题目：Sensorimotor Transformations in the Zebrafish Auditory System

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31708392/

期刊：Current Biology

研究亮点

l 斑马鱼大脑中声音频率的表征具有低维特性

l 低频信号在后脑区被处理并引发尾部运动

l 高频信号在延脑和中脑中有表征

l 听觉刺激会被时间整合以产生尾部运动

摘要

生物利用其感觉系统从环境中获取信息，并整合这些信息以产生相应的行为。然而，感觉信息如何在大脑中转化为合适的运动模式仍是一个尚未解决的问题。本研究通过对活体、行为状态下的斑马鱼幼鱼进行双光子和光片钙成像，解决了这一问题。我们在监测听觉刺激引发的神经活动的同时，记录其尾部运动。研究发现，神经活动根据四种不同的反应特征（频率调谐曲线）呈现出空间组织规律，这表明频率信息以低维形式表征，并贯穿于斑马鱼幼鱼的整个发育过程。低频（150-450赫兹）在后脑进行局部处理并引发运动行为；相比之下，高频（900-1000赫兹）很少诱导运动行为，且在中脑也有表征。最后，我们发现斑马鱼听觉系统中的感觉运动转换是一个连续且渐进的过程，该过程需要对感觉反应进行时间整合，进而产生运动行为。

引言

神经科学的主要目标之一是理解感觉信息如何在大脑中表征，以及后续如何整合以产生相关行为。

对于多种感觉模态，关于外部世界的信息会以拓扑图的形式呈现。例如，两个在空间上距离较近的视觉刺激会在相邻的神经元上引发反应（视网膜拓扑定位）。在哺乳动物、鸟类以及在蜥蜴中，由于基底膜的特性，耳蜗内会发生声频分辨（综述见）。这种频谱在耳蜗上的空间分布被称为音调拓扑结构，它通过平行通路并沿着听觉层级传递至中枢神经系统（CNS），直至初级听觉区域[2-5]。硬骨鱼没有耳蜗，但其内耳由耳石和一系列毛细胞组成，这些毛细胞同时参与听觉和前庭系统的工作，能够检测声音的加速度分量。在幼鱼和成鱼中，韦伯氏小骨的出现使得鱼鳔检测到的声压能够传递到内耳。在部分物种中，这种结构会降低检测阈值并提高对高频的敏感度。不过，硬骨鱼能够利用听觉信息来捕食、躲避捕食者，或窃听同种或异种动物。因此，硬骨鱼应当能够在感觉毛细胞或神经系统层面完成基本的频域分辨。事实上，在金鱼身上已观察到频率分离现象，其球囊前端的传入神经对高频有反应，而尾部传入神经则对低频更敏感，这一现象可能源于毛细胞的机械特性。

在硬骨鱼中，八分柱接收内耳初级传入纤维的输入，并依次投射到半环隆起。这两个区域被认为与哺乳动物的耳蜗核和下丘具有同源性。在金鱼中，有研究报道半环隆起存在粗略的音调拓扑结构。在斑马鱼幼体中，有学者假设其存在粗略的空间频率分布，但这一点仍有待证实。

感觉表征用于解码和解读外部感觉世界，并生成运动模式以应对不断变化的环境。为此，大脑需要进行感觉运动转换计算，将感觉反应转化为相关的运动行为。

研究人员已在果蝇和秀丽隐杆线虫的趋化性与嗅觉研究中、在主动感知与探索研究中，以及小鼠的感觉运动学习研究中，对感觉运动转换展开了探究。然而，这些研究涉及细胞水平的转化，或通过监测数量相对较少的神经元来实现。利用斑马鱼幼鱼——这种生物能同时监测感觉和运动回路以及运动行为，研究人员便可在回路水平研究感觉运动转化。例如，视觉运动转化被认为发生在前后脑的一个脑区，该区域会汇聚多种视觉反应。

尽管取得了这些进展，但感觉运动转换背后的神经元回路原理和机制仍不明确。

本研究借助斑马鱼的听觉系统，探究大脑中的声音表征及其转化为运动模式的原理。为此，我们在表达基因编码钙指示剂GCaMP5的活体、行为状态下的斑马鱼幼体中，运用光片和双光子钙成像技术，以接近单细胞的分辨率监测纯音（150–1000赫兹）和宽带噪声在大脑大部分区域引发的神经活动，同时记录其运动活动。

我们发现，听觉诱发的神经元反应根据四种主要不同的反应模式在空间上进行组织。低频（150–450赫兹）在后脑进行局部处理，而高频（900–1000赫兹）则被传递至中脑，这表明存在两条处理听觉信息的通路。我们提出，局部低频通路主要用于生成恰当的运动行为，而第二条通路（涵盖低和高声音频率）可能参与其他感觉模态的调节。

为研究声音如何被处理并转化为运动模式，我们根据神经元反应与听觉刺激以及幼鱼尾部运动的相关性对其进行了分类。我们发现，听觉诱发的神经活动通过中间的感觉运动回路在大脑中从感觉区域传递至运动区域，该回路不仅在刺激呈现时处于激活状态，在运动行为发生过程中也同样活跃。无论行为输出如何，感觉网络都能精准地编码听觉信息，而运动网络则未表现出与感觉相关的活动。然而，当刺激之后伴随运动行为时，感觉运动回路的活性要高于仅对刺激产生反应的情况。最后，我们观察到，当听觉刺激之后出现运动行为时，整个网络中神经元反应的持续时间更长，这表明在斑马鱼幼鱼的听觉系统中，感觉运动转换涉及神经元感觉反应的时间整合过程。

结果

大脑中的听觉反应

为研究听觉系统中听觉刺激如何被表征、整合并转化为运动模式为了研究斑马鱼幼鱼，我们制作了一个配备防水扬声器（Visaton K28 WP）的3D打印记录腔室，该腔室可用于传递听觉刺激、监测运动行为（尾部运动），并通过双光子显微镜记录神经元活动（图1A）。受精后8天（dpf），在全神经元中表达GCaMP5的转基因斑马鱼幼鱼（Huc:GCaMP5）被固定在低熔点琼脂糖中，放置于记录腔室的中心位置。我们通过腔室上方的双光子显微镜监测钙动态。移除尾部周围的琼脂糖后，可利用高速相机监测尾部的偏转（图1A）。在上述条件下，我们向幼鱼呈现频率范围为150赫兹至1000赫兹的纯音（详见STAR方法）。该频率范围的选择基于既往研究。由于记录腔室的声学特性以及扬声器的非线性特性，实际呈现的听觉刺激可能与计算机生成的原始刺激存在偏差。因此，我们针对每个频率刺激测量了腔室内的声压和粒子加速度，随后对压力和加速度进行均衡处理，使实验所用频率范围内的这两个数值基本一致（图S1B和图S3B）。此外，为最大程度减少谐波的产生，我们采用了具有上升起始和衰减终止的听觉脉冲刺激（图S1A）。

研究人员记录了后脑内包含八瓣核的不同光学平面的神经元活动，这是硬骨鱼类听觉信息首个已知的中继核；同时还记录了网状脊髓回路、小脑、内侧纵束核以及中脑区域的半规管 torus——该结构与哺乳动物的下丘同源（图1B、图6D和图6E）。

为提取对听觉刺激有反应的感兴趣区域（ROIs），我们采用了一种基于刺激相关回归量的回归方法（见STAR方法），每种呈现的频率对应一个回归量。随后，我们利用这一系列回归量，将线性模型拟合到每个感兴趣区域的荧光时间序列中（图S2）。通过计算时间序列中被解释的方差百分比来评估拟合优度由模型（((R^{2} stim ))）生成。仅保留具有高 (R^{2}) 的感兴趣区域（ROI）进一步分析（STAR 方法）。通过该方法，我们在八瓣核、颗粒隆起、半环 torus 以及外侧纵束外侧的小核中发现了听觉响应的感兴趣区域（共来自 13 条幼体的 1917 个感兴趣区域；STAR 方法；图 1C）。

听觉信号通过其强度、频率成分以及随时间的变化来传递信息。本研究聚焦于声音的频率成分，该成分可能承载着关于声源本质的关键信息，并能触发相关的运动行为。例如，大口黑鲈（Micropterus salmoides）在捕食孔雀鱼时会发出200赫兹、170分贝的声音，而鲤科鱼类会根据岩石摩擦发出的声音被其吸引，因为它们可能学会了将这种声音与之前隐藏在岩石下的新食物来源联系起来 。

图1.声学刺激和同时记录神经活动和行为的实验设置。（a）斑马鱼幼体头部受到3D打印记录室内一滴低熔点琼脂糖的限制。使用防水扬声器传递声音刺激（不同频率的纯音）。自发和诱发的神经元活动通过双光子钙成像监测，同时用高速相机同时记录尾巴的运动。（b）幼体大脑泛神经元表达GCaMP5（Huc：GCaMP5）的两个光学切片。Cb，小脑；EG，肉芽肿；Hb，后脑；IpN，脚间核；ON，八腔核；OT，视顶盖；RS，网状脊髓神经元；Th，丘脑；Tel，端脑；TS，半环。绿色箭头头，外侧纵束；紫色星号，内侧纵束核。比例尺，100 微米。虚线矩形对应于图（C）中显示的区域。（C）八分体核（上图）和半规管隆起（下图）中两种感觉活动的示例。上图：展示了一只幼体在每种刺激频率下经多次试验平均后的光栅示例。下图：展示了经感兴趣区域（ROIs）平均后的活动情况。右侧：展示了通过线性回归筛选出的响应性感兴趣区域（ROIs）的拓扑结构，对应左侧的光栅图。比例尺，100 微米。另见图 S1 和图 S2。 

大脑中的频率表征

为研究不同频率的听觉刺激如何在幼虫大脑中被表征，我们首先计算了幼虫的听图（见STAR方法）。听图显示出两个主要频段：150至450赫兹的低频段和950至1000赫兹的高频段。低频段的平均振幅阈值为138±3.05分贝（图2A）。随后，我们计算了幼虫听觉回路中每个有响应的感兴趣区域（ROI）的频率调谐曲线。为研究调谐曲线，我们使用振幅为155分贝的听觉刺激（该振幅高于可检测阈值，能够触发运动行为并引发神经元回路的强响应但未达到饱和；图2A）。通过K-means聚类分析，我们发现所有感兴趣区域的频率调谐曲线可分为四个主要簇，这四个簇能最佳地体现所获调谐曲线的多样性（图2B、2C；见STAR方法）。在这些簇中，两个簇包含150至450赫兹的频段，另外两个簇则额外包含950和1000赫兹的高频段。两种聚类验证方法（轮廓系数和Calinski-Harabasz指数；图S5A）以及两种独立的替代聚类方法（主成分分析和层次聚类；图S5B、S5C）均支持将聚类数设为4。侧线消融后，刺激诱导的神经元响应仍以听觉响应为主，且与正常条件下观察到的响应（尤其是低频段）较为相似（图S4）。

为研究这四个集群在不同脑区的空间分布，我们对每一条记录的幼鱼（受精后8天；(n=13)）的脑部解剖结构进行了配准，通过仿射变换将其映射至共同的参考空间（STAR 方法）。随后，我们为每个集群计算了归一化的三维密度图，并沿背腹轴和中外侧轴投影出最大密度（图2D；STAR 方法）。我们观察到，不同集群沿吻尾轴分布（图2E中虚线），覆盖了八叠核和半环 torus。各集群沿该轴的密度直方图分析（STAR 方法）显示，仅包含低频波段（150赫兹和450赫兹）的集群在该轴的尾部区域（八叠核）占比更高，而包含高频波段（950赫兹和1000赫兹）的集群则在该轴的吻部区域（半环 torus）占比更高（图2E）。

这一发现表明，8天龄的斑马鱼幼体可能通过两种不同的通路处理两个相关频段。低频信号在延脑进行局部处理，而低频和高频信号则被传递至中脑。

图2. 空间上不同的集群代表低频和高频信息。（A）上图：平均听阈图（8日龄的5条幼鱼），以线性回归模型拟合的神经反应振幅为测量指标，对大脑内所有感兴趣区域取平均值。白色曲线：显示平均阈值和均值标准误。下图：展示单条幼鱼的示例。（B）8日龄的13条幼鱼的频率调谐曲线，基于标准化的ΔF/F值，采用欧氏距离的K-均值聚类算法将其分为4个簇。不同幼鱼在不同光学切片下成像。簇1至4分别以红色、绿色、青色和品红色表示。(C) 基于(B)中各聚类的欧氏距离构建的相似性矩阵(D) 图(B)中展示的4个聚类的空间分布。使用仿射变换将全部13只幼虫对齐至参考堆叠图像。上方为沿Z轴的最大密度投影图，下方为沿y轴的最大密度投影图。比例尺为100微米。(E) 图(D)中沿灰色虚线AB轴各簇的感兴趣区空间密度，取双侧半球平均值。另见图S4和图S5。

听觉反应的发育

为了探究反应谱中的低维性是否是神经系统尚未成熟的结果，并研究其是否会随幼虫发育而发生变化，我们在不同发育阶段（受精后7至21天）重复进行了这些分析。我们首先观察到，听阈图未出现显著变化（图3A和图S3A），且不同发育阶段的检测阈值也无显著差异（受精后7天平均值：141.8±3.11；受精后8天平均值：137.5±3.0；受精后9天平均值：144.9±2.7；受精后14天平均值：136.6±4.1；受精后21天平均值：142.5±4.7；(p=0.44)；方差分析；图3A、图S3A和图S3B）。此外，不同发育阶段的4种调谐曲线也极为相似（图4；平均相关系数：0.85±0.14；图4C）。唯一的例外是受精后9天的两个神经元簇，其调谐曲线显示在650赫兹处出现了一个新的中频频段（图4A和图4B）。该中频频段在受精后14天时仍可观察到，但在受精后21天时完全消失。

图3. 不同发育阶段的听力图。(A)右侧：7 天龄后（4 条幼体）、9 天龄后（7 条幼体）、14 天龄后（3 条幼体）和 21 天龄后（5 条幼体）的平均听力图，以通过线性回归模型拟合的神经元反应振幅测量，为全脑所有感兴趣区域的平均值。白色曲线：平均阈值和均值标准误如图所示。左侧：展示单条幼体的示例。(B) 检测阈值，即检测到神经元反应的最低振幅，为不同发育阶段幼体的平均值（均值 ± 均值标准误）。不同日龄的均值无显著差异 ((p=0.4381)；单因素方差分析）。另见图 S3。

图 4 不同发育阶段的频率调谐曲线。(A) 采用 kmeans 聚类算法，将受精后 7 天（6 只幼鱼）、9 天（11 只幼鱼）、14 天（3 只幼鱼）、21 天（5 只幼鱼）的频率调谐曲线划分为 4 个聚类。(B) 幼鱼 721 dpf 整个发育阶段内，划分成 4 个聚类的各个感兴趣区域（ROI）的平均归一化调谐曲线。通过最大化各发育阶段调谐曲线与全年龄段平均调谐曲线之间的相关系数，将特征相似的调谐曲线归到同一聚类。比例尺：0.5 ΔF/F。颜色对应 (A) 中的各个聚类；图右上角显示每个聚类包含的感兴趣区域（ROI）数量。

(C) 用于对 (B) 中聚类进行排序的相关矩阵。将每个发育阶段下各个聚类的调谐曲线，与全年龄段平均调谐曲线做相关性计算；测试聚类分配的全部可能排列组合。该矩阵展示能够使平均相关系数达到最大值的分组方案。平均相关系数：0.85 ± 0.14（标准差 SD）。

听觉诱发的运动行为

为了进一步理解这两种听觉处理通路的生物学相关性，我们向斑马鱼幼鱼呈现了不同频率的听觉刺激，同时使用高速相机监测其运动行为（尾部偏转）（详见 STAR 方法）。

以往研究表明，强烈的声学或振动刺激可诱发两种不同类型的惊跳反应：短潜伏期C型起始反应（SLC）（5毫秒）和长潜伏期C型起始反应（LLC）（28毫秒）。短潜伏期C型起始反应由强烈的听觉刺激触发，且依赖于毛特纳细胞。相比之下，长潜伏期C型起始反应由较弱的听觉刺激诱发，且依赖于耳石。

为研究听觉刺激引发的尾部运动类型，我们计算了从刺激到诱发的运动行为开始的潜伏期。为此，我们使用了两种宽带噪声听觉刺激：高振幅（170分贝）和低振幅（155分贝；本研究采用该振幅）。我们观察到，高振幅刺激引发运动的概率为0.92，且潜伏期呈现双峰分布。短潜伏期群体的平均潜伏期为11.82±2.51毫秒，极有可能对应短潜伏期反应（SLCs）。长潜伏期群体的平均潜伏期为60.62±13.33毫秒，与长潜伏期反应（LLCs）相似。相比之下，低振幅刺激（155分贝）诱发尾部运动行为的概率为0.4，潜伏期分布更分散，平均为150.75±65.73毫秒。后者的潜伏期显著长于长潜伏期反应（LLCs）的潜伏期（秩和检验；图5A）。我们将这种行为命名为长潜伏期尾部运动（LLTMs），因为它们类似于对称或不对称的快速后退运动，而非C型启动样尾部运动（图5A）。这些结果表明，整个实验中使用的听觉刺激振幅所诱发的尾部运动行为，是由神经元回路整合过程介导的，而非快速反射反应。

为了推断听觉刺激与长时程记忆（LLTMs）之间相关性的显著性，我们将数据集与一组打乱的运动事件进行了对比。在这个零模型中，事件间尾部发作的分布得以保留，但尾部发作的起始时间被随机化（STAR 方法）。使用该零模型，我们定义了一个阈值，该阈值对应于其 (95th) 分位数我们通过该分布来判断听觉刺激是否能显著诱发运动行为。我们观察到，频率在150赫兹至450赫兹之间的听觉刺激能够显著诱发尾部运动（经邦费罗尼校正后，150-400赫兹对应((p <)、(10^{-4})；450赫兹对应(p=0.014)）。150赫兹和300赫兹的听觉刺激诱发运动行为的概率超过0.25。950赫兹和1000赫兹的听觉刺激也能显著诱发运动行为（经邦费罗尼校正后，950赫兹对应(p=0.014)；1000赫兹对应(p=0.041)），但概率低得多，仅为0.1。此外，听觉刺激诱发的尾部运动幅度呈现双峰分布，这可能反映了两种不同类型的运动。当我们对比低频段和高频段刺激诱发的尾部运动幅度分布时，发现两者无显著差异（秩和检验；((p=0.73)；图5C）。

图5. 听觉诱导的尾部运动行为。(A) 听觉刺激开始与尾部运动开始之间的延迟直方图（7条幼虫）：上图：使用170分贝参考1微帕声压级的刺激进行听觉刺激，得到的分布呈双峰状，可能代表短潜伏期C型启动反应和长潜伏期C型启动反应。下图：使用155分贝参考1毫帕声压级的刺激进行听觉刺激，得到的延迟分布更长且变异性更大。(B) 刺激开始后500毫秒时间窗内，各频率下至少出现一次尾部摆动的概率。通过生成与实验数据具有相同摆动间隔分布的数据构建了零模型（左图）。使用零模型分布计算p值，随后通过邦费罗尼校正进行调整。红色虚线为邦费罗尼校正后(alpha=0.05)的显著性阈值。(n=10 larvae) (C) 低频刺激（150赫兹和450赫兹；134次摆动）引发的摆动振幅平均密度分布（均值±标准误均值，10条幼虫）（黑色），以及高频刺激（950赫兹和1000赫兹；30次摆动）引发的摆动振幅平均密度分布（红色）。尾部摆动的振幅定义为摆动过程中的最大曲率。两种分布的中位数无显著差异((p=0.73)；双侧秩和检验）。(D) 上图：单条幼虫的单次试验光栅图。感兴趣区域（ROIs）按其感觉运动比率排序，计算公式为(((R_{m v t}^{2}-R_{stim }^{2}) /(R_{m w t}^{2}+R_{stim }^{2})))。感觉运动比率的范围为-1（感觉型感兴趣区域，蓝色）至+1（行为相关型感兴趣区域，红色）。下图：显示尾部偏转，绿色竖线为听觉刺激开始时刻。

感觉运动转换

为了表征介导听觉感觉运动转换的神经元过程，我们根据感觉运动比率描述了每个感兴趣区域（ROI）。为此，我们首先计算了（1）每个感兴趣区域的(Ca^{2+})瞬变与听觉刺激呈现的相关程度，我们将其定义为线性模型解释的刺激反应方差百分比（(R^{2} stim;) 图S2A；STAR 方法），以及（2）每个感兴趣区域的(Ca^{2+})瞬变与尾部运动产生的相关程度。对于后者，我们也采用了基于回归的方法。由于与行为相关的感兴趣区域可能在运动开始之前或之后处于活跃状态，我们使用了一系列回归变量（每个时间帧对应一个），这些变量围绕每次尾部运动的开始时间覆盖3.5秒的范围。拟合优度（((R^{2}_{m v t}))）是针对整系列回归变量计算得出的回归变量（图S2D；STAR 方法）。

随后我们将感觉运动比率（SMR）定义为刺激所解释的方差百分比与行为回归量之间的差值，再除以总的方差占比。解释的方差：(SMR=(R_{mvt }^{2}-R_{stim }^{2}) /(R_{mvt }^{2}+R_{stim }^{2}))该比率的范围从1（纯感觉相关）到+1（纯行为相关；图S6。

采用该方法，我们鉴定出：（1）变异主要由感觉输入解释的感兴趣区（ROIs）；（2）变异主要由运动行为的发生解释的一组感兴趣区（ROIs）；以及（3）变异同时由刺激和行为解释的一组感兴趣区（ROIs）（来自10条幼体的2915个感兴趣区；图5D和图6A左；STAR方法）。后者可能代表参与感觉运动转换的候选感兴趣区（图6A和图6B；视频S1）。该方法显示，具有较大正感觉运动比率的感兴趣区（运动感兴趣区）在自发产生的行为过程中也具有活性（图5D）。这表明相同的在自我产生和听觉诱发的运动行为过程中，活跃的是运动回路而非听觉专用回路（图5D）。这一点在全群体水平(( n=27 larvae))上得到了进一步证实，我们发现对于具有大感觉运动正比值的感兴趣区域（运动感兴趣区域），其在自我产生的尾部运动和听觉诱导的尾部运动过程中的活动水平相似（图S7A–S7C）。

为了根据感觉运动比率可视化感兴趣区域（ROIs）的拓扑结构，我们将每个感兴趣区域的位置与参考大脑对齐（图6A，右面板；STAR方法），随后将参考大脑与(###)脑图谱对齐。后者实现了对解剖区域的识别（图6D和6E）以及神经元类型的区分（谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能；视频S2）。平均感觉运动图谱显示，听觉感觉区域分布在：（1）前庭神经核（ON），该区域包含解剖学上分离的谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能神经元；（2）小脑的部分区域，该区域有两组分离的谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元；（3）半规管隆起（主要为γ-氨基丁酸能）。运动相关的感兴趣区域主要见于：（4）网状脊髓回路（存在重叠的谷氨酸能、γ-氨基丁酸能和甘氨酸能神经元群）；（5）小脑（解剖学上分离的谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元）；（6）内侧纵束核（nucMLF）的嘴侧部分，该区域主要为谷氨酸能神经元。感觉运动区域位于感觉区域与运动区域相交的边界处。此外，在内侧纵束核的尾侧也观察到了感觉运动回路（图6A、6D和6E；视频S2）。

为了探究感觉运动转换背后的机制，我们根据10条幼虫的感兴趣区域（ROIs）的感觉运动比值，将其分组。我们汇总了能稳定诱发行为反应的刺激频率（150–450赫兹）下的结果。我们利用听觉刺激所产生的行为结果的差异性，分别对两类试次中每个感觉运动组的感兴趣区域活动进行平均：一类是听觉刺激未诱发行为反应的试次（黑色曲线，图6B和6C第一行），另一类是听觉刺激诱发尾部摆动的试次（橙色曲线，图6B和6C第一、二行）。我们还对自发运动开始前后的神经活动进行了平均（紫色曲线，图6B和6C第二行）。试次平均的时间锁定分为两种：一种锁定至刺激开始时刻（图6B和6C第一行），另一种锁定至尾部运动开始时刻（图6B和6C第二行）。我们观察到，感觉运动比值较低的感兴趣区域（感觉型感兴趣区域）能独立于行为结果忠实地表征感觉信息（图6B和6C左上部分）。相反，感觉运动比值较高的感兴趣区域（运动型感兴趣区域）则表征与运动相关的信息，且活动水平相近。与感觉刺激无关（图6B和6C，右下角）。相比之下，感觉运动比率接近零的感兴趣区域（感觉运动感兴趣区域）在刺激引发运动行为与刺激未引发运动行为时，其活动水平存在显著差异（图6B和6C）。

图6. 听觉神经回路的感觉运动特性。（A）左图：运动与行为相关的感兴趣区（ROI）(R^{2})数值分布及对应的感觉运动比率值。右图：展示了10条斑马鱼在受精后8天（8 dpf）的感兴趣区感觉运动比率拓扑图。比例尺为100毫米。（B）上图：听觉刺激开始前后((t=0 ~s))时刻，按感觉运动比率分为5组的感兴趣区（ROIs）的平均AF/F变化。150至450赫兹的刺激频率被合并分析。橙色曲线表示刺激后500毫秒时间窗内出现尾部运动的情况刺激开始。黑色曲线表示刺激后无尾部运动。下图展示了鱼类运动时各感兴趣区域的平均荧光强度变化率（(t=0 ~s :)为运动开始）。橙色曲线表示听觉刺激诱发的尾部运动。紫色曲线表示自主运动。在下图中，橙色曲线（刺激诱发的运动）与紫色曲线（自主运动）之间的延迟对应感觉处理过程，因为刺激发生在运动之前。(C) 听觉刺激开始（上图）或尾部运动开始（下图）时，感兴趣区（ROIs）的平均峰值 DF/F 值（平均值 ± 均值标准误）。根据感兴趣区的感觉运动比值将其分为10组。采用双尾威尔科克森秩和检验对各组进行比较，随后使用邦弗伦尼校正对p值进行调整。（D）感觉运动比率的拓扑结构（蓝色为感觉区；白色为感觉运动区；红色为运动区），叠加在斑马鱼大脑图谱的Elavl3-GCaMP5品系上。黄色为面部运动及外侧线传出神经；on为前庭核；rs为网状脊髓回路。右上角显示了成像平面的深度。（E）z脑图谱中Elavl3-GCaMP5品系的感觉运动比拓扑结构。绿色为半环形核；黄色为内侧纵束核；橙色为小脑富含vglut2的区域。右上角：显示成像平面的深度。另见图S6及视频S1、S2。

为进一步研究听觉感觉运动转换的时间动态，我们采用高采集速率（20赫兹）的光片显微镜技术。我们记录了27条斑马鱼幼体对宽带听觉刺激（250–1000赫兹）的神经活动和运动行为（图7A；视频S2；STAR方法）。通过该方法，我们计算出钙瞬相对于听觉刺激开始的起始时间（STAR方法；图7A）。我们观察到未能触发运动行为的听觉刺激所引发的神经元反应仅限于感觉感兴趣区域（图7B）。相比之下，成功触发运动行为的感觉刺激会在具有全范围感觉运动比率的各感兴趣区域间诱导神经元反应（图7B）。该分析以及不同感兴趣区域起始时间的空间分布情况（图7D）表明，信息通过感觉运动感兴趣区域从感觉区域流向运动相关区域。感兴趣区域的平均起始时间与感觉运动比率之间的正相关关系也为这一结论提供了支持（图7C）。

为探究斑马鱼听觉系统中感觉运动转换的介导机制，我们计算了（1）激活的感兴趣区域（活动高于（刺激前500毫秒，平均活动值±2个标准差的阈值）、(2) (AF/F) /F，以及(3) 当刺激诱发运动行为或未诱发运动行为时，不同感觉运动比率的感兴趣区域（ROIs）的听觉诱发的(Ca^{2+})瞬态持续时间（图7E）。我们观察到，当刺激诱发运动行为时，被募集的低感觉运动比率感兴趣区域（感觉性感兴趣区域）的数量，与刺激未诱发运动行为的试验中被募集的感兴趣区域数量无显著差异（图7E，上图；(p=0.1936)，0.0323、0.0059、0.0024和0.0003；经Bonferroni校正后的单尾配对Wilcoxon符号秩检验）。同理，当刺激成功诱发运动行为时，感觉性感兴趣区域中诱发的(Ca^{2+})瞬态的ΔF/F，与刺激未诱发运动行为的试验中的ΔF/F也无显著差异（图7E，中图）。然而，对于感觉运动感兴趣区域，当刺激诱发尾部运动时，诱发的(Ca^{2+})事件的幅度显著高于刺激未诱发尾部运动时的幅度（图7E，中图；(p=1)，0.0096、0.0011、0.0015和0.0391；经Bonferroni校正后的单尾配对Wilcoxon符号秩检验）。相比之下，当听觉刺激后出现尾部运动时，感觉性和感觉运动感兴趣区域中诱发的(Ca^{2+})瞬态的持续时间显著更长（图7E，下图；(p=0.0162)，0.0131、0.0052、0.0037和0.7812；经Bonferroni校正后的单尾配对Wilcoxon符号秩检验）。这些结果表明，听觉诱发反应的持续时间是感觉运动转换的决定性因素。此外，我们观察到听觉刺激开始前的持续自发活动无法预测感觉反应的结果（图S7D）。因此，我们认为听觉反应持续时间的延长并非源于与网络当前状态的整合，而是代表了感觉反应的整合，以激活感觉运动和运动回路。

图7. 网络活动增强与钙瞬变持续时间介导感觉运动转换。(A) 单条幼虫在不同试验下的平均光栅图，这些试验中听觉刺激诱发（刺激后运动）或未诱发尾部运动（刺激后无运动）。感兴趣区域按钙瞬变的起始时间排序。红色虚线为瞬变起始时间。仅对刺激后活性高于刺激前平均活性2个标准差（活性基线）的感兴趣区域估算瞬变起始时间。(B) 荧光变化率（ΔF/F）随感觉运动比值变化的示例；色阶代表钙瞬变的起始时间。(C) 27条幼虫的钙瞬变起始时间（平均值±标准误均值）随感觉运动比值的变化情况。根据感兴趣区域的感觉运动比值将其分为5组。(E) 上图：各感觉运动比值组中高于3个标准差阈值的感兴趣区域数量（平均值±标准误均值）。中图：各组的峰值荧光变化率（ΔF/F）（平均值±标准误均值）。下图：各组钙瞬变的半高全宽计算的瞬变持续时间（平均值±标准误均值）。红线：听觉刺激后500毫秒时间窗内出现尾部运动的情况。黑线：听觉刺激后未出现尾部运动的情况。结果汇总自27条幼虫。采用单尾威尔科克森配对符号秩检验对各组进行比较，随后通过邦费罗尼校正调整p值。另见图S7。(D) 与(A)和(B)为同一条幼虫的钙瞬变起始时间分布图。比例尺，100微米。

讨论

感觉信息的神经表征已得到详尽研究。然而，这类信息如何被整合并转化为运动模式，目前仍不明确。在本研究中，我们同时记录了感觉和运动回路的听觉诱发神经反应，同时监测尾部运动活动。我们发现，在八瓣核、半环隆起、颗粒隆起和外侧纵束核中，存在对150至1000赫兹频率的听觉诱发反应。

如中所观察到的，斑马鱼幼体的听力学图显示出对两个主要频段（150–450赫兹和950–1000赫兹）的敏感度。与其他表明鱼类存在音调拓扑结构的研究不同，本研究仅在大脑中发现了四种不同的频率响应特征。这四种不同类型的调谐曲线涉及低频和高频频段。这两个频段可能直接由两种不同的球状毛细胞群体的机械特性产生（球状囊前端传入神经对高频有响应，而尾部传入神经则对低频调谐），这或许是由毛细胞的机械特性导致的。斑马鱼幼虫对声音频率的这种低维度听觉表征，与耳蜗动物的高维度处理方式不同——在耳蜗动物中，多个听觉脑区的大量神经元拥有尖锐和较宽的调谐曲线，可响应大范围频率，同时还有许多神经元具有更复杂的响应特征：特定振幅的声音起始与终止、振幅调制、频率调制或谐调性，对于这些特征，需要更复杂的方法来描述其响应（例如频谱时间感受野）。

其中两种特征谱对低频波段敏感，这些低频波段在后脑内进行局部处理。另外两种为双模态特征谱，既包含低频波段，还额外带有一个高频波段。这两种特征谱在幼体的后脑和中脑均有分布。这一发现表明，幼体可能通过两条具有不同生物学或功能相关性的通道，以不同方式处理低频和高频信号。低频信号在后脑进行局部处理以产生运动行为（例如，大型捕食者攻击猎物时会发出200赫兹的声音），而低频和高频波段都会被传递至中脑。后一条通道可能参与顶盖视觉反应的调节，因为已有研究显示，向斑马鱼幼体同时呈现视觉和听觉刺激，会降低其视顶盖的视觉反应。尾部运动主要由低频声音诱发，且半环形核内的听觉反应主要与γ-氨基丁酸能神经元共定位，这一事实也为该假说提供了支持。

听阈曲线和调谐曲线在受精后7天至21天之间差异不大。不同发育阶段的听阈曲线和听觉阈值相对相似。在幼鱼的所有发育阶段也都观察到了4种频率调谐曲线类型。因此，我们认为斑马鱼幼鱼的低维编码在发育早期就已形成，并在此后保持稳定。不过，一个中频波段在受精后9天短暂出现，约在受精后21天消失。这个短暂出现的频率波段是否代表了一个相关的发育过程，这一点尚待确定。

同时监测神经元活动和尾部运动行为的能力，使我们得以研究其背后的过程幼虫后脑的感觉运动转换。我们采用线性回归方法，根据感觉运动比率对感兴趣区域（ROIs）进行分类，发现感觉运动表征存在拓扑和功能上的连续性，这表明存在一种渐进式的将感觉信息转化为运动模式。当刺激引发运动行为时，感觉信息向运动模式的这种持续渐进转化，以及听觉诱发钙瞬变持续时间的延长，表明感觉运动转化并非反映了一种门控机制（例如，通过独立的调节回路控制神经活动从感觉通路向运动通路的传递），而是体现了回路整合听觉诱发神经反应的能力。诱发尾部运动的潜伏期长且具有可变性，也为这一假设提供了支持。钙瞬变持续时间的这种延长，可能是通过循环连接驱动神经活动充分放大，从而达到激活运动通路所需的阈值。

这种机制可能有助于整合听觉信息，以获取有关检测到的刺激的可靠信息，从而产生相关的行为反应。

关于木芮生物ABOUT MURUIBIO

苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。