题目：Clostridium perfringens Epsilon Toxin Compromises the Blood-Brain Barrier in a Humanized Zebrafish Model

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31030181/

期刊：iScience

研究亮点

l 原ETX特异性结合活体人源化斑马鱼中的hMAL

l 斑马鱼中的hMAL表达使其易受ETX介导的血脑屏障破坏影响

l 活体成像显示ETX介导的水肿、hMAL下调、狭窄和淤滞

l 抗体中和可消除ETX介导的血管病变

摘要

产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）被推测通过与内皮细胞腔面的髓鞘淋巴细胞蛋白（MAL）结合来介导血脑屏障（BBB）通透性改变。然而，该相互作用的动力学以及对ETX在活体内行为的整体认知仍有待阐明。本研究在活的斑马鱼（Danio rerio）中探究了ETX的结合与血脑屏障破坏情况。野生型斑马鱼内皮细胞不与ETX结合。当对斑马鱼内皮细胞进行基因改造以表达人髓鞘淋巴细胞蛋白（hMAL）时，前体ETX的结合呈时间依赖性发生。向表达hMAL的斑马鱼注射活化的毒素会引发血脑屏障渗漏、hMAL表达下调、血管狭窄、血管周围水肿以及血液淤滞。我们提出了一个依赖MAL的ETX结合与神经血管病变的动力学模型。本研究通过构建人源化斑马鱼血脑屏障模型，有助于我们理解ETX诱导的血脑屏障通透性变化，并进一步支持MAL是ETX受体的假说。 

图文摘要

引言

血脑屏障（BBB）将血液复杂的分子与细胞环境和脑脊液经过滤的无细胞环境分隔开来。这一高度活跃的功能性与物理性屏障通过物质排除、被动转运和主动转运，维持人脑内蛋白质和电解质浓度的稳态，并调节单核细胞数量。然而，中枢神经系统（CNS）内的病理过程或血液来源的因素，可能会显著改变血脑屏障的选择性。此外，通过药理学调控血脑屏障以将治疗药物递送至中枢神经系统，或是修复受损的血脑屏障，仍是生物技术领域的核心目标。为了更深入地理解健康与病变状态下血脑屏障的分子机制，我们需要能够实时可视化并定量检测人类血脑屏障功能的技术手段。

产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）是气单胞菌溶素家族成孔毒素的成员。作为毒性最强的细菌毒素之一，ETX被视为潜在的生物恐怖武器，也是反刍动物肠毒血症及相关严重多灶性中枢神经系统白质疾病的致病因子，这一点已被广泛证实。目前关于ETX的研究大多集中在兽医领域，仅有少数ETX介导的人类疾病被报道。有研究提出ETX可能是人类脱髓鞘疾病——多发性硬化症（MS）的致病因子，这一假说也得到了近期研究的支持。ETX似乎通过血脑屏障（BBB）的开放进入中枢神经系统。该毒素会严重破坏血脑屏障血管的完整性，进而使其进入脑实质。然而，ETX跨越血脑屏障的具体机制目前仍不明确。

ETX 对特定细胞类型具有特异性，且无法与不含蛋白质的膜模型相互作用，这表明该毒素通过蛋白质受体发挥作用。尽管 ETX 的受体尚未明确，但已有少数候选蛋白被鉴定出来。ETX 受体位于易感细胞的去污剂抗性膜（即脂筏）的顶端表面。ETX 的结合与细胞毒性依赖于四跨膜蛋白髓鞘与淋巴细胞蛋白（MAL）的表达。已知 MAL 在脂质筏的形成、稳定和维持中发挥作用，作为 ETX 的受体候选分子具有特别大的吸引力，因为它在肾脏远端集合管和中枢神经系统髓鞘中均有表达，而这两个部位是 ETX 已明确的两个作用靶点。值得注意的是，研究还表明 MAL 在小鼠脑内皮细胞中特异性富集，在人类原代脑内皮细胞中也同样富集。我们此前已证实，ETX（1）能特异性结合表达 MAL 的中国仓鼠卵巢细胞（CHO），（2）可特异性杀伤表达 MAL 的 CHO 细胞，（3）与 MAL 共定位，（4）不与 MAL 缺陷型小鼠（MAL⁻/⁻）的血管系统或髓鞘结合，（5）不会在 MAL⁻/⁻ 小脑切片培养中引发体外脱髓鞘作用。近期，这些结果得到了验证，且通过免疫共沉淀实验证实了 ETX 与人类 MAL 之间存在相互作用，这表明 MAL 可能是 ETX 的受体，或至少是 ETX 孔蛋白复合物的关键组成部分。

ETX 以 32.9 千道尔顿的原毒素（pETX）形式释放，其活性约为活化形式的千分之一。随后，pETX 会被细胞外丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶和糜蛋白酶）或λ毒素（一种类嗜热菌蛋白酶的金属蛋白酶）切割并活化，形成活性更强的形式。pETX 与活性 ETX 对其受体的特异性和亲和力基本一致，这一点可由原毒素能够阻断活性 ETX 的活性，且二者均能结合脂筏和相同细胞类型得到证实。因此，pETX 是评估 ETX 结合动力学的有用工具，同时还能保留其定位组织的完整性。与 pETX 不同，活性毒素与受体结合后会诱导孔道形成，进而导致细胞死亡。活性 ETX 形成孔道的过程是毒素单体在细胞表面招募形成同源七聚体，进而生成前孔复合物的结果。该前孔复合物随后嵌入易感细胞的脂质双分子层，形成 0.5 至 1.0 纳米的孔道。血脑屏障中的孔道形成被认为会引发血管选择性和结构的改变。相比之下，原毒素无法形成寡聚体，这可能是由于其 C 端在复合物形成过程中产生了空间抑制效应。研究 ETX 介导的细胞和分子病理机制时，已采用体外技术、ETX 敏感细胞系或离体组织学方法。由于缺乏能够在完整微环境中实时探究 ETX 作用机制和活性的活体体内模型系统，我们对 ETX 介导的血脑屏障通透性的理解受到了限制。

为了在体内实时研究ETX诱导的血脑屏障通透性，我们开发了一种表达人血脑屏障相关黏附分子（hMAL）的斑马鱼模型系统。斑马鱼体型小、成本低、繁殖量大、繁殖频率高，且最关键的是其幼体阶段呈半透明状，能够实现活体生物中报告基因的可视化，因此特别适合用于体内血脑屏障完整性和局部病理的研究。研究人员已构建出在FLI1增强子/启动子下标记内皮细胞的转基因品系，可用于脉管系统的精准研究。近期关于斑马鱼血管形成的研究表明，其体内会形成与哺乳动物相似的血脑屏障，早在受精后3天（DPF），该屏障对500道尔顿分子的通透性就已具有限制性。此外，研究人员已在斑马鱼体内检测到ZO-1、紧密连接蛋白5等已知的哺乳动物血脑屏障紧密连接蛋白。科学家们利用这些研究发现与技术创新，借助斑马鱼探究了多种细菌、病毒感染以及毒性损伤对循环系统和血脑屏障完整性的影响。这些研究成果为在这一尚未充分利用的模式生物中开展ETX诱导的屏障功能障碍研究提供了依据。

尽管斑马鱼表达MAL，但我们此前已证实，表达斑马鱼MAL（zMAL）的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞不结合ETX。然而，这并不排除斑马鱼可能存在另一种不同于MAL的ETX受体的可能性。本研究证实，斑马鱼神经血管系统不结合ETX，而将人MAL（hMAL）导入内皮细胞（EC）后，原毒素会发生特异性、高亲和力结合。我们进一步通过研究发现，MAL家族中的四跨膜蛋白BENE无法结合原毒素（pETX），从而明确了MAL对ETX毒性的特异性需求。我们还通过实验获得了动力学证据，证明ε毒素在活体生物中会快速影响血脑屏障（BBB）通透性、血管狭窄、局灶性血管周围水肿以及hMAL受体的下调。最后，我们证实，抗ETX中和抗体能够抑制ETX对血管产生的所有相关作用表达hMAL的鱼类中的病理变化。总体而言，这项功能获得性研究进一步证实了MAL对于ETX发挥作用的必要性，在人源化血脑屏障模型中揭示了ETX介导的病理机制，更广泛地说，还明确了ETX在完整微环境中发挥作用的精确时间线。

结果

野生型斑马鱼的血管系统不结合ε毒素

确立斑马鱼模型适用于 ETX 毒性研究的第一步，是检测野生型（WT）斑马鱼的血管是否对 ETX 具有亲和力。尽管此前有研究报道 ETX 不结合 zMAL，但斑马鱼可能表达除 MAL 之外的特定 ETX 受体。为证明斑马鱼缺乏 ETX 的特异性结合位点，研究人员对斑马鱼冰冻切片进行了免疫组织化学检测（图1）。

制备了成年（8至16周龄）小鼠大脑和成年（受精后17个月）斑马鱼大脑的组织学切片。将矢状切片与pETX共孵育，并使用针对ε毒素的高亲和力单克隆抗体进行毒素结合免疫染色。免疫组织化学结果显示，斑马鱼小脑分子层不与pETX结合（图1）。相比之下，pETX特异性结合小鼠颗粒层的髓鞘，并定位于小鼠血脑屏障微血管，这一点通过BSL1染色得到了证实。值得注意的是，pETX无法与斑马鱼小脑血管结合。

图1. 重组ETX结合野生型小鼠神经血管系统，而不结合野生型斑马鱼神经血管系统（A）小鼠和斑马鱼矢状切面示意图，突出显示了小脑和成像区域（蓝色方框）。（B）用pETX探针对两种生物的切片进行处理，并用兔抗ETX一抗孵育，随后与cy3抗兔二抗/BSL1共同孵育。蓝色的DAPI封片液标记细胞核，绿色的BSL1标记血管，红色的pETX，“合并”图像为三张彩色图像的完全叠加。在小鼠阳性对照的每个切片的所有区域中，pETX均与BSL1标记的血管共定位（白色箭头），如“合并”图中的黄色血管所示，但在任何斑马鱼切片中均未检测到pETX。毒素还与小鼠阳性对照的颗粒层强烈结合（蓝色箭头）。中心图像为40倍放大拍摄，所有条件下的曝光时间均相同。ML：分子层；GL：颗粒层。比例尺：50微米。

斑马鱼幼体特异性地将ETX结合至表达hMAL的血管

由于斑马鱼无法结合pETX，我们在功能获得性实验中使用该模式生物，以探究hMAL的细胞特异性表达是否赋予其特异性结合ETX的能力，以及该基因是否足以诱导ETX介导的血管病变特征。为检测ETX是否与表达hMAL的斑马鱼血管结合，我们在FLI1内皮启动子/增强子的调控下，将融合绿色荧光蛋白报告基因的hMAL（hMAL-GFP）注射到斑马鱼受精卵中，实现瞬时表达（图2A）。成功表达该报告基因的斑马鱼随后在受精后3-4天（DPF）注射Alexa 647荧光标记的pETX，以观察其结合情况。我们将这些样本与注射了在同一启动子下表达同一蛋白脂类家族受体hBENE-GFP质粒的斑马鱼进行对比，既排除了非MAL依赖性结合的可能性，也验证了ETX与MAL相互作用的特异性。共聚焦显微镜观察显示，pETX与表达hMAL-GFP的血管发生结合，而在hBENE-GFP对照组中，除循环中未结合毒素的基础水平外，未检测到明显结合（图2B）。

对表达hMAL-GFP和hBENE-GFP的血管进行分析后发现，其与Alexa 647-pETX的共定位存在显著差异。共定位的定量评估方法为：首先设定GFP阈值以明确内皮细胞（EC）的定位区域，随后确定与这些GFP体素特异性相关的Alexa 647 pETX总信号百分比（图2C，Student's t检验，(p=0.0028)）。为评估pETX的结合动力学，对表达hMAL-GFP或hBENE-GFP的斑马鱼进行节间血管（ISVs）的延时成像，这些血管均高表达hMAL-GFP或hBENE-GFP。结果显示，hMAL-GFP以时间依赖性方式结合pETX，表现为hMAL-GFP血管内的Alexa 647 pETX强度随时间逐渐升高，结合峰值出现在注射后54分钟（MPI）；而hBENE-GFP血管内的pETX-647强度则随时间降低，未观察到可证实的结合现象（分别对应图2D和图2E）。延时视频证实，pETX会随时间从血管腔移动至节间血管壁的hMAL-GFP区域（视频S1），但在hBENE-GFP对照血管中无此现象（视频S2）。为排除非特异性蛋白质-蛋白质相互作用的影响，我们使用了pETX H149A突变体；此前研究表明，该突变体对MDCK细胞的活性降低，且对小鼠具有毒性，同时其结构与野生型（WT）毒素仍保持相似性。将荧光标记的pETX H149A突变体注射到由FLI1启动子调控、瞬时表达hMAL-GFP的斑马鱼体内后，四条斑马鱼中有两条在表达hMAL的血管中出现了荧光pETX H149A的微弱积累，表明其在活体、体内环境中与hMAL的结合亲和力较低（图2E及视频S3）。相比之下，通过流式细胞术检测发现，H149A突变体毒素与表达hMAL的CHO细胞无可检测到的结合（图2F）。

图2. pETX以时间依赖性方式结合斑马鱼间静脉中表达的hMAL-GFP(A) 示意图展示斑马鱼转化策略、毒素注射位点和显微镜观察焦点。将含hMAL-GFP或hBENE-GFP的质粒与tol2转座酶共同注射到1细胞期斑马鱼胚胎的细胞中。受精后3-4天（DPF）的阳性鱼向库维氏管注射Alexa 647标记的pETX以进行全身性感染。蓝色方框为(B)中的成像区域。(B) 表达hMAL-GFP的斑马鱼与表达hBENE-GFP的对照斑马鱼的节间血管（ISVs）的403张共聚焦z堆栈图像。比例尺为25毫米。ISV：节间血管；DLAV：背侧吻合血管。(C) 共定位定量指标“GFP血管中共定位的ETX物质百分比”，表示注射后1小时，自动设定阈值以上，pETX体素在hMAL-GFP斑马鱼节间血管（((n = 6 fish))）与hBENE-GFP对照节间血管（((n = 7 fish))）中共定位的百分比。数据以平均值±标准误（SEM）表示。统计分析：非配对双尾Student's t检验（((^{* *} p<0.01))）。（D）将ISV管壁上等体积的绿色荧光蛋白（GFP）渲染为Imaris表面，每条鱼在90分钟内以30秒为间隔追踪该表面内GFP和647荧光的总强度。绘制了人麦芽糖凝集素（hMAL）和人BENE（hBENE）瞬时信号中647-pETX/GFP的比值随时间的变化情况。每个时间点每条鱼的单独比值以不透明圆点表示，每个时间点的平均比值以较深的线条表示。（E）注射后三个时间点，647 标记的 pETX 或 647 标记的 H149A pETX 的快照图像，以及与受体的“合并”图像。蓝色箭头突出显示毒素的积累。比例尺，20 微米。（F）流式细胞术分析pETX或H149A pETX与hMAL、rMAL或GFP中国仓鼠卵巢细胞的结合情况。另见视频S1、S2和S3。统计分析：采用Tukey检验的双因素方差分析 ((^{* * * *} p<0.0001))

活性ETX导致表达hMAL的斑马鱼血脑屏障出现渗漏

在确定了pETX在活体条件下对hMAL的特异性亲和力及其结合动力学后，研究人员随后开展实验，以评估hMAL在受到活化毒素刺激后对血脑屏障（BBB）渗漏的影响（图3A和图4A）。共聚焦显微镜观察发现，仅在表达hMAL的斑马鱼中，与活化ETX共同注射的2000千道尔顿若丹明葡聚糖染料会从注射后15分钟（MPI）到注射后2小时（HPI）发生渐进性渗漏（图3C和视频S4），而在表达hBENE的对照组中则未出现此现象（图3B和视频S5）。此外，表达hMAL且与H149A突变体ETX共同注射的斑马鱼也未表现出血管渗漏的迹象（图S3A）。在hBENE和H149A突变体ETX对照组中，毒素均被限制在血管内；对比注射活性毒素的hMAL斑马鱼（图3C'），在注射后2小时对受体和毒素进行Imaris表面渲染时，这一特点尤为明显（图3B'和图S3B）。对葡聚糖渗漏的定量评估以细胞外/细胞内葡聚糖比值（“E/I”，详见透明方法公式1）表示，结果证实，在注射后2小时，hMAL+活性ETX组与hBENE+活性ETX组、hMAL+H149A pETX组之间的渗漏存在显著差异（图3D，采用Tukey检验的双因素方差分析，P值分别为0.0001、0.0006）；且在hMAL+活性ETX组内，注射后15分钟与2小时、1小时与2小时的时间点之间渗漏也存在显著差异（图3D，双因素方差分析）通过Tukey检验，(p ≤0.0001) 0.0001、0.0006）。这一发现表明，血脑屏障完整性的进行性降低仅在表达hMAL且经活性ETX处理的斑马鱼中显著显现。

图3. 激活型ETX与2000千道顿罗丹明葡聚糖共注射可在表达hMAL的鱼体内引发显著的血脑屏障渗漏(A)展示实验步骤的示意图。（B）代表性hBENE-GFP瞬时表达的对照斑马鱼中，大脑前背侧象限脉管系统的403共聚焦z-stack图像。hBENE-GFP受体呈绿色，2000千道尔顿若丹明葡聚糖呈红色，“合并”图像显示两个通道，“合并宏观”图像显示全脑神经脉管系统。“合并宏观”中的蓝色框突出显示了其他图像的聚焦区域；15分钟、1小时和2小时表示毒素或葡聚糖注射后开始z-stack成像的时间。“合并宏观”中的比例尺为50微米，其余图像中的比例尺为30微米。（C）与（B）相同，但为表达hMAL-GFP的斑马鱼。（B0）Imaris“表面”渲染图，绿色为hBENE-GFP，红色为若丹明葡聚糖，用于量化注射后2小时血管腔内GFP总荧光强度及血管腔内总“血管内”若丹明荧光强度。（C0）与（B0）相同，但为hMAL-GFP斑马鱼。(D) 葡聚糖渗漏的定量分析：通过测定注射后15分钟、1小时和2小时的血管外葡聚糖总强度除以血管内葡聚糖总强度（“葡聚糖E/I”）来确定。数据来自以下实验：注射了活性ETX的hBENE-GFP斑马鱼（编号((n=5))）、注射了活性ETX的hMal-GFP斑马鱼（编号((n=6))），以及注射了突变体对照H149A pETX的hMal-GFP斑马鱼（编号((n=4))）数据以平均值±标准误表示。统计分析：采用双因素方差分析结合Tukey检验（((^{* * *} p<0.001)、(* * * p<0.0001)）。另见图S3及视频S4、S5 

尽管FLI1内皮启动子/增强子将转基因表达限制在内皮细胞（ECs）中，但单条斑马鱼中表达相关转基因的内皮细胞比例在40%至70%之间。内皮谱系中的表达不全通常表现为仅一半大脑表达转基因，这为我们提供了一种新型内部对照。在单条斑马鱼体内，我们在受体高表达区域与2小时后（HPI）转基因表达极低或未检测到的对侧大脑相同区域进行了对比（图4B和图4C）。这一结果证实了hMAL的表达是血脑屏障（BBB）破坏的必要条件，在该时间点，仅在hMAL+活性ETX处理组中，这两个区域（受体表达区与无受体区）的葡聚糖渗漏量存在显著差异（图4C，采用Tukey检验的双因素方差分析，(p=0.0008)）。

图4. 在个体表达hMAL-GFP的鱼中，右旋糖酐在受体表达血管所分布的脑区中的渗漏量显著高于无受体表达的区域(A)注射与成像策略示意图。(B) 一条代表性斑马鱼的共聚焦z轴堆叠图像，该鱼瞬时表达hMAL-GFP（绿色），并注射了活性毒素和2000千道尔顿的若丹明葡聚糖（红色），右侧为仅红色葡聚糖通道的图像。由于表达的嵌合特性，大多数斑马鱼仅在大脑的特定区域表达受体，如图所示，通常仅在大脑的一侧表达。白色箭头指示明显渗漏的区域。蓝色和橙色框代表(C)中量化的大脑象限。(C) 各条件下每条斑马鱼在注射后2小时（HPI），大脑中高葡聚糖表达量区域（蓝色）与低葡聚糖表达量区域（橙色）的兴奋/抑制（E/I）比率量化结果：转染hBENE并注射活性ETX的斑马鱼（n=5/大脑侧）、转染hMAL并注射活性ETX的斑马鱼（n=6/大脑侧）、转染hMAL并注射H149A突变体pETX的斑马鱼（n=4/大脑侧）。仅在hMAL+活性ETX条件下，大脑两侧出现显著差异（双因素方差分析结合图基检验，(p=0.0008)）。数据以平均值±标准误（SEM）表示。

活性ETX导致hMAL瞬态中血脑屏障血管狭窄、血管周水肿和血流停止

除了明显的渗漏现象外，研究人员还通过共聚焦成像观察了其他此前已报道的ETX诱导的血管病变，并探究hMAL是否是这些现象出现所必需的。此前已有研究报道的血管腔压缩现象在大多数表达hMAL的血管中均有明显表现（图5A）。对脑中央动脉（CCtAs）的评估显示，在用活性ETX处理的表达hMAL的血管中，血管腔直径在15分钟注射后（MPI）至2小时注射后（HPI）之间呈进行性缩小（图5B，采用Tukey检验的双因素方差分析，(n=6)）；而在表达hBENE并经活性ETX处理的组（((n=5))）或表达hMAL并经H149A突变型pETX处理的对照组（((n=3))）中，未观察到该现象。表达hMAL并经活性ETX处理的组与hBENE及H149A对照组在脑中央动脉腔直径上的显著差异始于1 HPI（采用Tukey检验的双因素方差分析，79a0dc4-c1e5-4ebe-8581-dcf8a9180414，P=0.0104）。此外，作为ETX毒性和多发性硬化症（MS）共同特征的血管周围水肿，在两条表达hMAL的斑马鱼中也有明显表现（图5C及视频S6），对照组中则未出现该现象（视频S7）。在这两种情况下，水肿的位置均与葡聚糖渗漏的区域直接对应，且最早在15 MPI时就出现在受体高表达的血管中。值得注意的是，这些急性水肿区域优先出现在穿过小脑的血管中。在50 MPI时，对脑部血管血流进行的10秒快速延时成像验证了这一推测，同时也证实了hMAL的必要性：在表达hMAL-GFP的血管中，血流似乎完全停止（视频S8）；而在同一条斑马鱼体内相同的非hMAL表达血管中，以及对照组斑马鱼的所有血管中，血流均未受影响（视频S9和S10）。

图5. 活性ETX导致血管狭窄和血管周水肿(A)注射活性毒素后15分钟、1小时和2小时，表达hBENE-GFP和hMAL-GFP的斑马鱼大脑中央动脉（CCtAs）的共聚焦放大图像。绿色通道显示这些血管中的受体表达情况，灰色通道为微分干涉差图像，“合并”为两张图像的叠加图。比例尺为10微米。(B) 各条件下CCtA血管直径随时间变化的定量对比；从注射后1小时开始，暴露于活性ETX的hMAL CCtA直径显著窄于暴露于ETX的hBENE CCtA或暴露于H149A突变体pETX的hMAL CCtA，且从注射后15分钟到2小时直径显著减小（采用Tukey检验的双因素方差分析，(^{*} p<0.05)、(^{* *} p<0.01)）。数据以平均值±标准误表示。(C) 表达hMAL-GFP的斑马鱼大脑呈现血管周围水肿的共聚焦微分干涉差宏观z轴切片，以及(C0)单条血管的放大图。(D) 图(C)中hMAL-GFP与右旋糖酐通道的合并图像，以及(D0)放大单条血管的合并图。整体图像比例尺为25微米，放大血管比例尺为10微米。另见图S3及视频S6、S7、S8、S9、S10。

活性ETX导致hMAL表达下调

在这项体内实验制备中，一个意外发现是活性ETX刺激下hMAL受体的独特循环过程。在15分钟（MPI）时，与hBENE-GFP相比，hMAL-GFP的表达在血管边缘呈现点状分布（图6A）。对比经活性ETX和H149A突变体pETX处理的hMAL-GFP血管可知，这种点状分布由活性毒素介导，并非仅由hMAL与hBENE受体表达差异导致，因为经突变体毒素处理的hMAL血管与经活性毒素处理的hBENE表达血管外观无明显差异。此外，图像和定量分析显示，在hMAL+活性ETX处理条件下，受体蛋白总水平随时间逐步下降，GFP荧光强度也出现显著百分比降低，且这种下降在hMAL+活性ETX ((n=6))组与hBENE+活性ETX组之间均有体现ETX ((n=5)) 以及 hMAL + H149A pETX ((n=4)) 从感染后1小时开始出现差异（图6B，采用Tukey检验的双因素方差分析，P=0.0107）。

图6. ETX导致hMAL受体减少和回收（A）在15 MPI、1 HPI和2 HPI下表达hBENE-GFP或hMAL-GFP的神经血管系统的代表性共聚焦图像，用活性毒素或H149A pETX进行攻击。比例尺，30毫米。（B）使用15 MPI作为起点的每种情况下受体-GFP总和强度的百分比变化。在hMAL+活性ETX和从1 HPI开始的对照之间达到受体-GFP强度的显着百分比变化（Tukey测试的双向方差分析；(^{*} p<0.05)，(^{*} p<0.01)(* * p<0.001).(****p<0.0001)）。数据表示为平均值±SEM。

抗ETX中和抗体可抑制ETX毒性

为确定ETX细胞毒性在体内的特异性，在向表达hMAL-GFP的鱼注射ETX之前（((n=4)) Linden et al.,2018），将ETX与针对ETX的中和单克隆抗体JL008预先孵育。相同实验参数的共聚焦图像分析显示，葡聚糖被良好限制在血管内，CCtA管腔直径正常，且血流稳定通过hMAL-GFP标记的血管（视频S11）。定量分析证实，在注射后2小时（HPI），中和处理的ETX与活性ETX的内皮/免疫细胞（E/I）指标存在显著差异（采用图基检验的双因素方差分析，(p=0.0003)），而与H149A突变型pETX相比无显著差异（图7A）。表达hMAL的脑区与不表达hMAL的脑区之间，葡聚糖渗漏程度也无显著差异（图7B）。经中和处理的ETX处理组与活性ETX处理组相比，CCtA管腔直径也存在显著差异（图7C，采用图基检验的双因素方差分析，(p=0.0004)）。中和处理的ETX处理组与活性ETX处理组相比，注射后15分钟（MPI）至注射后2小时（HPI）hMAL-GFP表达的降低幅度百分比也存在显著差异（图7D）。采用双因素方差分析结合图基检验（(p=0.0047)）。因此在所有毒性指标中，活性ETX均被中和性抗ETX抗体有效中和。综合来看，这些数据表明：（1）ETX诱导的病理具有特异性；（2）该抗体有望用于治疗ETX诱导的疾病。

图7. 抗毒素对ETX的中和作用可消除所有毒性指标（A和B）（A）从15小时受精后到2小时受精后，对注射了中和的ETX ((n=4))、活性ETX ((n=6))或H149A pETX ((n=4))的表达hMAL-GFP的鱼进行葡聚糖渗漏（葡聚糖）的定量比较，以及（B）大脑两个相同区域（一个受体高表达、一个表达极少）之间的葡聚糖渗漏情况。（C）对用这三种制剂处理的表达hMAL-GFP的血管中CCtA管腔直径进行定量比较。（D）以15小时受精后为基线，对每种处理的hMAL-GFP强度变化百分比进行定量比较。所有统计分析均采用双因素方差分析结合图基检验；(^{*} p<0.05) (^{*} p<0.01)。(^{* *} p<0.001)。(* * * * p<0.0001)）。数据以平均值±标准误表示。支持性图像见图3和图S2。 

讨论

这项研究作为一个整体，提供了实时ETX结合、受体下调和通过活成像在整个动物中破坏BBB的证据。斑马鱼模型技术的发展，包括现成的网关克隆结构、可靠的注射方案及其在共聚焦显微镜中的易用性，允许在这里精确审查ETX在完整微环境中的作用。当生物暴露于ETX时，可以深入了解MAL受体是否足以诱导ETX介导的血管病理学特征，因为斑马鱼仅在hMAL基因表达时表现出显著的BBB渗漏、神经血管压迫、血流停止、血管周围水肿和受体下调。短暂表达的马赛克鱼的存在，而不是稳定的转基因鱼，进一步肯定了受体的充分性，因为在单个鱼中只有明显受体表达的血管片段显示了病理。

延时成像技术可实时检测pETX与hMAL的结合动力学，毒素进入血管内间隙后约1小时达到结合峰值。毒素结合峰值与ETX处理后首次出现显著神经血管变化的时间点一致。该时间点与亚致死剂量活化ETX注射的小鼠中首次观察到内皮损伤的时间，以及pETX处理后内皮屏障抗原发生变化的时间相吻合，进一步证实了斑马鱼模型适用于此类研究。当然，血管病变的这一时间序列会随毒素浓度不同而改变；此前研究显示，使用更高的致死浓度并追踪更小的大分子时，早在静脉注射后30秒即可观察到多种大分子的明显渗漏。此外，尽管仅在1小时时达到统计学显著性，但整体成像结果显示在注射后15分钟即已出现渗漏和血管变化。与此前研究报道的结果不同——此前研究在体外极化的MCDK细胞中未观察到ETX诱导的大型（38.5千道尔顿）葡聚糖渗漏，或通过死后组织病理学方法未观察到BSA的渗漏——本研究发现2000千道尔顿的大型葡聚糖发生显著渗漏，该葡聚糖会在特定表达hMAL的血管处聚集并随时间扩散。本研究与此前研究在葡聚糖渗漏尺寸上的显著差异，可能源于斑马鱼与啮齿动物血脑屏障在发育和进化层面的差异。尽管本研究选择的时间点（受精后6-7天）已超过斑马鱼紧密连接蛋白表达的起始时间，且晚于类似的毒理学研究，但斑马鱼血脑屏障在受精后6天之后的选择性会不断增强，开始对更大的葡聚糖产生排斥。因此，对ETX诱导的渗漏在受精后7天之后的评估是一项未来进行实验的可能性是存在的，不过这个较晚的时间点需要构建体的稳定表达。大分子葡聚糖的渗漏也可能是由于hMAL蛋白的异位过表达导致的，尽管整体图像分析显示，hMAL表达最丰富的区域未必是渗漏最严重的区域，实际上仅需极少的MAL表达就能观察到局部渗漏。毒素引发如此大的示踪剂渗漏，最可能的原因是本研究中注射的ETX剂量仍相对较高。本研究使用的ETX剂量很可能导致了受体饱和和最大程度的孔道形成，进而造成血脑屏障的大量渗漏。渗漏也有可能是由于内皮细胞暴露于ETX后产生的细胞毒性所致。尽管体外实验表明表达hMAL的中国仓鼠卵巢细胞在高浓度ETX暴露下具有极高的存活抗性，但仍需进一步的实验来在完整的微环境中排除这一可能性。

研究还评估了H149A突变体pETX作为结合和毒性实验对照的适用性。本研究表明，H149A与野生型（WT）ETX对MDCK细胞的结合亲和力相似（数据未展示）；既往研究则显示，该突变体与野生型原毒素的结构相似，但毒性降低。pETX与hMAL细胞及组织的结合研究结论尚不明确。尽管与野生型pETX相比，在表达hMAL的鱼体内，突变体原毒素随时间的荧光共定位现象确实有所减少，但在四条表达hMAL的间静脉（ISV）中有两条观察到了突变体原毒素少量积累的明确证据。相比之下，流式细胞术结果显示，突变毒素与hMAL无显著结合，但与rMAL存在显著结合。这种差异可能由多种原因导致。首先，毒素对MAL不同同源物的结合亲和力可能存在差异。其次，使用细胞系开展的体外细胞实验，可能无法为H149A-pETX与hMAL的结合提供最佳微环境。例如，MDCK细胞对H149A-ETX敏感，但ACHN细胞对其几乎无敏感性。ACHN细胞中不表达但在体内血管组织中表达的潜在共受体，可能与MAL协同作用，形成适宜的H149A-pETX结合位点。此外，已知该突变体在小鼠体内的毒性降低67倍，体外实验可能不足以检测到突变体原毒素与hMAL的结合——本研究显示野生型原毒素在基线水平下与不足50%的hMAL-CHO细胞结合。而本研究的体内活体实验灵敏度更高，因此检测到了突变体的少量积累。无论H149A-pETX在体内与体外的结合情况存在何种差异，该突变体均被证实适用于毒性实验的对照，因为本研究结果表明，尽管其在四条鱼中的两条体内发生了结合，但未发现H149A-pETX介导的血管病变证据。

本研究证实了此前关于ETX诱导血脑屏障血管狭窄、血管周围水肿以及随后血流速率降低的研究发现。Sakurai等人提出假设，认为他们在注射活性ETX的小鼠中观察到血流速率降低的现象，是由于该毒素的血管“升压”作用所致，因为实验中未检测到心率的变化。随后，该研究团队又发现ETX会介导一定程度的主动脉收缩，但同时也证实ETX介导的血压升高最可能的原因是阻力动脉的收缩。在本研究中，我们检测直径变化的血管为颈总动脉（CCtA），该血管被平滑肌细胞包裹，且表达Yap1蛋白，该蛋白可使血管直径随血流变化而调整，这表明其属于阻力动脉。因此，通过活体成像技术，本研究证实了ETX介导的血流速率变化源于其血管收缩特性。此外，本研究还实现了ETX注射后血流的实时成像，结果显示在表达hMAL的血管内血流完全停止。这种剧烈的血流变化表明，在高剂量下，ETX介导的神经病变可能包括缺氧或缺血。这一发现与早期一项基于多普勒技术、针对海马体且使用低于本研究剂量的分析结果相悖。综合来看，低剂量ETX会导致中等分子量（最高38千道尔顿）的示踪剂渗漏、内皮起泡以及血管周围肿胀，但仍能维持稳定的血流。相比之下，本研究中使用的高浓度ETX则会导致更大分子量（最高2000千道尔顿）的葡聚糖渗漏、血管严重受压以及血流终止。

最近，通过对经ε毒素处理的人淋巴细胞裂解物进行蛋白质印迹分析，研究人员发现MAL与ε毒素可发生共免疫沉淀反应。这表明MAL与ε毒素会以蛋白质复合物的形式共同沉淀，也提示二者之间可能存在直接的蛋白质-蛋白质相互作用，不过这一点尚未得到证实。本研究在体内实验中证实了这一发现，因为我们观察到了活性斑马鱼体内pETX与hMAL-GFP的共定位现象。此外，我们还检测到了ETX 处理后 hMAL-GFP 荧光出现下调，这提示 ETX 与 MAL 结合可能导致 MAL 的内吞与降解。我们还验证了此前的功能获得性实验结果，即 MAL 是 ETX 结合与毒性作用所必需的。此前已有体外研究利用 MAL 蛋白的啮齿动物同源物（rMAL）和活性毒素报道了此类下调现象，而本研究在人 MAL 上得到的相似发现，进一步将该结论的适用性拓展至人类模型。此外，在完整的微环境中观察到这一显著现象，更增强了其生物学意义。综上，这些数据有力表明 MAL 是 ETX 的受体。

针对ETX的特异性单克隆抗体JL008完全消除了经分析的所有ETX介导的病理指标。这既表明JL008可作为后续ETX研究的对照试剂，也使其在其他已测试的ETX中和抗体中成为ETX中毒潜在治疗药物的候选。然而，该研究结果是在ETX注射到活体生物前孵育一小时的条件下获得的。需开展进一步测试，以探究在ETX注射后给予JL008是否能在体内减轻该毒素的作用，并确定预防ETX诱导病理所需的时间进程和剂量进程。斑马鱼模型已逐渐成为药物研发和筛选的平台。构建一种内皮细胞特异性表达hMAL的转基因斑马鱼品系，将使该模型成为通过高通量药物筛选实验评估抗ETX治疗药物的理想候选模型。

要解答关于ETX介导的多发性硬化（MS）假说的最后一个问题，斑马鱼将是理想的研究模型：ETX进入中枢神经系统（CNS）后是否会引发脱髓鞘病变？针对这项脱髓鞘检测实验，此前的发育生物学研究已证实，斑马鱼拥有由少突胶质细胞和施万细胞构成的成熟髓鞘，这些细胞出现的时间节点与小鼠相对接近，且表达多种相同的蛋白质标志物。近期，研究人员利用经典的溶血卵磷脂模型以及实验性变应性脑脊髓炎（EAE）模型在斑马鱼身上成功实现了脱髓鞘效果，此后斑马鱼也被提出作为多发性硬化建模的研究对象。

我们此前曾报道，在野生型（WT）小鼠模型中，ETX攻击会引发脱髓鞘病变，而在MAL基因敲除小鼠中则不会；同时我们也指出，ETX与大鼠MAL（rMAL）的结合亲和力高于人类MAL（hMAL），且rMAL-CHO细胞的死亡程度也高于hMAL-CHO细胞。因此，尽管这一推测看似合理，但目前尚不清楚ETX是否会导致人类发生脱髓鞘病变。即便会引发该病变，引发此类中枢神经系统损伤所需的毒素浓度也仍未明确。本研究中构建的人源化模型等，能够为解答这些关键问题提供必要且重要的见解。

斑马鱼是尤为合适的选择，因为正如我们在本研究中所证实的，与小鼠模型不同，斑马鱼通常对ETX不敏感。一项极具说服力的后续研究将是培育出在血管内皮细胞（ECs）和少突胶质细胞中同时表达两种报告基因标记的人源MAL（hMAL）构建体（采用两种不同的报告基因）的斑马鱼，随后观察血脑屏障（BBB）是否发生穿透以及是否出现脱髓鞘病变，若发生则进一步探究此类病理变化的动力学特征。本研究有望对ETX-MAL介导的多发性硬化进行最全面的模拟，还原其在完整微环境中可能发生的真实过程。

表明人类对ε毒素（ETX）易感的直接证据有限；不过，有报道称人类感染了表达ε毒素的产气荚膜梭菌毒素型并引发了相关疾病。有一篇病例报告证实，一名患者出现坏疽性髂骨炎，并分离出了分泌ε毒素的D型产气荚膜梭菌。在另一项报告中，研究人员直接从一名强直性脊柱炎患者的血清中分离出了ε毒素。此外，有两项研究从气性坏疽患者体内分离出了D型产气荚膜梭菌。越来越多的证据表明，ε毒素与多发性硬化症（MS）存在关联，研究人员从一名多发性硬化症患者体内分离出了分泌ε毒素的B型产气荚膜梭菌，且患者血清中富集了针对该毒素的抗体。已知ε毒素可结合人类肾细胞系以及马尾髓鞘。然而，目前尚无研究报道该毒素是否能结合人类血脑屏障（BBB）。本研究发现ε毒素与人类髓鞘相关脂蛋白（hMAL）存在关联，这种相互作用会对神经脉管系统产生诸多后续影响，且已知髓鞘相关脂蛋白在人类血脑屏障中表达，这为揭示ε毒素在人体血液循环中可能发挥的作用提供了线索。

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苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。