini、John D. Thompson、Raymond L. Allen、Kenneth D. Poss　研究单位：美国杜克大学医学中心细胞生物学系；杜克大学 Regeneration Next 中心　动物伦理：经杜克大学（美国北卡罗来纳州）动物护理与使用委员会（IACUC）批准

一句话速读

斑马鱼鳍再生依赖「芽基（blastema）」这团前体细胞。研究发现，tph1b 标记出一个平时只在鳍关节附近活动的成纤维细胞亚群——在未受伤的成体中，它们的后代终生局限在关节周围；但一旦截断鳍，这些细胞的贡献范围从关节附近一路扩展到再生鳍条全长，克隆扩张幅度从平时的约 1.3 倍暴增至 50.8 倍。同时，tph1b 及其催化的血清素合成对鳍再生本身并非必需——敲除该基因或用药消融这些细胞，鳍都能正常再生。

📌 编者提示

本文为 Development 期刊「干细胞与再生」专栏的 Research Report，体裁为高密度短文，原文正文仅约 3 页，但方法学密度很高（CreER/ubi:switch 遗传命运映射 + 硝基还原酶药物消融 + CRISPR/Cas9 敲除）。本译文为全文完整翻译，含材料与方法、图注、致谢、作者贡献与参考文献。下文为帮助理解，编辑另加了两处「延伸阅读」式的名词注释框（灰底，已注明为编者补充），其余内容均不增删、不改写。

摘要

芽基（blastema）是一团前体细胞，负责被截断的蝾螈肢体与鱼鳍的再生。既往研究表明，产生芽基的常驻细胞来源向再生组织贡献的是谱系受限（lineage-restricted）的后代。然而，这些研究标记的是一般性的细胞类型，而非精细的细胞亚群；它们也未能解释，为使远端结构由断肢残端中具有近端身份的细胞产生，必定要发生哪些发育转变。我们发现，编码合成血清素之酶的 tph1b 的调控序列，标记出成体未受伤斑马鱼鳍中一个局限于关节的成纤维样细胞亚群。截断会刺激再生鳍中的成纤维细胞产生血清素，然而使这一反应消失的定向 tph1b 突变并不会破坏鳍的再生。在未受伤个体中，表达 tph1b 的细胞贡献出的成纤维细胞后代终生局限于关节。相反，截断之后，tph1b⁺ 关节细胞产生的成纤维细胞会分布到再生鳍条的全长。我们的实验可视化并定量了：一个通常具有近远端（proximodistal，PD）限制的细胞亚群，一旦被纳入附肢芽基，其后代贡献范围是如何被拓宽的。

关键词　克隆分析；鳍再生；再生；斑马鱼

一、引言

斑马鱼在鳍被截断后能旺盛再生，这与蝾螈的肢体再生是类似事件（Tornini and Poss, 2014）。鳍截断后，残端组织中的细胞发生重组、迁移或被位移，并增殖，形成称为芽基的结构。芽基细胞是鳍条间充质区中占主导地位的细胞——成骨细胞与成纤维细胞——的前体（Knopf et al., 2011; Singh et al., 2012; Tornini et al., 2016; Tu and Johnson, 2011）。既往报道表明，在鱼鳍、蝾螈肢体与小鼠指尖中形成附肢芽基及其后续再生过程，并不涉及常驻细胞谱系潜能的重大改变（Knopf et al., 2011; Kragl et al., 2009; Lehoczky et al., 2011; Rinkevich et al., 2011; Singh et al., 2012; Stewart and Stankunas, 2012; Tornini et al., 2016; Tu and Johnson, 2011）。

尽管对芽基的理解在不断加深，附肢某一受限区域内的细胞却必定要以某种方式获得贡献到广泛近远端（PD）范围内新结构的潜能。据我们所知，一个细胞群体如何在生长与稳态条件下改变其贡献范围、又如何在剧烈再生中做出改变，在再生的附肢中尚未被考察。本研究比较了斑马鱼鳍中这类贡献，揭示了一个通常受限的细胞亚群——我们鉴定为与关节相关、并表达标志物 tph1b 的成纤维细胞——如何在附肢再生过程中拓宽其 PD 贡献范围。

二、结果与讨论

2.1　紧邻鳍关节的成纤维细胞表达 tph1b

我们最近发现，斑马鱼鳍截断后，位于内侧的芽基细胞中 tph1b 被诱导表达（Tornini et al., 2016）。经细致观察，我们注意到 tph1b:mCherry 在未受伤的成体鳍中同样可被检测到，只是水平远低于再生期间。表达定位于关节附近，在更近端的关节以及外侧鳍条中表达更高（图 1A）。在近端节段的外侧半鳍条外边界上检测到更强的 tph1b:mCherry 报告荧光，可能是对更高机械应力的局部诱导反应（图 1B）；而在内侧鳍条的关节附近检测到较低表达（图 1C）。在尾鳍的任何鳍条中，从最远端起两到三个节段以内均未观察到 tph1b⁺ 细胞（图 1D）。再生 30 天后，由 tph1b 调控序列驱动的表达重新局限于关节区域，并从远端鳍条节段中消失（图 1E–G）。tph1b 驱动的荧光不与成骨细胞标志物共定位，而仅限于关节附近节段间区域中紧邻成骨细胞的成纤维细胞（图 1H、I）。我们未观察到 tph1b:mCherry 与内皮细胞报告基因 fli1:EGFP（Lawson and Weinstein, 2002）荧光共定位，尽管 tph1b⁺ 细胞常与 fli1⁺ 内皮细胞相邻（图 1J）。

evx1⁻/⁻ 突变体缺乏鳍关节，然而其鳍条在没有实验损伤的情况下也会出现断口，可能源于应激（Schulte et al., 2011）。evx1⁻/⁻ 尾鳍在鳍条断口附近表达 tph1b:mCherry（图 1K–N），近似于关节通常形成的位置（图 1L、N）。除这些断口处外，未在 evx1⁻/⁻ 尾鳍的其他部位检测到 tph1b:mCherry 表达，这确认了 tph1b:mCherry 可作为无损伤情况下关节相关细胞的标志物（图 1O–R）。这些结果提示，tph1b 调控元件在关节处受到机械应激时被中等程度地激活于一小群细胞中，而在重大损伤后则在广泛组织区域被强烈激活。另一个突变体 long fin（lof）会以超出动物生长速率的比例在远端添加节段（Iovine and Johnson, 2000）。lof 与野生型尾鳍中的 tph1b:mCherry 报告表达相似，包括从远端鳍条节段中排除（图 1S–U）。

我们未在发育中的幼鱼鳍褶中观察到表达（图 1V），首次在受精后 14 天（dpf）左右于发育中的关节附近检测到表达（图 1X–AA）。在 5 dpf 切除幼鱼鳍褶后，我们也未检测到 tph1b:mCherry 的诱导（图 1W），表明 tph1b 调控元件在有辐鳍结构的关节或再生组织中优先被激活。其他成体鳍同样在关节附近显示表达，且同样排除最远端节段（图 1BB–DD）。这些发现鉴定出一个明显的关节相关 tph1b⁺ 成纤维细胞亚群，其定位于成骨细胞与血管附近。

图 1｜tph1b⁺ 成纤维细胞定位于成体斑马鱼鳍关节。（A–D）未受伤成体斑马鱼尾鳍中的 tph1b:mCherry 表达。（A）整鳍；（B）放大的近端背侧鳍条；（C）内侧鳍条；（D）远端内外侧鳍条。tph1b:mCherry 在鳍关节附近表达。（E–G）截断后 30 天（dpa）尾鳍整体（E）、内侧（F）或远端（G）的 tph1b:mCherry 表达。虚线表示截断面。（H）未受伤 tph1b:mCherry 鳍条的横切面，DsRed（红色，tph1b:mCherry）、ZNS-5（成骨细胞，绿色）与 DAPI（细胞核，蓝色）三重染色。（I、J）未受伤 tph1b:mCherry; osx:EGFP-CAAX（I）或 tph1b:mCherry; fli1:EGFP（J）鳍条的光学切面，DAPI 染细胞核（蓝色）。tph1b:mCherry 表达的细胞不与成骨细胞标志物或 fli1:EGFP 表达细胞共定位（J 中箭头）。（K–N）整装 tph1b:mCherry 尾鳍，野生型（K、M）或无关节的 evx1⁻/⁻（L、N）背景，受精后 1（K、L）或 4（M、N）个月。（O–R）野生型（O、P）或 evx1⁻/⁻（Q、R）背景下 tph1b:mCherry 鳍条的光学切面，显示近端（O、Q）或中部（P、R）外侧鳍条，DAPI 染细胞核（蓝色）。tph1b:mCherry 定位于成熟关节附近的近端外侧鳍条与中部外侧鳍条，但在无关节鳍中缺失，除损伤诱导的表达外（R，箭头）。（S–U）longfin（lof）背景中 9 mpf 时的 tph1b:mCherry 表达，外侧（T）与远端（U）鳍条组织。（V、W）6 dpf（V）或 6 dpf、1 dpa（W）时的 tph1b:mCherry 表达。幼鱼鳍褶组织损伤后不诱导表达。虚线表示尾鳍边界。（X–AA）尾鳍发育过程中 14（X）、17（Y）、23（Z）与 40（AA）dpf 时的 tph1b:mCherry 表达。虚线表示鳍边界。（BB–DD）成体背鳍（BB）、臀鳍（CC）与胸鳍（DD）中的 tph1b:mCherry 表达，排除远端节段。

2.2　Tph1b 在芽基细胞与成纤维细胞中合成血清素，但对鳍再生并非必需

tph1b 编码色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase），是外周血清素合成的限速酶。血清素信号在演化上高度保守，在动物界承担众多功能（Berger et al., 2009; Curran and Chalasani, 2012）。它也已被报道可在脊椎动物背景下调节组织再生（Lesurtel et al., 2006; Barreiro-Iglesias et al., 2015）。在未受伤的尾鳍中，血清素存在于外侧鳍条而非内侧鳍条的间充质细胞中（图 2A–D）。在鳍再生过程中，2 dpa 时增殖与非增殖的芽基细胞内、以及 4 dpa 再生鳍条的成纤维细胞内均可见到明显的细胞内血清素（图 2E、F），偶尔在远端基底上皮细胞中观察到。囊泡性血清素见于未受伤与再生鳃表皮的浅层上皮细胞中（图 2F–H）。这些数据表明，血清素产生是斑马鱼鳍成纤维细胞中一种应激诱导的信号。

为确定 Tph1b 在鳍再生中的功能，我们生成了一个 tph1b 突变等位基因（tph1b^pd249），缺失 tph1b 基因组序列 8.3 kb 及全部编码序列，推定为功能缺失突变（图 2I）。RT-PCR 分析在突变鳍再生组织中未检测到外显子 6–7 的 tph1b mRNA（图 2J）。tph1b⁻/⁻ 突变体发育出正常的鳍，但平均比野生型同胞短 20%、体重轻 55%（图 2K–N）。体型差异在幼鱼期即已显现，并持续至成年期（图 2M、N）。这些结果与血清素缺乏对果蝇（Neckameyer et al., 2007）、线虫（Loer and Kenyon, 1993; Srinivasan et al., 2008; Sze et al., 2000; Waggoner et al., 1998）和小鼠（Cote et al., 2003）生长影响的报道一致。tph1b⁻/⁻ 鳍在 5 dpa 与 60 dpa 评估时与野生型同胞相比大体正常再生（图 2O–R）。再生的 tph1b⁻/⁻ 鳍间充质区缺乏可检测的血清素合成反应（图 2S–V），尽管表皮血清素仍可检测到。突变体再生组织的成骨细胞排列与神经支配大体正常（图 2W–Z）。

综合来看，这些结果表明 Tph1b 在芽基成纤维细胞前体中局部合成血清素，但 tph1b 及其血清素产生对正常鳍再生并非必需。tph1b 突变体中的生长迟滞表明，这一血清素来源还具有其他必需的生理作用。

图 2｜Tph1b 对鳍再生并非必需，但对机体生长重要。（A–D）未受伤 tph1b:mCherry 尾鳍外侧（A–C）或内侧（D）鳍条的横切面，血清素（5-HT，绿色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。（B）成纤维细胞中的细胞内血清素表达。（C）半鳍条区域显示 tph1b⁺ 细胞（箭头）偶尔与血清素染色共定位。（D）内侧鳍条中 tph1b:mCherry 表达弱，无血清素表达。虚线勾勒半鳍条范围。（E）2 dpa 芽基的纵切面，血清素（5-HT，绿色）、增殖细胞（PCNA，红色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。血清素存在于芽基前体中。虚线表示截断面。E 中方框区域的分通道图见 E′（5-HT，绿色）与 E″（PCNA，红色）。箭头指示同时标记 5-HT 与 PCNA 的细胞。虚线表示截断面。（F、G）4 dpa 芽基的纵切面，血清素（5-HT，绿色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。（G）成纤维细胞中的细胞内血清素合成，以及部分浅层表皮细胞中的囊泡性血清素。（F）偶尔在远端基底上皮细胞中检测到 5-HT 染色。（H）未受伤整条尾鳍表皮的光学切面，血清素（5-HT，绿色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。假定腺细胞中表达更强（箭头）。（I）tph1b 基因序列、sgRNA 靶位点（红色箭头，上）与 tph1b 序列缺失的测序验证（下）示意图。（J）tph1b⁻/⁻ 或野生型同胞 3 dpa 鳍的 RT-PCR，检测 tph1b 与 β-actin2。tph1b⁻/⁻ 突变体鳍中缺失 tph1b mRNA（外显子 6–7）。每组 n=3。（K、L）3 mpf 野生型（J）或 tph1b⁻/⁻（K）斑马鱼。tph1b⁻/⁻ 鱼显著小于野生型同胞。至少分析了 4 个独立产卵批次。（M、N）野生型（黑色）或 tph1b 突变体（tph1b⁻/⁻，蓝色）的体重（mg，M）或体长（mm，N）（数据为均数 ± s.e.m.）。*P<0.01，**P<0.001；Mann–Whitney 双尾检验，每组 n=6–9。（O–R）5 dpa（O、P）或 60 dpa（Q、R）时鳍的明场图像。野生型（O、Q）与 tph1b⁻/⁻（P、R）鳍正常再生，尽管体型存在差异。虚线表示截断面。（S–V）野生型（S）或 tph1b⁻/⁻（T）鳍 4 dpa 时的纵切面，血清素（5-HT，绿色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。U（tph1b⁺/⁺）与 V（tph1b⁻/⁻）为高倍放大图。tph1b⁻/⁻ 再生鳍中血清素合成被消除；表皮 5-HT 仍可检测。虚线表示截断面。（W–Z）野生型（V、Y）或 tph1b⁻/⁻（W、Z）鳍条 4 dpa 时的纵切面，成骨细胞（ZNS-5，绿色）（W、X）或神经（乙酰化 α-微管蛋白，绿色）（Y、Z）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。tph1b⁻/⁻ 鳍显示正常的成骨细胞与神经标志物表达。比例尺：K、L 中 5 mm；O–R 中 2 mm。

2.3　截断损伤后 tph1b⁺ 关节成纤维细胞贡献范围扩张

为评估关节相关 tph1b⁺ 细胞在生长与组织稳态中的发育贡献，我们将 tph1b:CreER 个体（Tornini et al., 2016）与 ubi:switch 报告系杂交；后者在缺乏 Cre 介导重组时于多数细胞中报告 EGFP（Mosimann et al., 2011）。发育与个体发生过程中未检测到泄漏重组（Tornini et al., 2016）。为考察生长中幼鱼里 tph1b 表达细胞的贡献，我们在 30 dpf 诱导 tph1b:CreER; ubi:switch 鱼发生重组，在他昔滨（tamoxifen）处理后 7 天（dpt）标记发育中关节附近的细胞（图 3A、B）。这些细胞在发育过程中保持标记并延续至成年期，甚至在标记后 6 个月仍然可见（图 3C–G）。在此期间，我们未检测到其对更远端节段或关节之间区域以外组织的贡献（图 3H）。这些数据表明，关节相关 tph1b⁺ 成纤维细胞在正常生长与稳态条件下专门向关节周围组织贡献。我们推测，这些细胞可能为鳍与关节提供结构支撑，因为它们增殖活性低、在同一位置停留 6 个月或更久，且在缺乏韧带等结构支撑的无关节鳍中无法检测到。

为检验截断损伤如何影响这一受限细胞类型，我们首先在未受伤的 tph1b:CreER; ubi:switch 转基因鱼成体阶段诱导重组，如预期标记了关节周围细胞（图 3I）。在 7 dpt 时，我们在标记细胞的远侧截断 tph1b:CreER; ubi:switch 斑马鱼的鳍。随后逐日追踪并成像标记后代，从 0 至 4 dpa 每日成像，其后在 6、8、10、14 与 60 dpa 成像。我们纵向追踪了 68 个后代细胞簇。截断后，tph1b⁺ 关节成纤维细胞被招募以协助建立芽基。当细胞位于截断面一个节段以内（约 250 μm）时即发生招募，在带有招募区内标记细胞的 85 条被截断鳍条中有 68 条（80%）观察到该现象。2 dpa 芽基的所有区域以及早期（4 dpa）再生组织中均可见标记细胞（图 3J–M）。我们没有证据表明 tph1b⁺ 关节细胞向再生结构贡献了成骨细胞（图 3N）。我们计算了截断后 0、1、2 与 8 周（wpa）时标记细胞簇长度及其相对近远端（PD）贡献（图 3Z；对比图 3H）。虽然后代在生长与稳态期间在定位与扩张上均受限，但 tph1b⁺ 细胞在再生过程中的最终相对 PD 贡献极其异质（图 3O）：tph1b⁺ 成纤维细胞显著贡献于关节间区域（图 3P–T），并沿再生鳍条整个 PD 轴分布，包括远端节段（图 3U–Y）。引人注目的是，虽然标记的 tph1b⁺ 细胞簇在 37 dpf 至 7 mpf 期间沿 PD 轴平均仅扩张 1.3 倍，但鳍再生组织中的细胞簇平均扩张了 50.8 倍（图 3H、Z）。因此，截断之后，tph1b⁺ 细胞将其贡献范围从关节附近的受限定位拓宽到再生鳍的全长。

为评估 evx1⁻/⁻ 背景下与自发损伤相关的 tph1b⁺ 细胞的潜能，我们用 tph1b:CreER; ubi:switch 转基因与他昔滨处理，在这些区域永久标记了少量细胞（图 S1）。截断后，这些标记细胞展现出与关节相关及芽基 tph1b⁺ 细胞相似的贡献再生组织的能力（图 S1B、C）。最后，为评估 tph1b⁺ 关节细胞的必要性，我们生成了可经甲硝唑（Mtz）诱导遗传性细胞消融的 tph1b:mCherry-硝基还原酶（tph1b:mCherry-NTR^pd275）转基因斑马鱼。经 Mtz 处理 3 天后，mCherry 荧光强度平均下降 87%，表明 tph1b⁺ 关节相关细胞被强烈消融（图 S1D、E）。我们在处理后 3 天（dpt）截断鳍并追踪再生 7 天，发现 Mtz 处理鳍与载体对照鳍之间再生无肉眼可见差异（图 S1F、G）。这提示 tph1b⁺ 关节细胞的后代，如同 tph1b 基因产物本身，对正常鳍再生并非必需，系统中的可塑性可补偿其贡献的丧失。

图 3｜tph1b⁺ 成纤维细胞在无损伤时贡献于关节周围区域，但在再生过程中拓宽其贡献。（A–G）tph1b:CreER; ubi:switch 鱼于 30 dpf 用 4 µM 他昔滨处理，尾鳍中标记细胞于他昔滨处理后 7（A、B）、14（C）、21（D）、28（E、F）及 180（G）天被追踪。A 与 E 中方框区域分别在 B 与 F 中放大，显示成年期 tph1b⁺ 细胞及其后代对局部关节组织的贡献有限。（H）正常生长过程中 tph1b⁺ 近远端（PD）细胞簇长度（µm）作图，于 37、44、51 与 210 dpf 测量。tph1b:CreER; ubi:switch 鱼处理同 A。n=31 个细胞簇。标记细胞始终与关节紧密相邻。红框表示最小/最大值，平均值居中。（I）未受伤的成年 tph1b:CreER; ubi:switch 尾鳍，4 µM 他昔滨处理后于 7 dpt 成像。关节附近的 tph1b⁺ 细胞被标记。（J–M）tph1b:CreER; ubi:switch 鱼中一个被标记 tph1b⁺ 细胞的贡献，显示于 0（J）、2（K）、3（L）、4（M）dpa。虚线表示截断面。（N）tph1b:CreER; ubi:switch 鳍再生组织 4 天（再截断后 dpra）的纵切面，成骨细胞（ZNS-5，绿色）、mCherry（DsRed，红色）与细胞核（DAPI，蓝色）染色。我们未发现 tph1b⁺ 关节相关细胞在再生过程中向成骨细胞贡献的证据。（O）tph1b⁺ 细胞后代最终沿 PD 轴分布相对位置的作图，以再生鳍条长度归一化为百分比（0，近端；100，远端）。鳍在被标记 tph1b⁺ 细胞附近截断，后代追踪至 60 dpa。n=68。P，近端；D，远端。（P–T）tph1b:CreER; ubi:switch 鱼中一个被标记 tph1b⁺ 细胞的贡献，显示于 0（P）、1（Q）、2（R）、4（S）、60（T）dpa。关节相关 tph1b⁺ 细胞可向远超关节区域的再生组织贡献后代。（U–Y）tph1b:CreER; ubi:switch 鱼中一个被标记 tph1b⁺ 细胞的贡献（左鳍条），显示于 0（U）、2（V）、6（W）、14（X）、60（Y）dpa。关节相关 tph1b⁺ 细胞可向再生组织的整个 PD 轴贡献后代。（Z）鳍再生过程中 tph1b⁺ 后代长度（µm）作图。成年 tph1b:CreER; ubi:switch 鱼处理同 I。7 dpt 时在标记细胞远侧截断鳍，后代长度于截断后 0、1、2、8 周（wpa）测量。n=20。标记细胞显著扩张了其贡献。

三、结论

我们在此鉴定出斑马鱼鳍中的一个成纤维细胞亚群，它终生与近端鳍关节紧密关联。受伤后，与关节相关的 tph1b⁺ 成纤维细胞协助组装再生芽基，随后其发育潜能扩展到包含沿整个 PD 轴的 tph1b⁻ 关节间成纤维细胞。我们的结果并未否定「谱系限制是细胞对鳍再生贡献的主要机制」这一教条；也就是说，成纤维细胞似乎并不产生成骨细胞，反之亦然。然而我们的结果主张：贡献细胞的发育潜能可以在精细层面上发生改变。既往在斑马鱼鳍中的研究，或在胚胎发育期间随机永久标记细胞（Tu and Johnson, 2011），或标记空间上不受限的标志物特异性细胞群（Knopf et al., 2011; Singh et al., 2012），从而掩盖了空间受限亚群的贡献。我们所描述的结果，鉴定并刻画了一个区域性成纤维细胞群体，它被征用（co-opted）来帮助重建更广泛的成纤维细胞群体。芽基究竟通过何种分子信号改变常驻细胞的发育路径，仍是该领域首要的悬而未决问题。

📎 编辑补充：几个名词的简要说明（译者注，非原文内容）

芽基（blastema）：损伤后由残端组织中重组、迁移并增殖的细胞团，是再生器官的「胚胎样」结构。

近远端轴（proximodistal, PD）：指肢体从躯干向末端的轴向；本文用它衡量「细胞贡献沿肢体长轴展开的范围」。

CreER / ubi:switch：细胞谱系追踪的「遗传开关」——他昔滨诱导 Cre 重组后，特定细胞及其全部后代被永久标记为 EGFP 阳性，从而可逐代追踪去向。

NTR + 甲硝唑（Mtz）：一种「药物消融」手段，特定表达 NTR 的细胞在甲硝唑作用下被选择性杀死，用于检验某类细胞是否必需。

evx1⁻/⁻：缺乏鳍关节结构的突变体，本研究巧妙地利用它「本不该有关节」的部位来反向验证 tph1b 表达与关节位置的空间对应关系。

四、材料与方法

4.1　斑马鱼饲养与操作

所有实验均使用野生型、evx1^i232 突变体（Schulte et al., 2011）、long fin（lof）^d2 突变体（Iovine and Johnson, 2000）、tph1b^pd249 突变体、tph1b:mCherry^ens700（Tornini et al., 2016）、ubi:switch^cz1701（Mosimann et al., 2011）、tph1b:CreER^pd250（Tornini et al., 2016）或 tph1b:mCherry-NTR^pd275（J.D.T. 与 K.D.P.，未发表）转基因斑马鱼，均为 Ekkwill（EK）远交品系、雌雄兼有，实验动物年龄从 5 天至 12 个月不等（按具体实验说明）。饲养水温维持在 26 °C。斑马鱼以苯氧乙醇麻醉，尾鳍使用刀片截断。体长从下颌尖端量至尾柄。除特别注明外，每个实验至少使用 5 尾鱼。所有斑马鱼实验均经美国北卡罗来纳州杜克大学机构动物护理与使用委员会批准。

4.2　tph1b 突变斑马鱼的制备

tph1b^pd249 突变体使用 CRISPR/Cas9 技术生成。简述如下：使用 MEGAscript T7 转录试剂盒（Thermo Scientific）以模板体外转录 sgRNA。5′ 非编码序列靶向寡核苷酸为 5′-gcgTAATACGACTCACTATAGGGGGAGGAGCACGCGCCTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′（下划线为靶序列）。外显子 11 靶向寡核苷酸为 5′-gcgTAATACGACTCACTATAGGAGGAGCTCAGACACGAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′（下划线为靶序列）。单细胞期胚胎共同注射 sgRNA（25 ng/µl）与 Cas9 蛋白（0.5 µg/µl）。缺失系从背鳍 DNA 中筛选，使用引物 tph1b_del_F（5′-AATGTACAGGCCCTCAAACA-3′）与 tph1b_del_R（5′-AAGACAATCTCTAGACAAGG-3′）检测约 850 bp 条带的存在。纯合突变体通过检测外显子 2 无 455 bp 扩增产物来筛选，引物为 tph1b_ex2_F（5′-TCCAACTTTTTCCAATGGATG-3′）与 tph1b_ex2_R（5′-TCAAAATACAAGTAACCGCAACA-3′）。tph1b 的 RT-PCR 在 tph1b 突变体或野生型同胞 3 dpa 鳍的 cDNA 上进行（n=3），引物为 tph1b_F（5′-TACCTGCAGAACCTGCCTCT-3′）与 tph1b_R（5′-GCCAAAAAGTCTCTGGGTGA-3′），预期扩增产物 172 bp。β-actin2 对照引物为 Bact_F（5′-TGATGAGGCTCAGAGCAAGA-3′）与 Bact_R（5′-CACAATCCACACTTCCATGC-3′）。

4.3　组织学

按既往描述（Nachtrab et al., 2013）对 4% 多聚甲醛固定鳍的冷冻切片进行免疫组织化学染色，所用抗体为抗 DsRed（兔，632496，Clontech，1:500）、抗 5-HT（兔，ImmunoStar，1:5000）或 ZNS-5（小鼠，ZIRC，1:200）。抗 5-HT 抗体的血清素染色在 4 °C 过夜条件下于含 0.3% Triton X-100 的 1× PBS 中进行。12 µm 组织切片的成像使用 Leica DM6000B 复合显微镜或 Zeiss LSM 700 共聚焦显微镜完成。

4.4　命运映射（Fate mapping）

成年 tph1b:CreER（Tornini et al., 2016）与 ubi:switch 鱼（Mosimann et al., 2011）杂交，幼鱼期以普遍存在的 EGFP 荧光筛选，幼年期以强 EGFP⁺ 晶状体荧光筛选（对应 tph1b:CreER 转基因）。为永久标记 tph1b⁺ 细胞及其后代，鱼只在指定浓度与时间点接受他昔滨处理 6–12 小时。在标记细胞附近截断尾鳍（标记表现为约 1 至 4 个细胞的小簇），通常切除 50–60% 的组织。成像按既往描述使用 Zeiss AxioZoom 显微镜。除动物在实验过程中死亡、细胞簇内转基因表达被沉默或出现额外重组事件外，不排除任何动物或样本。同窝后代被随机分配至不同组别，实验期间维持每 3 升 12–15 尾鱼的恒定养殖密度，最适条件实验（每 3 升 6–9 尾）除外。所有原始图像使用 FIJI 软件处理，并按各鱼的编号整理以随时间追踪相应细胞簇。原始图像在 FIJI 软件中分割以获得细胞簇位置、截断面与远端平面，测量数据从原始数据中提取。作图使用 GraphPad Prism 软件。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。