题目：CUL1 variants cause severe neurodevelopmental disorders: Insights from human genetics and a zebrafish model of microcephaly

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/41189326/

期刊：HGG Advances

摘要

小头畸形是一种以头围减小、脑发育受损为特征的神经发育异常，常伴有智力障碍、发育迟缓及癫痫发作。尽管已有众多基因被证实与小头畸形相关，但SCF（Skp1-Cul1-F-box蛋白）泛素连接酶复合物，尤其是其核心组分CUL1，在其中的作用仍知之甚少。本研究在四个患有严重小头畸形、智力障碍及发育迟缓的无亲缘关系家庭中，鉴定出CUL1基因的杂合新发变异和遗传变异。为探究CUL1功能缺失的生物学效应，我们构建了敲低cul1a和cul1b的斑马鱼模型，该模型出现中枢神经系统体积显著减小和行为缺陷的表型，与患者的临床表型高度一致。这些研究结果证实CUL1是与严重神经发育障碍相关的新基因，并凸显其在脑发育过程中的关键作用。本研究明确了CUL1在神经发育障碍中的基因型-表型关联，拓展了与SCF复合物相关疾病的遗传谱，也进一步强调了其在神经发育中的重要性。

引言

小头畸形是一种神经发育异常，其特征为头围显著减小，反映出大脑生长和发育受损。该病症具有显著的临床异质性，患者通常表现出多种神经和发育异常。 小头畸形的定义是头围小于平均值（比同龄同性别人群的平均值低2个标准差以上），常伴有智力障碍（ID）、发育迟缓（DD）、运动障碍，部分患者还会出现癫痫发作。此外，小头畸形患者可能表现出不同的精神症状，且在适应功能方面存在障碍。罕见的遗传性和新发遗传变异是小头畸形病因的主要因素，它们会破坏神经元增殖、分化相关的关键通路，以及存活能力。 目前已鉴定出众多与小头畸形相关的基因，这凸显了该疾病背后的遗传复杂性。阐明小头畸形的遗传和分子机制，对于揭示其发病机制以及开发针对性治疗手段至关重要。

SCF（Skp1-连接蛋白Cul1-F盒蛋白）泛素连接酶复合物是一种高度保守的多蛋白复合物，在泛素-蛋白酶体系统中发挥核心作用，而泛素-蛋白酶体系统是调控蛋白质降解、细胞周期进程和信号转导的关键通路。6-9 SCF复合物由三个核心组分构成：Skp1、Cul1（连接蛋白Cullin-1）以及一种决定底物特异性的F盒蛋白。在神经系统中，SCF复合物对神经发育至关重要，因为它调控着参与神经元分化、突触可塑性和细胞存活的蛋白质的更新。SCF复合物的失调与多种神经系统疾病相关，尤其是那些影响神经发育。例如，编码F盒蛋白的基因变异（如(FBXO28 ^{12})和FBXW11）已被证实与智力障碍（ID）及其他神经发育异常相关。由CUL1基因编码的Cullin-1是SCF复合物中的支架蛋白，对其结构完整性和功能至关重要。尽管Cullin-1发挥核心作用，但目前尚无人类疾病被直接证实与CUL1基因变异相关，这使得我们对其在神经发育障碍（NDDs）中作用的理解存在显著空白。

本研究报道了在四名无亲缘关系且伴有神经发育异常（包括小头畸形和智力障碍）的患者中，发现CUL1基因存在杂合变异。这些变异中，两种为无义变异，预测会导致蛋白截短，第三种为错义变异，位于高度保守的Cullin同源结构域内。为进一步探究CUL1功能缺失（LOF）的影响，我们构建了cul1a和b基因敲低（KD）的斑马鱼模型。这些敲低斑马鱼的中枢神经系统（CNS）面积、自发活动能力以及明-暗反应均显著降低。这些表型与患者身上观察到的临床特征高度吻合，为CUL1在大脑发育中的功能作用提供了有力证据。本研究明确了CUL1在神经发育障碍（NDDs）中的基因型-表型关联，揭示了其在早期神经发育过程中的关键作用。该研究不仅加深了我们对神经系统疾病中SCF复合物的认识，还将CUL1鉴定为与严重神经发育表型相关的新基因。

结果

 1号家系中四名小头畸形合并智力障碍的无亲缘关系儿童CUL1基因杂合变异的鉴定

先证者（Ⅲ：2；图S1）为一名12岁女性，足月出生，孕期曾出现晚期胎儿脑积水。尽管如此，分娩过程仍顺利。出生时，她体重3.2千克，身长50厘米，头围32厘米（(<3^{rd })百分位）。目前，她身高135厘米（(10^{th })百分位）、体重30千克（(25^{th })百分位）、头围48厘米（1daa848e-0394-40b0-4d28-9ce5-9a27d2b84ce4百分位），提示存在严重小头畸形。该患者存在明显的发育迟缓；3岁时才开始说出“妈妈”“爸爸”等单字。其语言能力仍十分有限，仅能使用简单的单词和短语，无法有效表达自身需求。她已实现独立，该患儿2岁时开始独立行走，目前步态稳定。认知评估显示其存在重度智力障碍，估计发育年龄为2-3岁。她能遵循简单指令，但在较复杂的任务上存在困难。值得注意的是，她无癫痫或癫痫发作病史（表1）。其体格特征包括宽平鼻、小下颌、小睑裂和食欲亢进。 trio-WES检测在CUL1基因的17/22号外显子中发现了一个新的杂合无义变异（NM_003592.3:c.1819C>T, p.Gln607*；图1A、1B及图S1），该变异在公共数据库（ExAC、gnomAD3.1.2非神经组）中未见报道。此变异遗传自患儿母亲（II:2），其母亲存在明显语言障碍和小头畸形，也为受累个体。由于家属对患儿早期发育史了解有限，详细的既往表型分析受限，但她目前的表型包括运动功能正常，仅能在指导下完成简单家务。

图1. CUL1变异的遗传与结构分析(5-A) 半径范围内的氨基酸以棒状模型标注，氢键以黄色虚线表示。(D) 对不同物种中 Cullin-1 蛋白里 (450^{th }) 氨基酸残基的保守性分析。(A) CUL1 基因结构示意图及变异体分布。(B) 三种变异体在 Cullin-1 蛋白上的分布。(C) Cullin-1 蛋白的空间构象。放大图展示了 450 位野生型（右侧）和突变型（下方）氨基酸残基 (5-A) 半径范围内的氨基酸残基。(450^{th }) 氨基酸残基以小麦色棒状模型突出显示，范围内的氨基酸

家庭2

先证者（II:1；图S1）为一名女性，孕40周出生，孕期合并Ⅱ度胎粪污染羊水，出生时年龄为8岁9个月。出生时体重3.6千克，身长51厘米，头围35厘米（均在正常范围内）。但患儿在3月龄时出现小头畸形（头围38厘米，低于第1百分位），6月龄时头围仍为38.5厘米，小头畸形持续存在。目前，其头围为49厘米(<1st)百分位，身高120厘米(10^{th })百分位，体重20.1千克((4^{th })百分位。该患儿存在明显的发育迟缓。她在18月龄时能独立坐起，2岁7个月时可独立行走2米，但姿势异常。3岁时，其行走能力趋于稳定。语言发育严重受损，从未说出有意义的词语，但能发出“妈妈”“爸爸”等声音，这类声音最初在约10月龄时出现。目前，其认知能力评估相当于7月龄婴儿。她无法听从指令、不认识父母，也不会使用手势交流。脑部磁共振成像显示双侧侧脑室旁存在异常信号灶，T1呈等信号、T2呈高信号，FLAIR序列呈高信号，提示髓鞘发育延迟。患儿于出生后5天出现癫痫发作，最初表现为短暂的肢体蜷缩意识丧失发作，持续时间最长20秒，偶伴肌阵挛抽动。8月龄时，出现频繁的全身性强直-阵挛发作，持续30秒至1分钟，表现为口吐白沫、双眼上翻、意识丧失。在癫痫频繁发作期间，其语言和运动发育出现倒退。1岁时，通过丙戊酸、托吡酯等抗癫痫药物控制了癫痫发作。目前，患儿无癫痫发作（表1）。其他临床特征包括轻度散光，以及双腿交叉等刻板行为，她用手指揉着耳朵。Trio-WES 在 CUL1 基因的第 13 号外显子中检测到一个新发的杂合错义变异（NM_003592.3:c.1348A>T，p.Met450Leu；图 1A、图 1B 及图 S1）。 

该变异未在公共数据库（包括gnomAD、ExAC和1000 Genomes）中记录。计算机模拟工具预测其具有致病性（例如，综合注释依赖损耗得分为22.7）。(450^{th })氨基酸残基位于Cullin-1蛋白的Cullin同源结构域内（图1C），该区域是Cullin蛋白家族共有的区域。该位点在脊椎动物中高度保守（图1D）。已有研究报道，Cullin-3、Cullin-4a和Cullin-4b中同一位点的变异可导致神经发育障碍（图1D）。我们构建了携带Leu450变异的蛋白质三维结构模型，结果显示突变的氨基酸残基在(5- AA)范围内与周围残基形成额外的氢键（图1C）。这种结构改变可能会影响蛋白质的整体构象。

家庭3

该患者为一名8岁男性，由非近亲父母所生，父母无神经发育障碍家族史，孕期顺利，于孕41周分娩。其出生体重、身长及头围均在正常范围内，但在3月龄时出现全身性强直-阵挛性癫痫发作，遂住院治疗。当时确诊小头畸形（头围36.5厘米，处于第34百分位），被诊断为难治性癫痫及全面性发育迟缓。3岁半时的脑部磁共振成像显示存在囊性边缘增强鞍/鞍上病变置换视交叉，但其他正常的大脑半球。癫痫发作频繁，几乎每天在3个月至1岁之间，到6个月时演变为婴儿痉挛。虽然最初用高剂量泼尼松龙控制，但修饰性低心律失常在2岁时复发。从1-6岁开始，他经历了复发性癫痫发作集群，导致运动消退，需要强化物理治疗以恢复坐、站和行走等技能。癫痫发作类型包括强直性，强直性阵挛，强直性和婴儿痉挛。在过去的6个月里，他一直没有癫痫发作。8岁时，他表现出严重的ID（与4岁以下儿童相当的认知能力），用有限的语言和手势进行交流，并在护理和教育支持下就读于特殊学校。其他临床特征包括轻度胱氨酸尿，胃肠/喂养问题，从1岁开始需要胃造瘘管喂养，以及便秘。他目前的头围为1100px（(<1st)百分位数，−6.0 SD），身高117 cm((3rd)百分位数），体重20.4 kg((4^{th })百分位数）（表1）。先证者及其父母的WGS在CUL1的第8/22外显子中发现了一个de novo无意义变体（NM_003592.3：c.817C>T，p. Arg273*；图1A和1B），并通过Sanger测序得到证实。该变体在所有公共变体数据库中都不存在。没有发现其他致病性或可能致病性变体。

家庭4

患者为14岁男性，是健康夫妇的第一个孩子，足月剖宫产出生。分娩过程因缺氧而变得复杂。出生时，其体重为3.9千克，身长50厘米，头围处于正常范围。目前，其身高175厘米，体重67.5千克，头围52厘米（处于第(<3^{rd })百分位）。该患者存在重度智力障碍，但运动发育正常。其语言发育始于2岁，但表达性语言仍显著延迟，仅能使用简单词汇表达基本需求，对外部指令的理解能力较差。在压力或焦虑状态下，会出现推搡他人等攻击性行为。无癫痫发作相关病史，未观察到明显的面部畸形。其弟弟发育正常。通过 trio-WES 技术，我们在 CUL1 基因中检测到一个新发杂合变异体 ((c. 483+1 G>A))，该变异体被预测会严重干扰第4号外显子的经典剪接（图1A）。该变异体表现出高SpliceAI 供体缺失得分为 0.99（https://spliceailookup.broadinstitute.org），强烈表明该变异对剪接具有有害影响。值得注意的是，所检测的所有公共基因组数据库中均未收录该变异。

发育早期cul1a&b敲低斑马鱼的神经发育缺陷

为确定CUL1功能缺失是否会导致中枢神经系统发育异常，我们构建了cul1a和b双crispant斑马鱼模型，并检测了5天post-fertilization（dpf）幼虫的形态学特征，重点关注眼距、体长和中枢神经系统形态。定量分析显示，Cas9对照组((n=) 38)与cul1a&b crispant组((n=43))的眼距无显著差异（非配对t检验，(p=0.4341) 图2B）。然而，我们观察到与Cas9对照组相比，cul1a&b crispant 组的体长显著缩短（未配对t检验，(p<0.0001) 图2C），同时眼长与体长的比例相应增加。值得注意的是，cul1a&b crispant 斑马鱼 ((n=35)) 表现出明显的中枢神经系统发育异常。cul1a&b 双crispant 个体的中枢神经系统内前脑比例显著降低（((p=0.0202) 图2G），后脑比例增加（(p=0.0111) 图2H），这表明crispant 个体的神经发育存在区域特异性紊乱。这些研究结果表明，Cullin-1 在斑马鱼中枢神经系统的正常发育中发挥关键作用，影响大脑形态及特定脑区的发育。

图2. CRISPANT敲除斑马鱼cul1a和cul1b导致胚胎发育异常和神经发育缺陷。（A）受精后5天幼体斑马鱼的代表性明场图像（dpf；背侧视图）。顶部，cas9注射对照；底部，cul1a&b双脆。红线表示眼睛距离和身体长度。比例尺条，500μm。（B和C）cas9注射对照((n=38 fish ))与cul1a&b双脆条中眼睛距离（(p=0.4424)未配对t检验）和身体长度((p<0.0001))的测量((n=42 fish))数据被归一化为cas9对照组的平均值。（D）Tg（HuC：eGFP）幼体斑马鱼的代表性图像，显示5 dpf（背侧视图）的CNS形态。左侧，cas9注射对照；右侧，cul1a&b双脆条。白色虚线突出显示从上到下测量的CNS区域，代表前脑、中脑和后脑。比例尺条，200μm。（E-H）cas9注射对照组((n=38 fish ))与cul1a&b双脆饼组的归一化中枢神经系统区域（E）（(p=0.2706)不成对t检验）（(n=34 fish))数据通过个体幼虫的体长进行校正。中枢神经系统区域（F-H）的亚区域比例(p=0.0202)0.1047，前脑、中脑和后脑分别为0.0111）。（I和J）cas9注射对照组（cas9；(n=40 fish)）和cul1a&bdoublecris😍（cul1a&b；(n=26 fish)的自发游泳活动（I）和明暗反应（J）的运动图。

cul1a&b 基因敲除斑马鱼的行为缺陷

为探究cul1a&b的功能缺失（LOF）是否会影响斑马鱼的行为，我们评估了它们的运动活性和明暗反应行为。定量分析显示，cas9对照组与cul1a&b基因敲除crispr组之间存在显著的行为差异。在自发活性检测中，与cas9对照组相比，cul1a&b基因敲除crispr组的总移动距离显著减少（非配对t检验，(p<0.01)；图2I和2K）。同样，cul1a&b基因敲除斑马鱼的最大速度也明显低于cas9对照组（非配对t检验，(p<0.01)；图2K）。这些结果表明，cul1a&b基因敲除斑马鱼在自发运动过程中表现出运动活性低下的特征。

在明暗反应实验中，cul1a&b crispant 组的行为反应也相较于 cas9 对照组显著降低。cul1a&b crispant 斑马鱼的总移动距离和最大速度均显著更低（非配对 t 检验，两个指标的 p 值均为 (p<0.001)；图 2J 和图 2L）。这表明 cul1a&b crispant 斑马鱼对光照条件变化等环境刺激做出反应的能力受到了显著损害。

讨论

在本研究中，我们在四个患有小头畸形和智力障碍的无亲缘关系家族中发现了CUL1基因的杂合变异，从而扩大了与SCF泛素连接酶复合物相关的神经发育障碍的遗传谱。这些患者的临床表型，包括严重小头畸形、发育迟缓以及智力障碍，凸显了Cullin-1在大脑早期发育中的关键作用。敲低cul1a和b的斑马鱼模型表现出明显的中枢神经系统发育异常精神和行为缺陷，与我们患者身上观察到的临床特征相呼应，为CUL1变异体的致病性提供了有力证据。我们关于CUL1变异体导致人类疾病的报告，填补了我们对神经发育障碍遗传基础认知中的重要空白。

CUL1基因包含22个外显子（基于经典Refseq NM_003592.3），编码一个776个氨基酸的蛋白质，其C端含有一个cullin同源结构域。根据DECIPHER数据库（https://www.deciphergenomics.org/gene/CUL1/overview/clinicalinfo）的数据，CUL1基因的功能缺失型不耐受概率（pLI）得分为1，单倍剂量不足预测概率（pHaplo）得分为1。Cullin-1作为分子支架，介导SCF E3泛素连接酶的两个关键生化功能：其C端区域招募小RING蛋白RBX1，该蛋白促进与E2泛素结合酶的相互作用，而N端区域则结合SKP1和可变的F盒蛋白。 F盒蛋白根据其底物相互作用结构域被分为三大亚家族：含WD40重复序列的FBXW、含亮氨酸重复序列的FBXL以及含其他蛋白质相互作用结构域的FBXO。SCF E3泛素连接酶介导底物上多泛素链的形成，这通常是蛋白酶体介导降解的信号。但在某些情况下，该过程可导致蛋白质稳定， 亚细胞定位改变，或其他结合蛋白的募集。SCF E3泛素连接酶在关键的细胞增殖通路中发挥核心作用，包括细胞周期进程，中心体复制与动态变化， DNA复制与修复，以及信号转导。

研究人员利用斑马鱼模型进一步探究了CUL1功能丧失突变的功能性影响，结果发现了显著的形态学和行为学异常。在斑马鱼中，前脑扩张是早期神经发育的一个标志，其源于前神经祖细胞的持续增殖以及端脑和间脑协调的形态发生模式形成。 因此，前脑比例的降低反映了中枢神经系统内前神经发生受损以及区域化被破坏。后脑比例的增加很可能是前脑扩张受损的相对效应；不过，这也可能提示中枢神经系统的前后模式形成发生了改变。除这些形态学缺陷外，cul1a&b功能丧失突变还显著损害了斑马鱼的运动活性和行为反应。cul1a&b基因敲低斑马鱼表现出自发活性降低以及明暗反应减弱，这表明其存在运动功能减退和行为反应受损的情况。感觉运动整合。对cullin-1基因敲除小鼠的研究表明，该基因的缺失会导致胚胎早期致死，这凸显了其在早期发育中的关键作用。值得注意的是，(Cul1 ^{-1-})胚胎、囊胚以及小鼠胚胎成纤维细胞中均出现细胞周期蛋白E蛋白的积累，同时胚胎外胚层中p53水平升高且细胞凋亡增加。这些研究结果强调了cullin-1在调控细胞周期进程和胚胎早期发生中的核心作用。

尽管目前没有直接证据表明CUL1与人类疾病相关，但我们的研究结果提示CUL1变异与神经发育障碍之间存在潜在关联。CUL1的最大pLI和pHaplo评分均为1.0，这为其提供了强有力的遗传证据，表明CUL1对功能缺失变异具有极高的耐受性，且极有可能存在单倍剂量不足效应，这也支持单倍剂量不足是我们患者中发现的杂合变异的主要致病机制。这与其他与Cullin相关的神经发育障碍的致病机制一致，例如CUL3和CUL4B相关疾病。研究已在表现出多种神经发育障碍症状的个体中发现CUL3的功能缺失变异，这些症状包括智力障碍、行为异常、发育迟缓、语言发育迟缓，可伴或不伴癫痫。越来越多的证据表明，CUL3功能异常可能产生全身性影响，尤其会对血管、肌肉、骨骼和神经系统造成影响。然而，CUL3单倍剂量不足相关神经发育障碍的具体致病机制仍有待进一步阐明。同样，CUL4B变异被认为是X连锁智力障碍综合征最常见的病因之一，该综合征以重度智力障碍、癫痫发作、震颤、语言发育迟缓、易怒发作、身材矮小和中心性肥胖为特征。机制研究表明，CUL4B-环指E3泛素连接酶复合物可通过催化H2AK119的单泛素化，表观遗传抑制PPP2R2B和PPP2R2C的表达。Cullin-4B的缺失会通过上调PPP2R2B和PPP2R2C的表达来增强蛋白磷酸酶2A的活性，进而抑制神经前体细胞中的ERK和AKT信号通路。这种抑制会促进细胞周期退出并推动神经元分化，凸显了CUL4B在神经发育过程中的关键作用。尽管我们的遗传和斑马鱼研究数据有力支持了所发现的CUL1变异存在功能缺失机制，但我们也承认，目前缺乏对患者细胞中CUL1蛋白水平降低或亚细胞定位改变的直接实验验证，这是本研究的局限性。未来利用患者来源的细胞或合适的模型系统开展研究，对于明确这些变异对CUL1蛋白的影响至关重要。 

Cullin 家族成员之间的表型差异可能归因于其各自 E3 泛素连接酶复合物的底物特异性。我们推测 Cullin-1 可能优先调控神经前体细胞中与有丝分裂进程和细胞命运决定相关的神经发育通路，这可能解释了在我们的病例中观察到的主要小头畸形表型。 相比之下，Cullin-3 在 BTB-CUL3-RBX1 复合物中发挥作用，该复合物靶向参与更广泛细胞过程的不同底物；而 Cullin-4B 与 DDB1 衔接蛋白协同作用以招募特定的底物受体；这些差异可能是其临床表现更具多样性、累及多个器官系统的原因。 这些研究结果凸显了 Cullin 家族蛋白在神经发育障碍中的重要性，并表明单倍剂量不足是 Cullin 相关疾病中一种常见的分子机制。

不同的F框蛋白决定了泛素化的特异性底物以及SCF复合物的功能多样性。多种参与SCF E3连接酶组成的F框蛋白与神经发育障碍（NDDs）相关。例如，FBXW7的杂合变异与神经发育障碍、脑部异常、肌张力低下以及胃肠道并发症相关。FBXW11的新发错义变异（尤其是在WD40结构域重复序列内）与轻度至重度神经发育障碍有关，常伴随行为异常以及下颌、眼部和肢体异常。同样，FBXO11的新发变异会导致轻度至重度智力障碍（ID）、面部畸形特征和行为异常。在患有重度至极重度智力障碍、获得性小头畸形以及多种癫痫类型癫痫的个体中，已发现FBXO28的变异。有趣的是，Cullin-1可直接与FBXO28相互作用并将其靶向降解。FBXO31/SKP1/Cullin1复合物对神经元形态发生和轴突特性至关重要。在呈现轻度至中度智力障碍的巴基斯坦和伊朗近亲婚配家庭中，已发现FBXO31的纯合移码变异。这些发现强烈表明，CUL1基因变异也可能通过破坏F框蛋白功能和SCF E3连接酶活性，导致智力障碍及其他神经发育障碍。 

综上所述，本研究鉴定出CUL1是与严重神经发育障碍相关的新基因，并阐明了CUL1在神经发育障碍中基因型与表型的详细关联。这些发现加深了我们对神经发育障碍遗传和分子基础的理解，同时凸显了SCF复合物在大脑发育中的重要作用。未来还需进一步研究，以探索Cullin-1功能异常在神经系统疾病中更广泛的影响，并为患病患者开发针对性的治疗干预手段。

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